Time-lapse mikroskopi er et verdifullt verktøy for å studere meiose i spirende gjær. Denne protokollen beskriver en metode som kombinerer cellesyklussynkronisering, time-lapse-mikroskopi og betinget uttømming av et målprotein for å demonstrere hvordan man studerer funksjonen til et bestemt protein under meiotisk kromosomsegregering.
Time-lapse fluorescensmikroskopi har revolusjonert forståelsen av meiotiske cellesyklushendelser ved å gi tidsmessige og romlige data som ofte ikke ses ved å avbilde faste celler. Spirende gjær har vist seg å være en viktig modellorganisme for å studere meiotisk kromosomsegregering fordi mange meiotiske gener er svært konserverte. Time-lapse mikroskopi av meiose i spirende gjær gjør det mulig å overvåke forskjellige meiotiske mutanter for å vise hvordan mutasjonen forstyrrer meiotiske prosesser. Imidlertid fungerer mange proteiner på flere punkter i meiose. Bruk av funksjonstap eller meiotiske nullmutanter kan derfor forstyrre en tidlig prosess, blokkere eller forstyrre den senere prosessen og gjøre det vanskelig å bestemme fenotypene knyttet til hver enkelt rolle. For å omgå denne utfordringen beskriver denne protokollen hvordan proteinene kan bli betinget utarmet fra kjernen i bestemte stadier av meiose mens de overvåker meiotiske hendelser ved hjelp av time-lapse mikroskopi. Spesielt beskriver denne protokollen hvordan cellene synkroniseres i profase I, hvordan anker bort-teknikken brukes til å tømme proteiner fra kjernen i bestemte meiotiske stadier, og hvordan time-lapse-avbildning brukes til å overvåke meiotisk kromosomsegregering. Som et eksempel på bruken av teknikken ble kinetochoreproteinet Ctf19 utarmet fra kjernen på forskjellige tidspunkter under meiose, og antall kromatinmasser ble analysert ved slutten av meiose II. Samlet sett kan denne protokollen tilpasses for å tømme forskjellige nukleære proteiner fra kjernen mens du overvåker de meiotiske divisjonene.
Time-lapse fluorescensmikroskopi er et verdifullt verktøy for å studere dynamikken i meiotisk kromosomsegregering i spirende gjær 1,2. Spirende gjærceller kan induseres til å gjennomgå meiose gjennom sult av viktige næringsstoffer. Under meiose gjennomgår cellene en runde kromosomsegregering etterfulgt av to divisjoner for å lage fire meiotiske produkter som pakkes inn i sporer (figur 1). Individuelle celler kan visualiseres gjennom hvert stadium av meiose, noe som genererer romlige og tidsmessige data som lett kan gå glipp av fastcellebilder. Denne protokollen viser hvordan kombinasjon av time-lapse fluorescensmikroskopi med to tidligere etablerte metoder, det induserbare NDT80-systemet (NDT80-in) og anchor away-teknikken, kan brukes til å studere funksjonen til spesifikke proteiner i forskjellige meiotiske stadier.
NDT80-in-systemet er et kraftig verktøy for meiotisk cellesyklussynkronisering som er avhengig av det induserbare uttrykket til den midterste meiosetranskripsjonsfaktoren NDT80 4,5. NDT80-uttrykk kreves for profase I-utgang 6,7. Med NDT80-in-systemet er NDT80 under kontroll av GAL1-10-promotoren i celler som uttrykker Gal4-transkripsjonsfaktoren smeltet sammen med en østrogenreseptor (Gal4-ER)4,5. Fordi Gal4-ER bare kommer inn i kjernen når den er bundet til β-østradiol, arresterer NDT80-in-celler i profase I i fravær av β-østradiol, noe som tillater synkronisering av celler i profase I (figur 1). β-østradiol-addisjon fremmer translokasjonen av Gal4-ER-transkripsjonsfaktoren i kjernen, hvor den binder GAL1-10 for å drive uttrykk for NDT80, noe som fører til synkron inntreden i meiotiske divisjoner. Selv om time-lapse mikroskopi kan utføres uten synkronisering, er fordelen med å bruke synkronisering evnen til å legge til en inhibitor eller et stoff mens cellene er på et bestemt stadium av meiose.
Anker bort-teknikken er et induserbart system der et protein kan utarmes fra kjernen med tilsetning av rapamycin8. Denne teknikken er ideell for å studere nukleære proteiner under celledeling i spirende gjær fordi gjærceller gjennomgår lukket mitose og meiose, hvor kjernemuskulaturen ikke brytes ned. Videre er denne teknikken veldig nyttig for proteiner som har flere funksjoner gjennom meiose. I motsetning til for delesjoner, mutante alleler eller meiotiske nullalleler, kompromitterer ikke fjerning av et målprotein fra kjernen på et bestemt stadium målproteinaktiviteten i tidligere stadier, noe som muliggjør en mer nøyaktig tolkning av resultatene. Ankersystemet benytter shuttling av ribosomale underenheter mellom kjernen og cytoplasma som oppstår ved ribosomal modning8. For å tømme målproteinet fra kjernen, merkes målproteinet med FKBP12-rapamycinbindende domene (FRB) i en stamme der den ribosomale underenheten Rpl13A er merket med FKBP12. Uten rapamycin interagerer ikke FRB og FKBP12, og det FRB-merkede proteinet forblir i kjernen. Ved tilsetning av rapamycin danner rapamycin et stabilt kompleks med FKBP12 og FRB, og komplekset transporteres ut av kjernen på grunn av interaksjonen med Rpl13A (figur 1). For å forhindre celledød ved rapamycintilsetning, har celler tor1-1-mutasjonen av TOR1-genet . I tillegg inneholder disse cellene fpr1Δ , et nullallel av S. cerevisiae FKBP12-proteinet, som forhindrer endogen Fpr1 fra å utkonkurrere Rpl13A-FKBP12 for FRB- og rapamycinbinding. Ankeret bort bakgrunnsmutasjoner, tor1-1 og fpr1Δ, påvirker ikke meiotiske tidspunkter eller kromosomsegregering2.
For å demonstrere nytten av denne teknikken ble kinetochoreproteinet Ctf19 utarmet på forskjellige tidspunkter gjennom meiose. Ctf19 er en komponent i kinetochore som er dispenserbar i mitose, men kreves for riktig kromosomsegregering i meiose 9,10,11,12,13. I meiose kastes kinetochore i profase I, og Ctf19 er viktig for kinetochore re-montering 9,14. For denne protokollen ble celler med NDT80-in-systemet synkronisert, og anker bort-teknikken ble brukt til å tømme målproteinet Ctf19 fra kjernen før og etter frigjøringen fra profase I, og etter meiose I kromosomsegregering (figur 1). Denne protokollen kan tilpasses for å tømme andre proteiner av interesse i ethvert stadium av meiose og mitose.
Denne protokollen kombinerer NDT80-in-systemet for å synkronisere celler, anker bort-teknikken for å tømme proteiner fra kjernen, og fluorescens time-lapse-mikroskopi for å avbilde spirende gjærceller under meiose. NDT80-in-systemet er en metode for synkronisering av meiotisk cellesyklus som benytter en profase I-arrestasjon og frigjøring 4,8. Selv om individuelle celler vil variere litt i mengden tid brukt i hvert av de påfølgende meiot…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Light Microscopy Imaging Center ved Indiana University. Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd fra National Institutes of Health (GM105755).
β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
Bacto Agar | BD | 214030 | |
Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |