Summary
Die Zeitraffer-Mikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Meiose in knospender Hefe. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die Zellzyklus-Synchronisation, Zeitraffer-Mikroskopie und bedingte Depletion eines Zielproteins kombiniert, um zu zeigen, wie die Funktion eines bestimmten Proteins während der meiotischen Chromosomentrennung untersucht werden kann.
Abstract
Die Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie hat das Verständnis von meiotischen Zellzyklusereignissen revolutioniert, indem sie zeitliche und räumliche Daten liefert, die von der Bildgebung fixierter Zellen oft nicht gesehen werden. Knospende Hefe hat sich als wichtiger Modellorganismus für die Untersuchung der meiotischen Chromosomentrennung erwiesen, da viele meiotische Gene hoch konserviert sind. Die Zeitraffer-Mikroskopie der Meiose in knospender Hefe ermöglicht die Überwachung verschiedener meiotischer Mutanten, um zu zeigen, wie die Mutation meiotische Prozesse stört. Viele Proteine funktionieren jedoch an mehreren Stellen in der Meiose. Die Verwendung von Funktionsverlust- oder meiotischen Nullmutanten kann daher einen frühen Prozess stören, den späteren Prozess blockieren oder stören und es schwierig machen, die Phänotypen zu bestimmen, die mit jeder einzelnen Rolle verbunden sind. Um diese Herausforderung zu umgehen, beschreibt dieses Protokoll, wie die Proteine in bestimmten Stadien der Meiose bedingt aus dem Zellkern abgereichert werden können, während meiotische Ereignisse mit Zeitraffermikroskopie überwacht werden. Insbesondere beschreibt dieses Protokoll, wie die Zellen in Prophase I synchronisiert werden, wie die Ankerweg-Technik verwendet wird, um Proteine aus dem Zellkern in bestimmten meiotischen Stadien zu entleeren, und wie Zeitraffer-Bildgebung verwendet wird, um die meiotische Chromosomentrennung zu überwachen. Als Beispiel für die Nützlichkeit der Technik wurde das Kinetochor-Protein Ctf19 zu verschiedenen Zeitpunkten während der Meiose aus dem Zellkern abgereichert, und die Anzahl der Chromatinmassen wurde am Ende der Meiose II analysiert. Insgesamt kann dieses Protokoll angepasst werden, um verschiedene Kernproteine aus dem Zellkern abzubauen und gleichzeitig die meiotischen Teilungen zu überwachen.
Introduction
Die Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Dynamik der meiotischen Chromosomentrennung in knospender Hefe 1,2. Knospende Hefezellen können durch Aushungern wichtiger Nährstoffe zu Meiose gebracht werden3. Während der Meiose durchlaufen die Zellen eine Chromosomentrennung, gefolgt von zwei Teilungen, um vier meiotische Produkte zu erzeugen, die in Sporen verpackt sind (Abbildung 1). Einzelne Zellen können in jedem Stadium der Meiose visualisiert werden, wodurch räumliche und zeitliche Daten generiert werden, die von der Fixed-Cell-Bildgebung leicht übersehen werden können. Dieses Protokoll zeigt, wie die Kombination der Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie mit zwei zuvor etablierten Methoden, dem induzierbaren NDT80-System (NDT80-in) und der Ankerweg-Technik, verwendet werden kann, um die Funktion bestimmter Proteine in verschiedenen meiotischen Stadien zu untersuchen.
Das NDT80-in-System ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Synchronisation des meiotischen Zellzyklus, das auf der induzierbaren Expression des mittleren Meiose-Transkriptionsfaktors NDT80 4,5 beruht. Die NDT80-Expression ist für den Ausgang der ProphaseI 6,7 erforderlich. Mit dem NDT80-in-System steht NDT80 unter der Kontrolle des GAL1-10-Promotors in Zellen, die den Gal4-Transkriptionsfaktor exprimieren, der mit einem Östrogenrezeptor (Gal4-ER)4,5 fusioniert ist. Da Gal4-ER nur dann in den Zellkern gelangt, wenn es an β-Östradiol gebunden ist, werden NDT80-in-Zellen in Prophase I in Abwesenheit von β-Östradiol blockiert, was die Synchronisation von Zellen in Prophase I ermöglicht (Abbildung 1). β-Östradiol-Addition fördert die Translokation des Gal4-ER-Transkriptionsfaktors in den Zellkern, wo er GAL1-10 bindet, um die Expression von NDT80 zu steuern, was zu einem synchronen Eintritt in die meiotischen Divisionen führt. Obwohl die Zeitraffermikroskopie ohne Synchronisation durchgeführt werden kann, besteht der Vorteil der Synchronisation darin, dass ein Inhibitor oder ein Medikament hinzugefügt werden kann, während sich die Zellen in einem bestimmten Stadium der Meiose befinden.
Die Anker-weg-Technik ist ein induzierbares System, durch das ein Protein aus dem Zellkern unter Zugabe von Rapamycin8 abgereichert werden kann. Diese Technik ist ideal für die Untersuchung von Kernproteinen während der Zellteilung in knospender Hefe, da Hefezellen eine geschlossene Mitose und Meiose durchlaufen, bei der die Kernhülle nicht zusammenbricht. Darüber hinaus ist diese Technik sehr nützlich für Proteine, die während der gesamten Meiose mehrere Funktionen haben. Anders als bei Deletionen, mutierten Allelen oder meiotischen Null-Allelen beeinträchtigt die Entfernung eines Zielproteins aus dem Zellkern in einem bestimmten Stadium nicht die Aktivität des Zielproteins in früheren Stadien, was eine genauere Interpretation der Ergebnisse ermöglicht. Das Ankerwegsystem nutzt das Pendeln von ribosomalen Untereinheiten zwischen dem Kern und dem Zytoplasma, das bei der ribosomalen Reifungauftritt 8. Um das Zielprotein aus dem Zellkern zu entfernen, wird das Zielprotein mit der FKBP12-Rapamycin-bindenden Domäne (FRB) in einem Stamm markiert, in dem die ribosomale Untereinheit Rpl13A mit FKBP12 markiert ist. Ohne Rapamycin interagieren FRB und FKBP12 nicht, und das FRB-markierte Protein verbleibt im Zellkern. Bei zusätzlicher Gabe von Rapamycin bildet das Rapamycin einen stabilen Komplex mit FKBP12 und FRB, der aufgrund der Wechselwirkung mit Rpl13A aus dem Zellkern geschleudert wird (Abbildung 1). Um den Zelltod durch Rapamycin zusätzlich zu verhindern, beherbergen Zellen die tor1-1-Mutation des TOR1-Gens . Zusätzlich enthalten diese Zellen fpr1Δ , ein Null-Allel des S. cerevisiae FKBP12-Proteins, das verhindert, dass endogenes Fpr1 Rpl13A-FKBP12 für FRB- und Rapamycin-Bindung übertrifft. Die Anker-Hintergrundmutationen, tor1-1 und fpr1Δ, haben keinen Einfluss auf meiotische Timings oder Chromosomentrennung2.
Um die Nützlichkeit dieser Technik zu demonstrieren, wurde das Kinetochor-Protein Ctf19 zu verschiedenen Zeitpunkten während der Meiose abgebaut. Ctf19 ist eine Komponente des Kinetochors, die bei der Mitose entbehrlich ist, aber für die richtige Chromosomentrennung in der Meiose 9,10,11,12,13 erforderlich ist. Bei der Meiose wird das Kinetochor in der Prophase I ausgeschieden, und Ctf19 ist wichtig für die Remontagedes Kinetochors 9,14. Für dieses Protokoll wurden Zellen mit dem NDT80-in-System synchronisiert, und die Ankerweg-Technik wurde verwendet, um das Zielprotein Ctf19 vor und nach der Freisetzung aus der Prophase I und nach der Meiose-I-Chromosomentrennung aus dem Zellkern zu entfernen (Abbildung 1). Dieses Protokoll kann angepasst werden, um andere Proteine von Interesse in jedem Stadium der Meiose und Mitose zu erschöpfen.
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Protocol
1. Vorbereitung der notwendigen Materialien
- Bereiten Sie Reagenzien für das Wachstum und die Sporulation von Hefezellen vor.
ANMERKUNG: Wenn die Knospendestämme ade2 - und trp1- sind, ergänzen Sie alle Medien in den Schritten 1.1.1-1.1.3 mit einer Endkonzentration von 0,01 % Adenin und 0,01 % Tryptophan aus 1 %igen Beständen. Wenn Sie Medien im Autoklaven sterilisieren, fügen Sie diese Aminosäuren erst hinzu, nachdem die Reagenzien autoklaviert und auf Raumtemperatur abgekühlt wurden.- Für vegetatives Wachstum bereiten Sie 2x synthetisches vollständiges + Dextrosemedium (2XSC) vor, indem Sie 6,7 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren, 2 g vollständige Aminosäuremischung und 20 g Dextrose in 500 ml Wasser auflösen. Sterilisieren Sie das Gemisch durch Autoklavieren für 20 min bei 121 °C oder filtrieren Sie durch einen 0,2 μm-Filter.
- Für den ersten Schritt der Sporulation werden 2x synthetisches komplettes + Acetatmedium (2XSCA) hergestellt, indem 6,7 g Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren, 2 g vollständige Aminosäuremischung und 20 g Kaliumacetat in 500 ml Wasser gelöst werden. Sterilisieren Sie die Mischung durch Autoklavieren für 20 min bei 121 °C oder Filtrieren durch einen 0,2 μm Filter.
- Für den letzten Schritt der Sporulation 1% Kaliumacetat (1% KAc) vorbereiten, indem 5 g KAc in 500 ml Wasser gelöst werden. Sterilisieren Sie das Gemisch durch Autoklavieren für 20 min bei 121 °C oder filtrieren Sie durch einen 0,2 μm-Filter.
- Bereiten Sie Medikamente und Reagenzien für die Mikroskopie, Synchronisation und Verankerung vor.
- Um Zellen während der Zeitraffer-Bildgebung auf dem Deckglas zu haften, machen Sie 1 mg/ml Concanavalin A (ConA) in 1x PBS. Filter sterilisieren Sie mit einem 0,2 μm Filter und lagern Sie kleine (~10 μL) Aliquots bei -20 °C.
- Um das NDT80-in-System zu verwenden, werden 2 ml 1 mM β-Estradiol in Ethanol gelöst. Filter sterilisieren mit einem 0,2 μm Filter und lagern Aliquots (~500 μL) bei -20 °C.
- Für das Ankerwegsystem werden 1 mg/ml Rapamycin in DMSO gelöst. Filter sterilisieren Sie mit einem 0,2 μm Filter und lagern Sie kleine (~10 μL) Aliquots bei -20 °C.
HINWEIS: Bereiten Sie kleine Aliquots von Rapamycin vor, um mehrere Gefrier-Tau-Zyklen des Arzneimittels zu vermeiden.
- Erzeugen von Hefestämmen, die das NDT80-in-System enthalten (P GAL1,10-NDT80/PGAL1,10-NDT80; GAL4-ER/ GAL4-ER) und ein Zielprotein, das mit FRB im genetischen Hintergrund markiert ist (tor1-1/tor1-1; fpr1Δ/ fpr1Δ; Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)4,8. Für diese Studie wurde Ctf19-FRB verwendet. Zusätzlich wurde eine Kopie des Histonproteins Htb2 mit mCherry markiert, um die Überwachung der meiotischen Progression und der Chromatin-Segregation zu ermöglichen.
- Bereiten Sie eine Kammer für Zeitrafferaufnahmen vor
- Beginnen Sie 6 bis 24 Stunden vor der Bildgebung mit der Vorbereitung der Kammer (Abbildung 2). Schneiden Sie mit einem beheizten Skalpell oder einer anderen scharfen Klinge eine 18 mm x 18 mm große Kammer aus dem Schachteleinsatz mit der Pipettenspitze.
- Verwenden Sie eine Kunststoffpipettenspitze, um eine dünne Schicht Silikondichtmittel um die unteren Kanten der Kammer zu verteilen, die am Deckglas haftet. Fügen Sie genügend Dichtmittel hinzu, damit die Ränder der Kammer vollständig abgedeckt sind (siehe Abbildung 2).
- Kleben Sie die Kammer auf ein 24 mm x 50 mm großes Deckglas, indem Sie die Kammer vorsichtig mit der Dichtmittelseite nach unten auf das Deckglas legen. Stellen Sie sicher, dass keine Lücken im Dichtmittel vorhanden sind, damit die Kammer nicht ausläuft.
- 8-10 μL ConA auf das Deckglas verteilen. Geben Sie ConA auf die Mitte des Deckglases und verwenden Sie eine Pipettenspitze, um das ConA in einer dünnen Schicht zu verteilen, so dass es den größten Teil des Deckglases bedeckt, das von der Kammer umgeben ist.
HINWEIS: Kunststoffkammern können unbegrenzt wiederverwendet werden. Nachdem die Zeitrafferaufnahme abgeschlossen ist, entfernen Sie die Kammer mit einem Rasiermesser aus dem Deckglas, reinigen Sie das Silikondichtmittel aus der Kammer und halten Sie die Kammern für die zukünftige Verwendung in 95% Ethanol eingetaucht.
2. Sporulation von Hefezellen
- Führen Sie die folgenden Schritte für das Verhungern von Hefezellen durch, um das meiotische Programm zu induzieren.
HINWEIS: Diese Schritte dienen der Sporulation des Hefestamms W303. Andere Stämme können andere Protokolle erfordern15. Die Sporulationseffizienz ist zwischen den Laborstämmen sehr unterschiedlich, wobei W303 eine Sporulationseffizienz von ~60% aufweist16,17,18.- Man nimmt eine einzelne Kolonie des entsprechenden diploiden Hefestamms von einer Platte und beimpft 2 mL 2XSC und lässt sie bei 30 °C auf einer Walze 12-24 h bis zur Sättigung wachsen.
- Verdünnen Sie die gesättigte Kultur zu 2XSCA, indem Sie 80 μL der Kultur aus Schritt 2.1.1 zu 2 ml 2XSCA hinzufügen. Bei 30 °C auf einer Walze 12-16 h wachsen lassen. Lassen Sie 2XSCA nicht länger als 16 h einwirken, da die Zellen krank werden oder selbstfluoreszierend werden können.
- Führen Sie zwei Wäschen durch, indem Sie die Kultur bei 800 x g bei Raumtemperatur (25 °C) für 1 Minute herunterschleudern, die Flüssigkeit verwerfen und das Pellet in 2 ml sterilem destilliertem Wasser resuspendieren.
- Nach der zweiten Wäsche die Flüssigkeit entfernen und das Pellet in 2 ml 1% KAc resuspendieren und bei 25 °C auf einer Walze für 8-12 h wachsen lassen. Zellen, die in die Meiose eingetreten sind, werden in Pachyten der Prophase I blockiert.
- Prophase-I-Release-System
- β-Estradiol bis zu einer Endkonzentration von 1 μM direkt in die Sporationskultur geben und das Kulturröhrchen schnell durchwirbeln. Das β-Östradiol setzt Zellen aus der Prophase I frei.
3. Depletion des Zielproteins aus dem Zellkern mit der Anchor-Away-Technik
- Fügen Sie den Zellen Rapamycin hinzu, um das FRB-markierte Protein in einem bestimmten Stadium aus dem Zellkern zu entfernen.
- Um Proteine aus dem Zellkern am Austritt aus der Prophase I abzubauen, wird Rapamycin in einer Endkonzentration von 1 μg/ml gleichzeitig mit β-Östradiol-Zugabe in das Sporenkulturröhrchen gegeben.
- Um Proteine aus dem Zellkern in einem bestimmten Stadium der Meiose zu entleeren, überwachen Sie das Zellzyklusstadium ab 60 Minuten nach β-Östradiol-Addition. Alle 20 Minuten 5 μL Kultur auf ein 24 mm x 40 mm großes Deckglas pipettieren und die Zellen mit einem 18 mm x 18 mm großen Deckglas bedecken. Lassen Sie die Kulturen auf der Walze zwischen den Zeitpunkten bei 25 °C rotieren.
- Bildgebung der Zellen mit dem A594/mCherry-Filter und dem 60-fach-Objektiv eines Fluoreszenzmikroskops. Stellen Sie den prozentualen Transmissionsgrad auf 2% und die Belichtungszeit auf 250 ms ein. Das Vorhandensein von einer, zwei oder vier DNA-Massen zeigt das meiotische Stadium an, in dem die Zellen fortgeschritten sind. Fügen Sie Rapamycin zu einer Endkonzentration von 1 μg / ml im interessierenden meiotischen Stadium hinzu.
- Halten Sie die Zellen auf der Walze bei 25 °C rotieren, bis sie für die Bildgebung bereit sind. Die nukleäre Depletion eines Zielproteins tritt 30-45 min nach der Zugabe von Rapamycin 2,8 auf.
4. Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie
- Stellen Sie ein Agar-Pad her, das verwendet wird, um eine Monoschicht von Zellen für die Bildgebung zu erstellen (siehe Schritt 4.2).
- Schneiden Sie die Kappe und den Boden 1/3 eines 1,5-ml-Mikrofugenröhrchens ab und entsorgen Sie es, um einen Zylinder zu erstellen. Der Zylinder dient als Form für das Agarkissen. Machen Sie zwei Zylinder, um ein Extra zu haben, falls der Agar im ersten nicht richtig polymerisiert.
- Legen Sie den geschnittenen Mikrofugenröhrchenzylinder auf einen sauberen Glasobjektträger, wobei die Oberseite des Röhrchens verkehrt herum auf dem Objektträger sitzt.
- 6 ml einer 5%igen Agarlösung (1% KAc als Lösungsmittel verwenden) in einem 50-ml-Becherglas herstellen und in der Mikrowelle erhitzen, bis der Agar vollständig aufgelöst ist.
HINWEIS: Das Agar kocht leicht in der Mikrowelle über; Beobachten Sie den Agar und starten und stoppen Sie die Mikrowelle, wenn der Agar zu kochen beginnt und den Becher schwenkt. Starten und stoppen Sie die Mikrowelle mehrmals, um das Agar vollständig aufzulösen. Die Agarlösung wird über die Menge hinaus hergestellt, die erforderlich ist, um sicherzustellen, dass sich der Agar vollständig auflöst. - Schneiden Sie die Spitze der Pipette ab, um eine größere Öffnung zu machen, und pipieren Sie ~ 500 μL geschmolzenen Agar in jeden Mikrofugenrohrzylinder. Bei Raumtemperatur ruhen lassen, bis der Agar erstarrt (~10-12 min).
- Vorbereitung von Hefezellen für die Bildgebung
- 200 μL der Sporulationskultur aus Schritt 3.2 bei 800 x g für 2 min in 1-ml-Mikrozentrifugenröhrchen herunterschleudern. Entfernen und verwerfen Sie 180 μL des Überstands. Resuspendieren Sie das Pellet im verbleibenden Überstand, indem Sie das Röhrchen schwenken und schnippen.
- In Schritt 1.4 werden 6 μL der konzentrierten Zellen auf das Deckglas in der Mitte der Kammer pipettiert.
- Halten Sie den Zylinder mit dem Agarpad aus Schritt 4.1 fest und schieben Sie ihn vorsichtig vom Glasobjektträger. Stellen Sie sicher, dass der Agar unten völlig flach ist, und üben Sie mit der Unterseite einer Pipettenspitze einen leichten Druck auf die Mikrofugenform aus, so dass das Agarkissen leicht über den Rand des Röhrchens gedrückt wird.
- Drehen Sie die Form so um, dass das Agarkissen nach unten zur Kammer zeigt.
- Legen Sie das Agarpad (noch in der Mikrofugenröhrchenform) vorsichtig mit einer Pinzette auf die Zellen. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um das Agarkissen 10-20 Mal vorsichtig um die Kammer zu schieben, um eine Monoschicht von Zellen auf dem Deckglas zu erzeugen.
- Lassen Sie das Agarkissen für 12-15 min in der Kammer. Dieser Schritt ermöglicht es den Zellen, an der ConA auf dem Deckglas zu haften.
- 2 mL Sporulationskultur aus Schritt 3.2 in zwei Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei 15.700 x g für 2 min durchdrehen. Den Überstand in saubere Mikrofugenröhrchen überführen und erneut bei 15.700 x g für 2 min schleudern. Überführen Sie den Überstand in saubere Mikrozentrifugenröhrchen, die im nächsten Schritt verwendet werden sollen.
HINWEIS: Es ist wichtig, den vorkonditionierten KAc-Überstand mit dem β-Östradiol und Rapamycin zu verwenden, um eine effiziente Sporulation und eine anhaltende Erschöpfung des interessierenden Proteins zu gewährleisten. - Nachdem das Agarkissen 12-15 Minuten in der Kammer gesessen hat, schwimmen und entfernen Sie das Agarkissen vor der Bildgebung. Dazu werden 2 mL des Überstands aus Schritt 4.2.7 tropfenweise in die Kammer gegeben. Sobald die Flüssigkeit die Oberseite der Kammer erreicht hat, wird das Agarkissen höchstwahrscheinlich schwimmen.
HINWEIS: Wenn das Agarkissen nicht automatisch schwimmt, warten Sie 1-2 Minuten. Wenn das Agarkissen immer noch nicht schwimmt, entfernen Sie es vorsichtig mit einer Pinzette. Im Idealfall würde das Agar-Pad von selbst schwimmen, da das Entfernen vor dem Schwimmen zur Entfernung der Zellen führen könnte. - Nachdem das Agarkissen geschwommen ist, entfernen Sie es vorsichtig mit einer Pinzette und entsorgen Sie es. Legen Sie ein 24 mm x 50 mm großes Deckglas auf die Oberseite der Kammer, um eine Verdunstung während der Bildgebung zu verhindern.
- Einrichten eines Films auf dem Mikroskop
HINWEIS: Die folgenden Anweisungen gelten für ein inverses Mikroskop, das mit einem Objektträger ausgestattet ist, der das Deckglas im Format 24 mm x 50 mm aufnimmt (Details zu Mikroskop, Kamera und Software finden Sie in der Materialtabelle ). Für die Bildaufnahme wird ein 60-faches Ölimmersionsobjektiv verwendet. Dieses Protokoll muss möglicherweise geändert werden, wenn andere Mikroskope oder andere Objektträgerhalter verwendet werden. Die genauen Schritte zum Ausführen von Schritt 4.3.2 bis Schritt 4.3.16 variieren je nach verwendetem Mikroskop und verwendeter Bildgebungssoftware. Siehe Abschnitt 4.4 für Anweisungen für ein anderes Mikroskop.- Setzen Sie das Deckglas in den Diahalter ein. Kleben Sie den Formton seitlich auf das Deckglas, um ihn sicher im Diahalter aufzubewahren.
- Öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware. Verwenden Sie Kurs- und Feineinstellungsknöpfe, um die Zellen mit DIC oder Hellfeld zu fokussieren.
- Klicken Sie im Hauptmenü der Bilderfassungssoftware auf Datei > Erfassen (3D auflösen). Es werden drei Fenster angezeigt.
- Klicken Sie im Fenster 3D auflösen auf das Erlenmeyerkolben-Symbol . Dadurch wird ein Fenster mit dem Titel Design/Run Experiment geöffnet, das die Steuerelemente zum Einrichten eines Experiments zum Einrichten eines Zeitrafferfilms enthält.
- Navigieren Sie auf der Registerkarte Entwurf zur Registerkarte Schnitt. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Z-Abschnitt. Stellen Sie die z-Stapel wie folgt ein: Optischer Schnittabstand = 1 μm, Anzahl optischer Abschnitte = 5, Probendicke = 5,0 μm.
- Klicken Sie auf der Registerkarte Kanäle auf das + -Symbol, sodass eine Kanaloption angezeigt wird. Wählen Sie den entsprechenden Kanal aus. Für dieses Experiment wählen wir A594 aus, das zur Abbildung von mCherry verwendet wird. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Referenzbild, und legen Sie die Z-Position im Dropdown-Menü auf die Mitte der Probe fest.
- Wählen Sie einen Wert aus dem Dropdown-Menü neben %T und Exp. aus, um den prozentualen Transmissionsgrad bzw. die Belichtungszeit festzulegen. Für dieses Experiment werden 2% Transmissionsgrad und 250 ms Belichtungszeit im A594-Kanal verwendet, und 10% Transmissionsgrad und 500 ms Belichtungszeit werden für das Hellfeld verwendet.
HINWEIS: Die Belichtungszeit und der prozentuale Transmissionsgrad variieren je nach Mikroskop. Um eine Überbelichtung zu vermeiden, verwenden Sie die niedrigste prozentuale Transmission und die kürzest mögliche Belichtungszeit, die eine korrekte Visualisierung des interessierenden Proteins ermöglicht. - Aktivieren Sie auf der Registerkarte Zeitraffer das Kontrollkästchen neben Zeitraffer. Geben Sie in der angezeigten Tabelle 10 unter der Min-Spalte in der Zeitrafferzeile und 10 unter der Stundenspalte in der Zeile Gesamtzeit ein. Dies führt einen Zeitverlauf durch, der alle 10 Minuten für 10 Stunden Bilder macht.
