Summary
La microscopie time-lapse est un outil précieux pour étudier la méiose chez la levure bourgeonnante. Ce protocole décrit une méthode qui combine la synchronisation du cycle cellulaire, la microscopie accélérée et l’épuisement conditionnel d’une protéine cible pour démontrer comment étudier la fonction d’une protéine spécifique pendant la ségrégation chromosomique méiotique.
Abstract
La microscopie à fluorescence accélérée a révolutionné la compréhension des événements du cycle cellulaire méiotique en fournissant des données temporelles et spatiales qui ne sont souvent pas vues par imagerie des cellules fixes. La levure bourgeonnante s’est avérée être un organisme modèle important pour étudier la ségrégation des chromosomes méiotiques, car de nombreux gènes méiotiques sont hautement conservés. La microscopie accélérée de la méiose chez la levure bourgeonnante permet de surveiller différents mutants méiotiques pour montrer comment la mutation perturbe les processus méiotiques. Cependant, de nombreuses protéines fonctionnent à plusieurs points de la méiose. L’utilisation de mutants nuls méiotiques ou de perte de fonction peut donc perturber un processus précoce, bloquant ou perturbant le processus ultérieur et rendant difficile la détermination des phénotypes associés à chaque rôle individuel. Pour contourner ce défi, ce protocole décrit comment les protéines peuvent être épuisées conditionnellement du noyau à des stades spécifiques de la méiose tout en surveillant les événements méiotiques à l’aide de la microscopie accélérée. Plus précisément, ce protocole décrit comment les cellules sont synchronisées dans la prophase I, comment la technique d’ancrage est utilisée pour épuiser les protéines du noyau à des stades méiotiques spécifiques et comment l’imagerie accélérée est utilisée pour surveiller la ségrégation chromosomique méiotique. À titre d’exemple de l’utilité de la technique, la protéine kinétochore Ctf19 a été épuisée du noyau à différents moments de la méiose, et le nombre de masses de chromatine a été analysé à la fin de la méiose II. Dans l’ensemble, ce protocole peut être adapté pour épuiser différentes protéines nucléaires du noyau tout en surveillant les divisions méiotiques.
Introduction
La microcopie à fluorescence accélérée est un outil précieux pour étudier la dynamique de la ségrégation des chromosomes méiotiques chez la levure bourgeonnante 1,2. Les cellules de levure bourgeonnantes peuvent être induites à subir une méiose par la famine de nutriments clés3. Au cours de la méiose, les cellules subissent un cycle de ségrégation chromosomique suivi de deux divisions pour créer quatre produits méiotiques qui sont emballés dans des spores (Figure 1). Les cellules individuelles peuvent être visualisées à chaque étape de la méiose, ce qui génère des données spatiales et temporelles qui peuvent facilement être manquées par l’imagerie à cellules fixes. Ce protocole montre comment la combinaison de la microscopie à fluorescence time-lapse avec deux méthodes précédemment établies, le système NDT80 inductible (NDT80-in) et la technique d’ancrage, peut être utilisée pour étudier la fonction de protéines spécifiques à des stades méiotiques distincts.
Le système NDT80-in est un outil puissant de synchronisation du cycle cellulaire méiotique qui repose sur l’expression inductible du facteur de transcription de la méiose moyenne NDT80 4,5. L’expression de NDT80 est requise pour la sortie 6,7 de la prophaseI. Avec le système NDT80-in, NDT80 est sous le contrôle du promoteur GAL1-10 dans les cellules exprimant le facteur de transcription Gal4 fusionné à un récepteur d’œstrogènes (Gal4-ER)4,5. Parce que Gal4-ER ne pénètre dans le noyau que lorsqu’il est lié au β-estradiol, les cellules NDT80-in s’arrêtent dans la prophase I en l’absence de β-estradiol, ce qui permet la synchronisation des cellules dans la prophase I (Figure 1). β’ajout de -estradiol favorise la translocation du facteur de transcription Gal4-ER dans le noyau, où il lie GAL1-10 pour conduire l’expression de NDT80, conduisant à une entrée synchrone dans les divisions méiotiques. Bien que la microscopie accélérée puisse être réalisée sans synchronisation, l’avantage de l’utilisation de la synchronisation est la possibilité d’ajouter un inhibiteur ou un médicament alors que les cellules sont à un stade spécifique de la méiose.
La technique de l’ancrage est un système inductible par lequel une protéine peut être épuisée du noyau avec l’ajout de rapamycine8. Cette technique est idéale pour étudier les protéines nucléaires lors de la division cellulaire dans la levure bourgeonnante car les cellules de levure subissent une mitose fermée et une méiose, dans lesquelles l’enveloppe nucléaire ne se décompose pas. De plus, cette technique est très utile pour les protéines qui ont de multiples fonctions tout au long de la méiose. Contrairement aux délétions, aux allèles mutants ou aux allèles nuls méiotiques, l’élimination d’une protéine cible du noyau à un stade spécifique ne compromet pas l’activité de la protéine cible aux stades antérieurs, ce qui permet une interprétation plus précise des résultats. Le système d’ancrage utilise la navette des sous-unités ribosomales entre le noyau et le cytoplasme qui se produit lors de la maturation ribosomique8. Pour épuiser la protéine cible du noyau, la protéine cible est marquée avec le domaine de liaison à la rapamycine (FRB) FKBP12 dans une souche dans laquelle la sous-unité ribosomique Rpl13A est marquée avec FKBP12. Sans rapamycine, FRB et FKBP12 n’interagissent pas, et la protéine marquée FRB reste dans le noyau. Lors de l’ajout de rapamycine, la rapamycine forme un complexe stable avec FKBP12 et FRB, et le complexe est évacué du noyau en raison de l’interaction avec Rpl13A (Figure 1). Pour prévenir la mort cellulaire lors de l’ajout de rapamycine, les cellules hébergent la mutation tor1-1 du gène TOR1 . De plus, ces cellules contiennent fpr1Δ , un allèle nul de la protéine S. cerevisiae FKBP12, qui empêche Fpr1 endogène de supplanter Rpl13A-FKBP12 pour la liaison FRB et rapamycine. Les mutations de fond d’ancrage, tor1-1 et fpr1Δ, n’affectent pas les moments méiotiques ou la ségrégation chromosomique2.
Pour démontrer l’utilité de cette technique, la protéine kinétochore Ctf19 a été épuisée à différents moments de la méiose. Ctf19 est un composant de la kinétochore qui est dispensable en mitose mais nécessaire pour une ségrégation chromosomique appropriée dans la méiose 9,10,11,12,13. Dans la méiose, la kinétochore est éliminée dans la prophase I, et Ctf19 est importante pour le réassemblagede kinétochore 9,14. Pour ce protocole, les cellules avec le système NDT80-in ont été synchronisées, et la technique d’ancrage loin a été utilisée pour épuiser la protéine cible Ctf19 du noyau avant et après la libération de la prophase I, et après la ségrégation du chromosome I de la méiose (Figure 1). Ce protocole peut être adapté pour épuiser d’autres protéines d’intérêt à n’importe quel stade de la méiose et de la mitose.
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Protocol
1. Préparation du matériel nécessaire
- Préparer des réactifs pour la croissance et la sporulation des cellules de levure.
NOTE: Si les souches de levure bourgeonnantes sont ade2 - et trp1-, compléter tous les milieux aux étapes 1.1.1-1.1.3 avec une concentration finale de 0,01% d’adénine et 0,01% de tryptophane à partir de souches de 1%. Si les milieux sont stérilisés par autoclave, ajouter ces acides aminés seulement après que les réactifs ont été autoclavés et laissés refroidir à température ambiante.- Pour la croissance végétative, préparer 2x milieu synthétique complet + dextrose (2XSC) en dissolvant 6,7 g de base azotée de levure sans acides aminés, 2 g de mélange complet d’acides aminés et 20 g de dextrose dans 500 mL d’eau. Stériliser le mélange par autoclavage pendant 20 min à 121 °C ou filtration à travers un filtre de 0,2 μm.
- Pour la première étape de la sporulation, préparer 2x milieu synthétique complet + acétate (2XSCA) en dissolvant 6,7 g d’azote base de levure sans acides aminés, 2 g de mélange complet d’acides aminés et 20 g d’acétate de potassium dans 500 mL d’eau. Stériliser le mélange par autoclavage pendant 20 min à 121 °C ou filtration à travers un filtre de 0,2 μm.
- Pour la dernière étape de la sporulation, préparer 1 % d’acétate de potassium (1 % de KAc) en dissolvant 5 g de KAc dans 500 mL d’eau. Stériliser le mélange par autoclavage pendant 20 min à 121 °C ou filtration à travers un filtre de 0,2 μm.
- Préparer les médicaments et les réactifs pour la microscopie, la synchronisation et l’ancrage.
- Pour les cellules adhérentes à la lamelle de couverture pendant l’imagerie accélérée, faites 1 mg / mL de concanavaline A (ConA) dans 1x PBS. Stériliser le filtre à l’aide d’un filtre de 0,2 μm et conserver les petites aliquotes (~10 μL) à -20 °C.
- Pour utiliser le système NDT80-in, faire 2 mL de 1 mM β-estradiol dissous dans de l’éthanol. Filtrer stériliser à l’aide d’un filtre de 0,2 μm et conserver les aliquotes (~500 μL) à -20 °C.
- Pour le système d’ancrage, faire dissoudre 1 mg/mL de rapamycine dans du DMSO. Stériliser le filtre à l’aide d’un filtre de 0,2 μm et conserver les petites aliquotes (~10 μL) à -20 °C.
REMARQUE : Préparer de petites aliquotes de rapamycine pour éviter plusieurs cycles de congélation-décongélation du médicament.
- Générer des souches de levure contenant le système NDT80-in (P GAL1,10-NDT80/PGAL1,10-NDT80; GAL4-ER/GAL4-ER) et une protéine cible marquée avec du FRB dans le fond génétique d’ancrage (tor1-1/tor1-1; fpr1Δ/ fpr1Δ; Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)4,8. Ctf19-FRB a été utilisé pour cette étude. De plus, une copie de la protéine hitone Htb2 a été marquée avec mCherry pour permettre la surveillance de la progression méiotique et de la ségrégation de la chromatine.
- Préparer une chambre pour l’imagerie accélérée
- Commencez à préparer la chambre 6 h à 24 h avant l’imagerie (Figure 2). Découpez une chambre de 18 mm x 18 mm de l’insert de la boîte d’embout de la pipette à l’aide d’un scalpel chauffant ou d’une autre lame tranchante.
- Utilisez un embout de pipette en plastique pour étaler une fine couche de mastic silicone autour des bords inférieurs de la chambre qui adhérera à la lamelle de couverture. Ajouter suffisamment de scellant pour que les bords de la chambre soient complètement recouverts (voir Figure 2).
- Collez la chambre à une lamelle de couverture de 24 mm x 50 mm en plaçant doucement la chambre, côté scellant vers le bas, sur la lamelle de couverture. Assurez-vous qu’il n’y a pas de trous dans le scellant afin que la chambre ne fuie pas.
- Étaler 8-10 μL de ConA sur la lame. Distribuer ConA au milieu de la lamelle de couverture et utiliser une pointe de pipette pour étaler le ConA en une fine couche de sorte qu’il recouvre la majeure partie de la lamelle de couverture entourée par la chambre.
REMARQUE: Les chambres en plastique peuvent être réutilisées indéfiniment. Une fois l’imagerie accélérée terminée, retirez la chambre de la lamelle de couverture à l’aide d’un rasoir, nettoyez le mastic silicone de la chambre et maintenez les chambres immergées dans de l’éthanol à 95% pour une utilisation future.
2. Sporulation des cellules de levure
- Effectuez les étapes suivantes pour la famine des cellules de levure afin d’induire le programme méiotique.
NOTE: Ces étapes sont pour la sporulation de la souche de levure W303. D’autres souches peuvent nécessiter des protocoles différents15. L’efficacité de la sporulation est très variable entre les souches de laboratoire, W303 présentant une efficacité de sporulation de ~60%16,17,18.- Prélever une seule colonie de la souche de levure diploïde appropriée dans une plaque et inoculer 2 ml de 2XSC et laisser pousser à 30 °C sur un tambour à rouleaux pendant 12-24 h jusqu’à saturation.
- Diluer la culture saturée dans 2XSCA en ajoutant 80 μL de la culture de l’étape 2.1.1 à 2 mL de 2XSCA. Laisser pousser à 30 °C sur un tambour à rouleaux pendant 12-16 h. Ne pas laisser dans 2XSCA pendant plus de 16 heures car les cellules peuvent devenir malades ou auto-fluorescentes.
- Effectuer deux lavages en faisant tourner la culture à 800 x g à température ambiante (25 °C) pendant 1 min, en jetant le liquide et en remettant en suspension la pastille dans 2 mL d’eau distillée stérile.
- Après le deuxième lavage, retirer le liquide et remettre en suspension la pastille dans 2 mL de KAc à 1% et laisser pousser à 25 °C sur un tambour à rouleaux pendant 8-12 h. Les cellules qui sont entrées dans la méiose vont s’arrêter dans le pachytène de la prophase I.
- Système de libération Prophase I
- Ajouter β-estradiol directement à la culture de sporulation jusqu’à une concentration finale de 1 μM et faire tourbillonner rapidement le tube de culture. Le β-estradiol libère des cellules de la prophase I.
3. Épuisement de la protéine cible du noyau à l’aide de la technique de l’ancrage loin
- Ajouter de la rapamycine aux cellules pour épuiser la protéine marquée FRB du noyau à un stade particulier.
- Pour épuiser les protéines du noyau à la sortie de la prophase I, ajouter de la rapamycine à une concentration finale de 1 μg/mL dans le tube de culture de sporulation en même temps que l’ajout de β-estradiol.
- Pour épuiser les protéines du noyau à un stade particulier de la méiose, surveillez le stade du cycle cellulaire à partir de 60 minutes après l’ajout de β-estradiol. Toutes les 20 minutes, pipeter 5 μL de culture sur une lamelle de couverture de 24 mm x 40 mm et recouvrir les cellules d’une lamelle de couverture de 18 mm x 18 mm. Maintenir les cultures en rotation sur le tambour à rouleaux à 25 °C entre les points temporels.
- Imagez les cellules à l’aide du filtre A594/mCherry et de l’objectif 60x d’un microscope à fluorescence. Réglez le pourcentage de transmittance à 2 % et le temps d’exposition à 250 ms. La présence d’une, deux ou quatre masses d’ADN indiquera le stade méiotique auquel les cellules ont progressé. Ajouter la rapamycine à une concentration finale de 1 μg/mL au stade méiotique d’intérêt.
- Gardez les cellules en rotation sur le tambour à rouleaux à 25 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’imagerie. L’épuisement nucléaire d’une protéine cible se produit 30-45 min après l’addition de rapamycine 2,8.
4. Microscopie à fluorescence accélérée
- Fabriquez un tampon de gélose qui sera utilisé pour créer une monocouche de cellules pour l’imagerie (voir étape 4.2).
- Couper et jeter le bouchon et le 1/3 inférieur d’un tube à microfuge de 1,5 mL pour créer un cylindre. Le cylindre servira de moule pour le tampon de gélose. Faites deux cylindres pour avoir un extra au cas où la gélose ne polymérise pas correctement dans le premier.
- Placez le cylindre du tube microfuge coupé sur une lame de verre propre avec le haut du tube à l’envers assis sur la glissière.
- Préparer 6 mL d’une solution de gélose à 5 % (utiliser 1 % de KAc comme solvant) dans un bécher de 50 mL et la mettre au micro-ondes jusqu’à ce que la gélose soit complètement dissoute.
REMARQUE: La gélose va facilement bouillir au micro-ondes; Observez la gélose et démarrez et arrêtez le micro-ondes lorsque l’agar commence à bouillir et à faire tourbillonner le bécher. Démarrez et arrêtez le micro-ondes plusieurs fois pour dissoudre complètement l’agar-agar. La solution de gélose est faite au-delà de la quantité nécessaire pour assurer la dissolution complète de la gélose . - Coupez l’extrémité de la pipette pour faire une ouverture plus grande et pipet ~500 μL de gélose fondue dans chaque cylindre de tube de microfuge. Laisser reposer à température ambiante jusqu’à ce que la gélose se solidifie (~10-12 min).