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben "Fokus mit ultimativem Fokus beibehalten ", um Bühnendrifts während des Films zu vermeiden. Aktivieren Sie auf der Registerkarte " Punkte " das Kontrollkästchen neben "Liste der Besuchspunkte".
- Klicken Sie im Hauptmenü auf Ansicht > Punktliste. Es öffnet sich ein Fenster mit dem Namen Punktliste. Bewegen Sie die Bühne in einen Bereich der Kammer, der eine Monoschicht von Zellen zeigt. Klicken Sie im Punktlistenfenster auf Punktmarkierung .
- Verschieben Sie die Bühne, um 25-30 Punkte ohne Überlappung auszuwählen, um eine Überbelichtung der Zellen zu vermeiden. Jedes Feld wird während jedes Zeitverlaufs abgebildet.
- Wählen Sie im Punktlistenfenster Alle kalibrieren aus, um den endgültigen Fokus für jeden Punkt festzulegen. Geben Sie im Fenster Desgin/Run Experiment auf der Registerkarte Entwurf den Punktbereich (abgerufen aus dem Fenster Punktliste) in das Feld neben Besuchspunktliste ein. Speichern Sie die Datei auf der Registerkarte Ausführen am entsprechenden Ziel auf dem Computer. Wählen Sie im Fenster "Test entwerfen/ausführen" die Schaltfläche "Abspielen" (grünes Dreieck), um den Film zu starten.
- Optionale Methode: Einrichten eines Films auf einem Mikroskop
HINWEIS: Diese Anleitung gilt für ein inverses Mikroskop, das mit einem Objektträger ausgestattet ist, der ein Deckglas von 24 mm x 50 mm aufnehmen kann. Spezifikationen zum verwendeten Mikroskop, zur Kamera und zur Bildgebungssoftware finden Sie in der Materialtabelle . Für die Bildaufnahme wird ein 60-faches Ölimmersionsobjektiv verwendet.- Setzen Sie das Deckglas in den Diahalter ein. Öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware. Verwenden Sie Kurs- und Feineinstellknöpfe, um Zellen mit DIC oder Hellfeld zu fokussieren. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in das geöffnete Fenster der Software. Ein Dropdown-Menü wird angezeigt.
- Klicken Sie auf Akquisitionssteuerung > Erfassung. Klicken Sie auf Anwendung > Experiment definieren/ausführen. Dadurch wird ein Fenster mit der Bezeichnung ND-Erfassung geöffnet.
- Aktivieren Sie im sich öffnenden Fenster das Kontrollkästchen neben XY. Verschieben Sie die Bühne an die gewünschte Position, und klicken Sie auf das Kästchen unter Punktname , um diese Position als Punkt auszuwählen. Wiederholen Sie dies, bis 25-30 Punkte ohne Überlappung ausgewählt sind, um eine Überbelichtung der Zellen zu vermeiden. Jedes Feld wird während jedes Zeitverlaufs abgebildet.
- Stellen Sie die prozentuale Transmission für jeden fluoreszierenden Kanal ein. Da die Stämme Htb2-mCherry produzieren, kommt hier der mCherry-Filter zum Einsatz. Navigieren Sie im Erfassungsfenster, das in Schritt 4.3.3 geöffnet wurde, zur Schaltfläche 555 nm. Stellen Sie den prozentualen Transmissionsgrad auf 5 % ein, indem Sie die gleitende Skala unter der 555-nm-Taste anpassen, bis sie 5 % anzeigt.
- Stellen Sie die Belichtungszeit für jeden Fluoreszenzkanal ein. Wählen Sie im Erfassungsfenster im Dropdown-Menü Belichtung die Option 200 ms aus.
HINWEIS: Die Belichtungszeit und der prozentuale Transmissionsgrad variieren je nach Mikroskop. Um eine Überbelichtung zu vermeiden, verwenden Sie die niedrigste prozentuale Transmission und die kürzest mögliche Belichtungszeit, die eine korrekte Visualisierung des interessierenden Proteins ermöglicht. - Klicken Sie auf das Kästchen neben Z im ND-Erfassungsfenster . Legen Sie fünf Z-Stacks der Hefezellen fest, die 1,2 μM voneinander entfernt sind.
- Klicken Sie auf das Kästchen neben λ. Wählen Sie die entsprechenden Kanäle aus, die für das Experiment verwendet werden sollen. Stellen Sie für DIC sicher, dass Home aus dem Dropdown-Menü unter Z pos ausgewählt ist. Stellen Sie für mCherry sicher , dass Alle aus dem Dropdown-Menü unter Z pos ausgewählt ist. Dadurch wird sichergestellt, dass nur ein einziger Abschnitt (in der Mitte des Z-Stacks) für DIC verwendet wird.
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Zeit im Fenster ND-Erfassung . Aktivieren Sie das Kontrollkästchen unter Phase. Wählen Sie im Dropdown-Menü unter Intervall die Option 10 min aus. Wählen Sie unter Dauer die Option 10 Stunde(n) aus. Dies wird so ablaufen, dass alle 10 Minuten für 10 h Bilder aufgenommen werden.
5. Analyse der Chromatin-Segregation
- Öffnen Sie die Fidschi-Software. Öffnen Sie jeweils ein Sichtfeld: Öffnen Sie für jedes Feld die Kanäle DIC und mCherry.
- Nehmen Sie die maximale Intensitätsprojektion des mCherry-Kanals, um ein einzelnes Bild zu erhalten: Klicken Sie auf Bild > Stapel > Z-Projekt, wählen Sie Max Intensity aus dem Dropdown-Menü.
- Führen Sie die DIC- und mCherry-Kanäle in einem Bild zusammen: Klicken Sie auf Bild > Farbe > Kanäle zusammenführen.
- Folgen Sie einer einzelnen Zelle durch Meiose. Nach Abschluss der Meiose II notieren Sie die Anzahl der DNA-Massen.