- Préparation des cellules de levure pour l’imagerie
- Faire tourner 200 μL de la culture de sporulation de l’étape 3.2 à 800 x g pendant 2 min dans des tubes microcentrifugés de 1 mL. Retirer et jeter 180 μL du surnageant. Remettez en suspension la pastille dans le surnageant restant en remuant et en agitant le tube.
- Piper 6 μL des cellules concentrées sur la lamelle de recouvrement au milieu de la chambre réalisée à l’étape 1.4.
- Tenez le cylindre avec le tampon de gélose fabriqué à l’étape 4.1 et faites-le glisser délicatement hors de la lame de verre. Assurez-vous que la gélose est complètement plate au fond et, à l’aide du fond d’une pointe de pipette, appliquez une légère pression sur le moule de microfuge de sorte que le tampon de gélose soit poussé légèrement au-dessus de la limite du tube.
- Inversez le moule de telle sorte que le tampon de gélose soit orienté vers le bas vers la chambre.
- À l’aide d’une pince, placez délicatement le tampon de gélose (toujours dans le moule du tube à microfuge) sur le dessus des cellules. Utilisez une pointe de pipette pour faire glisser doucement le tampon de gélose autour de la chambre 10 à 20 fois afin de créer une monocouche de cellules sur la lame.
- Laissez le tampon de gélose dans la chambre pendant 12-15 min. Cette étape permettra aux cellules d’adhérer au ConA sur le bordereau de couverture.
- Transférer 2 mL de culture de sporulation de l’étape 3.2 à deux tubes microcentrifuges et faire tourner à 15 700 x g pendant 2 min. Transférer le surnageant dans des tubes à microfuge propres et tourner à nouveau à 15 700 x g pendant 2 min. Transférer le surnageant dans des tubes de microcentrifugation propres à utiliser à l’étape suivante.
NOTE: Il est important d’utiliser le surnageant KAc préconditionné avec le β-estradiol et la rapamycine pour assurer une sporulation efficace et un épuisement continu de la protéine d’intérêt. - Une fois que le tampon de gélose est resté dans la chambre pendant 12-15 min, flottez et retirez le tampon de gélose avant l’imagerie. Pour ce faire, ajouter 2 mL du surnageant de l’étape 4.2.7 goutte à goutte dans la chambre. Une fois que le liquide a atteint le sommet de la chambre, le tampon de gélose flottera très probablement.
REMARQUE: Si le tampon de gélose ne flotte pas automatiquement, attendez 1-2 min. Si le tampon de gélose ne flotte toujours pas, retirez-le doucement avec une pince. Idéalement, le tampon de gélose flotterait tout seul, car son retrait avant de flotter pourrait entraîner l’élimination des cellules. - Une fois que le tampon de gélose a flotté, retirez-le doucement avec une pince et jetez-le. Placez une glissière de 24 mm x 50 mm sur le dessus de la chambre pour éviter l’évaporation pendant l’imagerie.
- Mise en place d’un film au microscope
REMARQUE: Les instructions ci-dessous concernent un microscope inversé équipé d’un support de lame pouvant accueillir la lamelle de couverture de 24 mm x 50 mm (voir le tableau des matériaux pour les détails du microscope, de la caméra et du logiciel). Un objectif d’immersion dans l’huile 60x est utilisé pour l’acquisition d’images. Ce protocole peut devoir être modifié lors de l’utilisation d’autres microscopes ou d’autres supports de lames. Les étapes exactes d’exécution des étapes 4.3.2 à 4.3.16 varient en fonction du microscope et du logiciel d’imagerie utilisés. Voir rubrique 4.4 pour les instructions pour un microscope différent.- Insérez le bordereau de couverture à l’intérieur du support de glissière. Collez l’argile à mouler sur le côté de la lamelle de couverture pour la maintenir en sécurité dans le support de glissière.
- Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images. Utilisez des boutons de parcours et de réglage fin pour focaliser les cellules à l’aide de DIC ou de fond clair.
- Dans le menu principal du logiciel d’acquisition d’images, cliquez sur Fichier > Acquérir (Résoudre 3D). Trois fenêtres apparaîtront.
- Dans la fenêtre Resolve 3D, cliquez sur l’icône Erlenmeyer Flask . Cela ouvrira une fenêtre intitulée Design/Run Experiment, qui contient les contrôles permettant de configurer une expérience pour configurer un film time-lapse.
- Sous l’onglet Conception , accédez à l’onglet intitulé Sectionnement. Cochez la case en regard de Découpage Z. Définissez les piles z comme suit : espacement des sections optiques = 1 μm, Nombre de sections optiques = 5, Épaisseur de l’échantillon = 5,0 μm.
- Sous l’onglet Canaux , cliquez sur l’icône + de sorte qu’une option de canal apparaisse. Sélectionnez le canal approprié. Pour cette expérience, nous sélectionnons A594, qui est utilisé pour imager mCherry. Cochez la case en regard de Image de référence et définissez la position Z au milieu de l’échantillon dans le menu déroulant.
- Sélectionnez une valeur dans le menu déroulant en regard de %T et Exp. pour définir respectivement le pourcentage de transmittance et le temps d’exposition. Pour cette expérience, un temps de transmission de 2% et un temps d’exposition de 250 ms sont utilisés dans le canal A594, et un temps d’exposition de 10% et 500 ms sont utilisés pour le fond clair.
REMARQUE: Le temps d’exposition et le pourcentage de transmittance varient selon les microscopes. Pour éviter la surexposition, utilisez le pourcentage de transmission le plus faible et le temps d’exposition le plus court possible, ce qui permet une visualisation adéquate de la protéine d’intérêt. - Sous l’onglet Time-lapse, cochez la case en regard de Time-lapse. Dans le tableau qui s’affiche, entrez 10 sous la colonne min dans la ligne time-lapse et 10 sous la colonne hours dans la ligne de temps total. Cela fonctionnera un parcours temporel prenant des images toutes les 10 minutes pendant 10 h.
- Cochez la case en regard de Maintenir la mise au point avec la mise au point ultime pour éviter la dérive de la scène pendant le film. Sous l’onglet Points , cochez la case en regard de Liste des points de visite.
- Dans le menu principal, cliquez sur Afficher > liste de points. Une fenêtre appelée liste de points apparaîtra. Déplacez la scène vers une zone de la chambre qui montre une monocouche de cellules. Cliquez sur Point Mark dans la fenêtre de la liste des points.
- Déplacez la scène pour sélectionner 25 à 30 points sans aucun chevauchement pour éviter de surexposer les cellules. Chaque champ sera imagé pendant chaque cours.
- Dans la fenêtre de la liste des points, sélectionnez Calibrer tout pour définir la mise au point ultime pour chaque point. Sous l’onglet Conception de la fenêtre Desgin/Run Experiment , entrez la plage de valeurs de points (obtenue à partir de la fenêtre de la liste de points) dans la zone en regard de Visit Point List. Sous l’onglet Exécuter , enregistrez le fichier à la destination appropriée sur l’ordinateur. Dans la fenêtre Conception/Exécution de l’expérience , sélectionnez le bouton Lecture (icône triangulaire verte) pour démarrer le film.
- Méthode facultative : Configuration d’un film au microscope
REMARQUE: Ces instructions sont pour un microscope inversé équipé d’un support de lame pouvant accueillir une lamelle de couverture de 24 mm x 50 mm. Voir le tableau des matériaux pour les spécifications relatives au microscope, à la caméra et au logiciel d’imagerie utilisés. Un objectif d’immersion dans l’huile 60x est utilisé pour l’acquisition d’images.- Insérez le bordereau de couverture à l’intérieur du support de glissière. Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images. Utilisez des boutons de parcours et de réglage fin pour faire la mise au point des cellules à l’aide de DIC ou de fond clair. Faites un clic droit dans la fenêtre ouverte du logiciel. Un menu déroulant apparaîtra.
- Cliquez sur Contrôles d’acquisition > Acquisition. Cliquez sur Application > Définir/Exécuter l’expérience. Cela ouvrira une fenêtre intitulée Acquisition ND.
- Dans la fenêtre qui s’ouvre, cochez la case à côté de XY. Déplacez la scène vers l’emplacement souhaité et cliquez sur la case sous Nom du point pour sélectionner cet emplacement comme point. Répétez cette opération jusqu’à ce que 25 à 30 points soient sélectionnés sans aucun chevauchement pour éviter de surexposer les cellules. Chaque champ sera imagé pendant chaque cours.
- Définir le pourcentage de transmittance pour chaque canal fluorescent. Parce que les souches produisent Htb2-mCherry, le filtre mCherry est utilisé ici. Sous la fenêtre Acquisition qui s’est ouverte à l’étape 4.3.3, accédez au bouton 555 nm. Réglez le pourcentage de transmittance sur 5 % en ajustant l’échelle mobile sous le bouton 555 nm jusqu’à ce qu’elle indique 5 %.
- Réglez le temps d’exposition pour chaque canal fluorescent. Sous la fenêtre Acquisition , sélectionnez 200 ms dans le menu déroulant Exposition.
REMARQUE: Le temps d’exposition et le pourcentage de transmittance varient selon les microscopes. Pour éviter la surexposition, utilisez le pourcentage de transmission le plus faible et le temps d’exposition le plus court possible, ce qui permet une visualisation adéquate de la protéine d’intérêt. - Cliquez sur la case à côté de Z dans la fenêtre ND Acquisition . Placez cinq piles z de cellules de levure espacées de 1,2 μM.
- Cliquez sur la case à côté de λ. Sélectionnez les canaux appropriés à utiliser pour l’expérience. Pour DIC, assurez-vous que Home est sélectionné dans le menu déroulant sous Z pos. Pour mCherry, assurez-vous que Tout est sélectionné dans le menu déroulant sous Z pos. Cela garantit qu’une seule section (au milieu de la pile z) est prise pour DIC.
- Cochez la case en regard de Heure dans la fenêtre ND Acquisition . Cochez la case sous Phase. Dans le menu déroulant sous Intervalle, sélectionnez 10 min. Sous Durée, sélectionnez 10 heure(s). Cela fonctionnera de manière à ce que les images soient prises toutes les 10 minutes pendant 10 h.
5. Analyse de la ségrégation chromatique
- Ouvrez le logiciel Fiji. Ouvrez un champ de vision à la fois : pour chaque champ, ouvrez les canaux DIC et mCherry.
- Prenez la projection d’intensité maximale du canal mCherry pour obtenir une seule image : cliquez sur Image > Stacks > Z Project, sélectionnez Max Intensity dans le menu déroulant.
- Fusionnez les canaux DIC et mCherry en une seule image : cliquez sur Image > Color > Merge Channels (Couleur de l’image) Merge Channels (Fusionner les canaux).
- Suivez une seule cellule à travers la méiose. Après l’achèvement de la méiose II, notez le nombre de masses d’ADN.