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Representative Results
Um die Chromatin-Segregation zu überwachen, wurde das Histon-Protein Htb2 mit mCherry markiert. In der Prophase I erscheint das Chromatin als einzelne Htb2-Masse. Nachdem sich die homologen Chromosomen in der ersten meiotischen Teilung getrennt haben, erscheint das Chromatin als zwei unterschiedliche Massen (Abbildung 3A). Nachdem sich die Schwesterchromatiden getrennt haben, erscheint das Chromatin als vier Massen. Wenn einige Chromosomen nicht an Spindel-Mikrotubuli anheften, können nach Meiose I oder Meiose II zusätzliche Massen gesehen werden.
Die oben beschriebene Methode wurde verwendet, um die Rolle der Kinetochor-Komponente Ctf19 bei der Sicherstellung der richtigen Chromosomentrennung bei der knospenden Hefe-Meiose zu untersuchen. Mit FRB markierte Hefesterstämme, die Ctf19 exprimierten, wurden in der Prophase I mit dem NDT80-in-System synchronisiert (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; CTF19-FRB; GAL1-10 förderte NDT80; GAL4-ER). Als Kontrolle wurde ein NDT80-in-Stamm mit dem Anker-weg-Stammhintergrund, aber ohne das FRB-markierte Protein verwendet (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; GAL1-10 förderte NDT80; GAL4-ER). Die Zellen wurden durch Zugabe von β-Estradiol aus dem Prophase-I-Arrest freigesetzt. Rapamycin wurde zugegeben, um Ctf19-FRB entweder bei der Freisetzung (vor der Kinetochor-Reassemblierung), 45 min nach der Freisetzung (nach der Kinetochor-Reassemblierung, aber vor der Meiose I) oder 3 h nach der Freisetzung (kurz vor Meiose II) aus dem Zellkern abzubauen (Abbildung 3A-F). Nach der Zugabe von Rapamycin wurde eine Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt, und für die verbleibende Dauer der Meiose wurden alle 10 Minuten Bilder aufgenommen.
Nach der Bildgebung wurde die Open-Access-Software Fiji verwendet, um die Bilder zu öffnen und die Analyse von Abbildungen durchzuführen, die den Zeitverlauf zeigen (Abbildung 3A-F). Die Anzahl der DNA-Massen nach Meiose II wurde in mindestens 100 Zellen gezählt, die sich in einer Meiose befanden. In Wildtyp-Zellen mit dem Anker-weg-Hintergrund gibt es typischerweise vier DNA-Massen am Ende der Meiose II, die die vier Produkte der Meiose repräsentieren (Abbildung 3A). In einem kleinen Teil der Zellen sind nach Meiose II nur drei Massen sichtbar (Abbildung 3B,G). Es ist jedoch wahrscheinlich, dass drei Massen das Ergebnis einer Zelle sind, die vier Meioseprodukte aufweist, aber zwei dieser Massen nach Meiose II zusammen erscheinen.
Wenn Ctf19-FRB zum Zeitpunkt der Freisetzung des Prophase-I-Austritts (t = 0 h) verankert ist, zeigen etwa 47% der Zellen nach Abschluss der Meiose mehr als vier DNA-Massen, was auf einen Defekt in der Anheftung von Kinetochoren und Mikrotubuli hindeutet (Abbildung 3C, G). Bei Verankerung von Ctf19-FRB entweder nach Kinetochore-Assemblierung, aber vor Meiose I (t = 45 min) oder vor Meiose II (t = 3 h) weisen ca. 16% der Zellen zusätzliche DNA-Massen auf. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass Ctf19 für die Remontage von Kinetochoren bei der Freisetzung von Prophase I wichtig ist, aber weniger wichtig für die Chromosomensegregation ist, sobald das Kinetochor wieder zusammengesetzt wurde.
Die hier erzielten Ergebnisse zeigen, dass die Zeitraffer-Mikroskopie in Kombination mit der Synchronisation des Zellzyklus und der bedingten Depletion eines Zielproteins die Untersuchung eines Proteins in einem bestimmten meiotischen Stadium ermöglicht. Obwohl Ctf19 für die Mitose nicht essentiell ist, wird das meiotische Kinetochor umfassend reorganisiert, und Ctf19 spielt eine entscheidende Rolle bei der Remontage des Kinetochors nach dem Austrittder Prophase I 9,11,12. Die Ergebnisse in Abbildung 3 zeigen, dass, wenn Ctf19 vor der Kinetochore-Remontage erschöpft ist, ein großer Teil der Zellen nach Meiose II zusätzliche DNA-Massen aufweist. Wenn Ctf19 nach der Remontage des Kinetochors, aber vor Meiose I oder Meiose II aus dem Zellkern abgebaut wird, gibt es weniger Zellen, die zusätzliche DNA-Massen aufweisen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die wichtigste Rolle für Ctf19 am Ende der Prophase I liegt. Dieser Unterschied in der Chromosomentrennungstreue mit Depletion von Ctf19 in verschiedenen Stadien unterstreicht die Bedeutung der Verwendung von stadienspezifischen bedingten Allelen, um die Funktion von Proteinen speziell in Meiose I oder Meiose II zu untersuchen. Eine meiotische Nullmutante hätte einen schweren Defekt gezeigt und nicht in jedem Stadium Informationen über die Rolle von Ctf19 geliefert.
Obwohl CTF19 kein essentielles Gen ist, gibt es einen Chromosomenübertragungstreue-Phänotyp (CTF) während des vegetativen Wachstums von CTF19-Mutanten 19. Die Verwendung eines Null-Allels oder eines mutierten CTF19-Allels könnte eine Population von aneuploiden Zellen erzeugen, die möglicherweise nicht richtig Meiose durchlaufen. Die Verwendung der Ankerwegtechnik und des NDT80-in-Synchronisationssystems umgeht dieses Problem, indem Ctf19 kurz vor der Meiose I oder Meiose II präzise aus dem Zellkern abgebaut wird, wodurch die Besorgnis verringert wird, dass die analysierten Zellen aneuploid waren.