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Representative Results
Pour surveiller la ségrégation de la chromatine, la protéine histones Htb2 a été marquée avec mCherry. Dans la prophase I, la chromatine apparaît comme une masse unique de Htb2. Après la ségrégation des chromosomes homologues dans la première division méiotique, la chromatine apparaît comme deux masses distinctes (Figure 3A). Après la ségrégation des chromatides sœurs, la chromatine apparaît sous la forme de quatre masses. Si certains chromosomes ne parviennent pas à se fixer aux microtubules fusiformes, des masses supplémentaires peuvent être observées après la méiose I ou la méiose II.
La méthode décrite ci-dessus a été utilisée pour étudier le rôle du composant kinétochore Ctf19 pour assurer une ségrégation chromosomique appropriée dans la méiose de levure bourgeonnante. Les souches de levure exprimant Ctf19 marquées avec FRB ont été synchronisées dans la prophase I à l’aide du système NDT80-in (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; CTF19-FRB; GAL1-10 promu NDT80; GAL4-ER). Comme témoin, une souche NDT80-in avec le fond de la souche d’ancrage éloignée mais sans la protéine marquée FRB a été utilisée (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; GAL1-10 promu NDT80; GAL4-ER). Les cellules ont été libérées de l’arrêt de la prophase I par l’ajout de β-estradiol. La rapamycine a été ajoutée pour épuiser le Ctf19-FRB du noyau soit à la libération (avant le réassemblage du kinétochore ), 45 min après la libération (après le réassemblage de kinétochores mais avant la méiose I), soit 3 h après la libération (juste avant la méiose II) (Figure 3A-F). Après l’ajout de rapamycine, une microscopie à fluorescence accélérée a été réalisée et des images ont été acquises toutes les 10 minutes pour la durée restante de la méiose.
Après l’imagerie, le logiciel en libre accès Fiji a été utilisé pour ouvrir les images et effectuer une analyse des figures montrant la progression dans le temps (Figure 3A-F). Le nombre de masses d’ADN après la méiose II a été compté dans au moins 100 cellules qui subissaient une méiose par condition. Dans les cellules de type sauvage avec l’ancrage éloigné, il y a généralement quatre masses d’ADN à la fin de la méiose II, représentant les quatre produits de la méiose (Figure 3A). Dans une petite fraction des cellules, seules trois masses sont visibles après la méiose II (Figure 3B,G). Cependant, il est probable que trois masses sont le résultat d’une cellule qui a quatre produits de la méiose, mais deux de ces masses apparaissent ensemble après la méiose II.
Lorsque Ctf19-FRB est ancré au moment de la libération de la sortie de la prophase I (t = 0 h), environ 47% des cellules présentent plus de quatre masses d’ADN à la fin de la méiose, suggérant un défaut de fixation des kinétochores et des microtubules (Figure 3C,G). Avec l’ancrage loin de Ctf19-FRB soit après l’assemblage de kinétochore mais avant la méiose I (t = 45 min) ou avant la méiose II (t = 3 h), environ 16% des cellules présentent des masses d’ADN supplémentaires. Ces résultats soutiennent l’hypothèse selon laquelle Ctf19 est important pour le réassemblage des kinétochores à la libération de la prophase I, mais est moins important dans la ségrégation chromosomique une fois que le kinétochore a été réassemblé.
Les résultats obtenus ici montrent que la microscopie time-lapse combinée à la synchronisation du cycle cellulaire et à l’épuisement conditionnel d’une protéine cible permet l’étude d’une protéine à un stade méiotique spécifique. Bien que Ctf19 ne soit pas essentiel pour la mitose, la kinétochore méiotique est largement réorganisée, et Ctf19 joue un rôle crucial dans le réassemblage des kinétochores après la sortie 9,11,12 de la prophase I. Les résultats de la figure 3 montrent que lorsque la Ctf19 est épuisée avant le réassemblage de kinétochore , une grande fraction des cellules affiche des masses d’ADN supplémentaires après la méiose II. Lorsque Ctf19 est épuisé du noyau après le réassemblage de kinétochore mais avant la méiose I ou la méiose II, il y a moins de cellules qui affichent des masses d’ADN supplémentaires. Ces résultats suggèrent que le rôle le plus important de la Ctf19 se situe à la fin de la prophase I. Cette différence dans la fidélité de la ségrégation chromosomique avec l’épuisement de Ctf19 à différents stades souligne l’importance d’utiliser des allèles conditionnels spécifiques au stade pour étudier la fonction des protéines spécifiquement dans la méiose I ou la méiose II. Un mutant nul méiotique aurait présenté un défaut grave et n’aurait pas fourni d’informations sur le rôle de Ctf19 à chaque étape.
De plus, bien que le CTF19 ne soit pas un gène essentiel, il existe un phénotype de fidélité à la transmission chromosomique (CTF) au cours de la croissance végétative des mutants CTF19 19. L’utilisation d’un allèle nul ou mutant CTF19 pourrait créer une population de cellules aneuploïdes qui pourraient ne pas subir correctement la méiose. L’utilisation de la technique d’ancrage et du système de synchronisation NDT80-in contourne ce problème en épuisant précisément Ctf19 du noyau juste avant la méiose I ou la méiose II, réduisant ainsi la crainte que les cellules analysées soient aneuploïdes.