Abbildung 1: Überblick über das Experiment. Karikatur einer Hefezelle, die ein einzelnes Paar homologer Chromosomen zeigt. NDT80-in-Zellen treten in die Meiose ein und stoppen sie in der Prophase I. Nach Zugabe von β-Estradiol treten Zellen synchron in die meiotischen Teilungen ein. Die Zugabe von Rapamycin bestimmt, wann das Zielprotein (mit einem Stern markiert) verankert ist. In diesem Experiment wurde das Zielprotein Ctf19 zu drei verschiedenen Zeitpunkten durch Zugabe von Rapamycin (RAP) zur gleichen Zeit wie Prophase I (RAP-Addition bei t = 0 min), nach Prophase-I-Freisetzung (RAP-Addition bei t = 45 min) und nach Meiose-I-Chromosomentrennung (RAP-Addition bei t = 3 h) verankert. Die dicken schwarzen Pfeile zeigen das Zellzyklusstadium der Rapamycin-Addition an und zielen daher auf den Proteinmangel ab. Abkürzungen: RAP = Rapamycin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Kammeraufbau für Zeitraffer-Bildgebungsexperimente. (A) Wiederverwendbare Kammer (rechts) geschnitten aus einem Pipettenspitzenhalter (links). Der Pipettenspitzenhalter wird mit einer glühenden Klinge geschnitten, um einen 4 Quadrat x 4 Quadrat großen Teil des Einsatzes zu entfernen. Die gestrichelten Linien zeigen einen Probenabschnitt des Spitzenhalters an, der zu einer Kammer geschnitten werden kann. Die verbliebenen Kunststofftrennwände innerhalb des 4 Quadrat x 4 Quadrat großen Ausschnitts werden weggeschnitten und es bleibt eine Hohlkammer übrig (rechts). (B) Um die endgültige Kammer zu erstellen, wird Silikondichtmittel an die Kanten auf einer Seite der Kammer gegeben und dann auf ein Deckglas gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Der Zeitpunkt, zu dem Ctf19 verankert ist, beeinflusst die Chromatin-Segregation. (A-F) Repräsentative Zeitrafferaufnahmen von Zellen, die Htb2-mCherry während der Meiose exprimieren. Die Bilder wurden alle 10 Minuten aufgenommen, unmittelbar nach der Zugabe von β-Östradiol. Maßstabsbalken = 5 μm. Zahlen in der oberen rechten Ecke jedes Frames bezeichnen die Zeit, die zwischen den einzelnen Frames verstrichen ist, und die Zeit 0 gibt den Frame an, in dem sich das Chromatin in der Meiose I absondert. Es wurden nur Zellen gezählt, die die meiotischen Teilungen abgeschlossen hatten. (A) Wildtyp-Zelle (kein mit FRB markiertes Protein), in die 12 h nach dem KAc-Transfer β-Estradiol gegeben wurde. Die Zelle enthält vier DNA-Massen nach Abschluss der Meiose II. (B) Ctf19-FRB-Zelle, in der Rapamycin bei t = 0 (gleichzeitig mit β-Estradiol-Addition) hinzugefügt wurde. Diese Zelle zeigt drei DNA-Massen nach Meiose II. (C) Ctf19-FRB-Zelle, in der Rapamycin bei t = 0 (gleichzeitig mit β-Estradiol-Addition) hinzugefügt wurde. Diese Zelle weist nach Meiose II fünf DNA-Massen auf. (D) Ctf19-FRB-Zelle, in der Rapamycin bei t = 0 (gleichzeitig mit β-Estradiol-Addition) hinzugefügt wurde. Diese Zelle stirbt nach Abschluss der Meiose II ab. (E) Ctf19-FRB-Zelle, in die Rapamycin 45 min nach β-Estradiol-Addition zugegeben wurde. Diese Zelle zeigt fünf DNA-Massen nach Meiose II. (F) Ctf19-FRB-Zelle, in die Rapamycin 45 Minuten nach β-Estradiol-Addition gegeben wurde. Nach Meiose II sind sechs DNA-Massen vorhanden. (G) Quantifizierung der Anzahl der DNA-Massen in mindestens 100 Zellen für jede Bedingung (zwei Filme, die für jede Bedingung analysiert wurden). t = unter jedem Balken gibt den Zeitpunkt an, zu dem Rapamycin im Verhältnis zur β-Estradiol-Addition zugegeben wurde. Abkürzungen: MII = Meiose II. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll kombiniert das NDT80-in-System zur Synchronisierung von Zellen, die Ankertechnik, um Proteine aus dem Zellkern zu entfernen, und die Fluoreszenz-Zeitraffermikroskopie, um knospende Hefezellen während der Meiose abzubilden. Das NDT80-in-System ist eine Methode zur Synchronisation des meiotischen Zellzyklus, die einen Prophase-I-Arrest und -Release 4,8 verwendet. Obwohl die einzelnen Zellen in der Zeit, die sie in jedem der nachfolgenden meiotischen Stadien verbringen, leicht variieren, behalten die meisten Zellen einen hohen Grad an Synchronität während der meiotischen Teilungen bei.
Die Ankerwegtechnik ist ein anpassungsfähiges Werkzeug für mitotische und meiotische Studien. Durch die Veränderung des Anker-Zielproteins und des Zeitpunkts von Rapamycin kann diese Methode angepasst werden, um verschiedene Proteine in jedem Stadium der knospenden Hefe-Meiose zu untersuchen. Gängige Methoden zur Herstellung bedingter Mutanten zur Untersuchung der aufkeimenden Hefemitose sind nicht immer für meiotische Studien geeignet. Zum Beispiel erfordert die Verwendung eines repressiblen Promotors oft eine Änderung der Kohlenstoffquelle, um die Expression des Zielproteins zu verändern, was die Meiosestören kann 20. Temperaturempfindliche Mutanten sind auf eine Temperaturänderung angewiesen, um die Aktivität des Zielproteins zu verringern oder aufzuheben. Viele dieser bedingten Mutanten können nicht in meiotischen Studien verwendet werden, da wechselnde Nährstoffbedingungen oder Temperatur die Meiose stören können21,22,23. Darüber hinaus können Deletionen oder Mutanten Studien zur Meiose einschränken, da die Expression eines mutierten Proteins zu Beginn der Meiose spätere Stadien blockieren oder beeinträchtigen kann. Die Ankerwegtechnik kann diese Herausforderungen umgehen, da sie nicht auf Veränderungen der Ernährung oder Temperatur angewiesenist 8. Darüber hinaus kann der Abbau des Proteins zeitlich so reguliert werden, dass der Zeitpunkt der Rapamycin-Addition bestimmt, wann das Protein verankert wird.