Figure 1 : Vue d’ensemble de l’expérience. Caricature de cellule de levure montrant une seule paire de chromosomes homologues. Les cellules NDT80-in entrent dans la méiose et s’arrêtent à la prophase I. Après ajout de β-estradiol, les cellules pénètrent dans les divisions méiotiques de manière synchrone. L’ajout de rapamycine détermine quand la protéine cible (marquée d’une étoile) est ancrée. Dans cette expérience, la protéine cible Ctf19 a été ancrée à trois moments différents en ajoutant de la rapamycine (RAP) en même temps que la prophase I (addition de RAP à t = 0 min), après libération de la prophase I (addition de RAP à t = 45 min) et après la ségrégation du chromosome I de la méiose (addition de RAP à t = 3 h). Les flèches noires épaisses indiquent le stade du cycle cellulaire de l’ajout de rapamycine et, par conséquent, ciblent l’épuisement des protéines. Abréviations : RAP = rapamycine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Installation de la chambre pour les expériences d’imagerie accélérée. (A) Chambre réutilisable (à droite) découpée dans un insert de support de pipette (à gauche). L’insert de l’embout de la pipette est coupé avec une lame chauffée au rouge pour retirer une partie de 4 carrés x 4 carrés de l’insert. Les lignes pointillées indiquent une section d’échantillon du porte-pointe qui peut être coupée pour faire une chambre. Les séparateurs en plastique restants dans la découpe de 4 carrés x 4 carrés sont coupés et une chambre creuse reste (à droite). (B) Pour créer la chambre finale, du mastic silicone est ajouté aux bords d’un côté de la chambre, puis placé sur un couvercle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Le moment auquel Ctf19 est ancré affecte la ségrégation de la chromatine. (A-F) Images accélérées représentatives de cellules exprimant Htb2-mCherry pendant la méiose. Les images ont été prises toutes les 10 minutes, immédiatement après l’ajout de β-estradiol. Barres d’échelle = 5 μm. Les nombres dans le coin supérieur droit de chaque image indiquent le temps qui s’est écoulé entre chaque image, et le temps 0 indique le cadre dans lequel la chromatine se sépare dans la méiose I. Seules les cellules qui ont complété les divisions méiotiques ont été comptées. (A) Cellule de type sauvage (aucune protéine marquée avec FRB) dans laquelle du β-estradiol a été ajouté 12 h après le transfert de KAc. La cellule contient quatre masses d’ADN après l’achèvement de la méiose II. (B) Cellule Ctf19-FRB dans laquelle la rapamycine a été ajoutée à t = 0 (simultanément avec l’ajout de β-estradiol). Cette cellule montre trois masses d’ADN après la méiose II. (C) Cellule Ctf19-FRB dans laquelle la rapamycine a été ajoutée à t = 0 (simultanément avec l’ajout de β-estradiol). Cette cellule montre cinq masses d’ADN après la méiose II. (D) Cellule Ctf19-FRB dans laquelle la rapamycine a été ajoutée à t = 0 (simultanément avec l’ajout de β-estradiol). Cette cellule meurt après avoir terminé la méiose II. (E) Cellule Ctf19-FRB dans laquelle la rapamycine a été ajoutée 45 minutes après l’ajout de β-estradiol. Cette cellule montre cinq masses d’ADN après la méiose II. (F) Cellule Ctf19-FRB dans laquelle la rapamycine a été ajoutée 45 minutes après l’ajout de β-estradiol. Après la méiose II, six masses d’ADN sont présentes. (G) Quantification du nombre de masses d’ADN dans au moins 100 cellules pour chaque condition (deux films analysés pour chaque condition). t = sous chaque barre indique le moment auquel la rapamycine a été ajoutée par rapport à l’ajout de β-estradiol. Abréviations : MII = méiose II. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole combine le système NDT80-in pour synchroniser les cellules, la technique d’ancrage pour épuiser les protéines du noyau et la microscopie accélérée à fluorescence pour imager les cellules de levure bourgeonnantes pendant la méiose. Le système NDT80-in est une méthode de synchronisation du cycle cellulaire méiotique qui utilise un arrêt et une libération 4,8 de la prophaseI. Bien que le temps passé dans chacune des étapes méiotiques suivantes varie légèrement, la plupart des cellules maintiendront un degré élevé de synchronie tout au long des divisions méiotiques.
La technique du point d’ancrage est un outil adaptable pour les études mitotiques et méiotiques. En modifiant la protéine cible d’ancrage et le moment de l’ajout de rapamycine, cette méthode peut être adaptée pour étudier diverses protéines à n’importe quel stade de la méiose de levure bourgeonnante. Les méthodes courantes de fabrication de mutants conditionnels pour étudier la mitose à levures bourgeonnantes ne conviennent pas toujours aux études méiotiques. Par exemple, l’utilisation d’un promoteur répressible nécessite souvent un changement de source de carbone pour modifier l’expression de la protéine cible, ce qui peut perturber la méiose20. Les mutants sensibles à la température s’appuient sur un changement de température pour réduire ou abolir l’activité de la protéine cible. Beaucoup de ces mutants conditionnels ne peuvent pas être utilisés dans les études méiotiques parce que les conditions nutritionnelles changeantes ou la température peuvent perturber la méiose21,22,23. De plus, les délétions ou les mutants peuvent limiter les études de la méiose, car l’expression d’une protéine mutante au début de la méiose peut bloquer ou nuire aux stades ultérieurs. La technique de l’ancrage peut contourner ces défis car elle ne repose pas sur les changements de nutrition ou de température8. De plus, l’épuisement de la protéine peut être régulé temporellement de sorte que le moment de l’ajout de rapamycine détermine quand la protéine sera ancrée.
L’une des limites de la technique de l’ancrage est qu’elle peut ne pas convenir aux protéines non nucléaires car elle repose sur la sous-unité ribosomique Rpl13A comme ancrage pour transporter la protéine cible hors du noyau. Cependant, il existe d’autres applications de la technique d’ancrage loin en modifiant les interactions protéine-protéine qui peuvent également être utiles pendant la méiose, telles que l’ancrage des protéines à des complexes ou leur attache à des membranes8. Des études antérieures montrent que l’épuisement nucléaire des protéines cibles se produit dans les 30 minutes suivant l’ajout de rapamycine 2,8. Cependant, il est possible que certaines protéines aient besoin d’une période plus ou moins longue pour être évacuées du noyau. Pour s’assurer que la protéine cible est évacuée du noyau, la protéine cible peut être marquée avec du FRB fusionné au GFP (FRB-GFP) pour surveiller le temps entre l’ajout de rapamycine et l’épuisement nucléaire. Une autre limitation du système d’ancrage éloigné est que certaines protéines sont sensibles aux marqueurs FRB et FRB-GFP à l’extrémité C. En tant que tel, le marquage N-terminal de la protéine cible avec FRB est une stratégie alternative pour ancrer une protéine cible.
Pour surveiller la ségrégation de la chromatine, les cellules de levure bourgeonnantes ont exprimé Htb2-mCherry. Dans cette souche, la protéine Htb2 est marquée à son locus endogène, ce qui garantit que Htb2 est exprimé normalement. D’autres protéines marquées par fluorescence pourraient également être utilisées pour surveiller différents aspects de la méiose. Lors de la construction d’une souche pour l’imagerie accélérée, il est important de considérer que certaines protéines sont sensibles aux marqueurs fluorescents C-terminal. Les tests de croissance et de sporulation de la souche hébergeant la protéine marquée par fluorescence garantissent que le marqueur n’altère pas la fonction de la protéine. L’un des défis de la microscopie à fluorescence accélérée est d’exposer les cellules à une fluorescence suffisante pour que les protéines fluorescentes soient détectées tout en évitant la mort cellulaire ou le ralentissement de la méiose due à une exposition excessive. Une étape de dépannage importante consiste à trouver les paramètres de microscope et de caméra appropriés pour atteindre cet équilibre. Le temps d’exposition requis varie légèrement d’une protéine à l’autre, de sorte que plusieurs itérations d’une expérience doivent être effectuées pour déterminer le temps d’exposition approprié. Lors de l’utilisation de la méthode de chambre décrite ici pour les expériences d’imagerie accélérée, une étape particulièrement sensible consiste à obtenir une monocouche de cellules à imager. Sans monocouche, les cellules s’accumulent les unes sur les autres, ce qui représente un défi pour une imagerie et une analyse des données appropriées. L’utilisation d’un tampon d’agar, qui aide les cellules à adhérer à la ConA et à répandre les cellules autour de la chambre, est un moyen peu coûteux et efficace d’obtenir des monocouches. Déplacer le tampon de gélose pour répartir les cellules autour de la chambre de manière à obtenir une monocouche peut être difficile. S’assurer que le tampon de gélose fait de très petits mouvements pendant le processus de déplacement peut aider à créer une monocouche. La fabrication d’une chambre réutilisable permet la génération peu coûteuse de données d’imagerie time-lapse. Avec un nettoyage et une désinfection appropriés, les chambres en plastique décrites ici peuvent être réutilisées indéfiniment. Il est recommandé de retirer les chambres de la lamelle de couverture immédiatement après l’imagerie accélérée et de les stocker dans de l’éthanol à 95 % jusqu’à la prochaine utilisation.
L’imagerie accélérée fournit des informations sur le cycle cellulaire qui peuvent être manquées par l’imagerie des cellules fixes 1,2. Par exemple, lors de la surveillance de la durée des stades méiotiques, les variations entre les cellules individuelles peuvent être examinées plus précisément lors de l’imagerie des cellules vivantes par rapport aux populations de cellules fixes. Étant donné que les protéines de levure peuvent être facilement marquées avec des protéines fluorescentes, le couplage de l’imagerie accélérée par fluorescence avec le système NDT80-in et la technique d’ancrage peut être adapté pour des études supplémentaires, telles que la surveillance de la ségrégation chromosomique individuelle et le calendrier de stades méiotiques spécifiques. Lors de la surveillance de la progression du cycle cellulaire après la libération de la prophase I dans les cellules NDT80, il est crucial d’avoir une protéine marquée avec une molécule fluorescente qui marquera les étapes de la méiose. Les chromosomes individuels peuvent être surveillés tout au long de la méiose en intégrant des répétitions de l’opéron lac (LacO) près du centromère d’un chromosome dans les cellules exprimant LacI-GFP. LacI-GFP se lie étroitement au LacO et est visualisé comme un foyer lumineux, qui peut être suivi dans les divisions méiotiques par microscopietime-lapse 24,25. Diverses protéines avec des marqueurs fluorescents ont été utilisées pour surveiller la durée des stades méiotiques. Il s’agit notamment de Tub1, la sous-unité de α-tubuline qui s’incorpore dans les microtubules; Zip1, un composant du complexe synaptonémique; et Spc42, un composant de corpsde mât de broche 1,2,26,27.
En conclusion, cette méthode intègre la synchronisation du cycle cellulaire méiotique, l’épuisement conditionnel d’une protéine cible et la microscopie à fluorescence accélérée pour étudier la ségrégation chromosomique méiotique. En imageant les cellules de levure bourgeonnantes pendant la méiose et en utilisant des mutants conditionnels qui n’affectent que les stades prévus de la méiose, cette méthode peut fournir des données précises sur le cycle cellulaire méiotique.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Nous remercions le Light Microscopy Imaging Center de l’Université de l’Indiana. Ce travail a été soutenu par une subvention des National Institutes of Health (GM105755).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
References
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