Eine Einschränkung der Ankerweg-Technik besteht darin, dass sie möglicherweise nicht für nicht-nukleäre Proteine geeignet ist, da sie auf die ribosomale Untereinheit Rpl13A als Anker angewiesen ist, um das Zielprotein aus dem Zellkern zu transportieren. Es gibt jedoch andere Anwendungen der Ankerweg-Technik, indem die Protein-Protein-Wechselwirkungen verändert werden, die auch während der Meiose nützlich sein können, wie z.B. die Verankerung von Proteinen an Komplexen oder deren Bindung an Membranen8. Frühere Studien haben gezeigt, dass die nukleäre Depletion der Zielproteine innerhalb von 30 Minuten nach Rapamycin zusätzlich 2,8 auftritt. Es ist jedoch möglich, dass einige Proteine eine längere oder kürzere Zeit benötigen, um aus dem Zellkern transportiert zu werden. Um sicherzustellen, dass das Zielprotein aus dem Zellkern transportiert wird, kann das Zielprotein mit FRB markiert werden, das mit GFP (FRB-GFP) fusioniert ist, um die Zeitspanne zwischen Rapamycin-Addition und Kernverarmung zu überwachen. Eine weitere Einschränkung des Ankerwegsystems besteht darin, dass einige Proteine empfindlich auf die FRB- und FRB-GFP-Tags am C-Terminus reagieren. Daher ist die N-terminale Markierung des Zielproteins mit FRB eine alternative Strategie, um ein Zielprotein zu verankern.
Um die Chromatin-Segregation zu überwachen, exprimierten knospende Hefezellen Htb2-mCherry. In diesem Stamm ist das Htb2-Protein an seinem endogenen Locus markiert, was sicherstellt, dass Htb2 normal exprimiert wird. Andere fluoreszenzmarkierte Proteine könnten auch verwendet werden, um verschiedene Aspekte der Meiose zu überwachen. Bei der Konstruktion eines Stammes für die Zeitraffer-Bildgebung ist es wichtig zu berücksichtigen, dass einige Proteine empfindlich auf C-terminale Fluoreszenzmarkierungen reagieren. Wachstums- und Sporulationstests des Stammes, der das fluoreszenzmarkierte Protein beherbergt, stellen sicher, dass die Markierung die Funktion des Proteins nicht verändert. Eine Herausforderung der Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, die Zellen ausreichend Fluoreszenz auszusetzen, damit die fluoreszierenden Proteine detektiert werden und gleichzeitig der Zelltod oder die Verlangsamung der Meiose durch übermäßige Exposition vermieden wird. Ein wichtiger Schritt zur Fehlerbehebung besteht darin, die geeigneten Mikroskop- und Kameraeinstellungen zu finden, um dieses Gleichgewicht zu erreichen. Die erforderliche Expositionszeit variiert leicht zwischen den Proteinen, daher sollten mehrere Iterationen eines Experiments durchgeführt werden, um die geeignete Expositionszeit zu bestimmen. Bei der Verwendung der hier beschriebenen Kammermethode für Zeitraffer-Bildgebungsexperimente ist es ein besonders empfindlicher Schritt, eine Monoschicht von Zellen abzubilden. Ohne eine Monoschicht sammeln sich Zellen übereinander an, was eine Herausforderung für die ordnungsgemäße Bildgebung und Datenanalyse darstellt. Die Verwendung eines Agar-Pads, das den Zellen hilft, sich an das ConA zu binden und die Zellen in der Kammer zu verteilen, ist eine kostengünstige und effiziente Möglichkeit, Monoschichten zu erhalten. Das Bewegen des Agarpads, um die Zellen in der Kammer so zu verteilen, dass eine Monoschicht erreicht wird, kann eine Herausforderung darstellen. Die Sicherstellung, dass das Agarpad während des Bewegungsprozesses sehr kleine Bewegungen ausführt, kann dazu beitragen, eine Monoschicht zu erzeugen. Die Herstellung einer wiederverwendbaren Kammer ermöglicht die kostengünstige Generierung von Zeitraffer-Bildgebungsdaten. Bei richtiger Reinigung und Desinfektion können die hier beschriebenen Kunststoffkammern unbegrenzt wiederverwendet werden. Es empfiehlt sich, dass die Kammern unmittelbar nach der Zeitrafferaufnahme aus dem Deckglas entnommen und bis zur nächsten Verwendung in 95% Ethanol gelagert werden.
Die Zeitrafferbildgebung liefert Informationen über den Zellzyklus, die bei der Abbildung fester Zellen 1,2 übersehen werden können. Bei der Überwachung der Dauer der meiotischen Stadien können beispielsweise Variationen zwischen einzelnen Zellen genauer untersucht werden, wenn lebende Zellen im Vergleich zu Populationen fixierter Zellen abgebildet werden. Da Hefeproteine leicht mit fluoreszierenden Proteinen markiert werden können, kann die Kopplung der Fluoreszenz-Zeitraffer-Bildgebung mit dem NDT80-in-System und der Ankerwegtechnik für zusätzliche Studien angepasst werden, wie z. B. die Überwachung der Segregation einzelner Chromosomen und das Timing bestimmter meiotischer Stadien. Bei der Überwachung des Zellzyklusverlaufs nach der Prophase-I-Freisetzung in NDT80-in-Zellen ist es wichtig, ein Protein mit einem fluoreszierenden Molekül markiert zu haben, das die Stadien der Meiose markiert. Einzelne Chromosomen können während der Meiose überwacht werden, indem Wiederholungen des Lac-Operons (LacO) in der Nähe des Zentromers eines Chromosoms in Zellen integriert werden, die LacI-GFP exprimieren. LacI-GFP bindet fest an LacO und wird als heller Fokus visualisiert, der durch die gesamte meiotische Teilung durch Zeitraffermikroskopie verfolgt werden kann24,25. Verschiedene Proteine mit fluoreszierenden Markierungen wurden verwendet, um die Dauer der meiotischen Stadien zu überwachen. Dazu gehören Tub1, die α-Tubulin-Untereinheit, die sich in Mikrotubuli einbaut; Zip1, ein Bestandteil des synaptonemalen Komplexes; und Spc42, eine Spindelpolkörperkomponente 1,2,26,27.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode die Synchronisation des meiotischen Zellzyklus, die bedingte Depletion eines Zielproteins und die Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung der meiotischen Chromosomensegregation umfasst. Durch die Abbildung knospender Hefezellen während der Meiose und die Verwendung bedingter Mutanten, die nur die beabsichtigten Stadien der Meiose beeinflussen, kann diese Methode genaue Daten über den meiotischen Zellzyklus liefern.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken dem Light Microscopy Imaging Center der Indiana University. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (GM105755) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
References
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