Summary
Time-lapse mikroskopi er et verdifullt verktøy for å studere meiose i spirende gjær. Denne protokollen beskriver en metode som kombinerer cellesyklussynkronisering, time-lapse-mikroskopi og betinget uttømming av et målprotein for å demonstrere hvordan man studerer funksjonen til et bestemt protein under meiotisk kromosomsegregering.
Abstract
Time-lapse fluorescensmikroskopi har revolusjonert forståelsen av meiotiske cellesyklushendelser ved å gi tidsmessige og romlige data som ofte ikke ses ved å avbilde faste celler. Spirende gjær har vist seg å være en viktig modellorganisme for å studere meiotisk kromosomsegregering fordi mange meiotiske gener er svært konserverte. Time-lapse mikroskopi av meiose i spirende gjær gjør det mulig å overvåke forskjellige meiotiske mutanter for å vise hvordan mutasjonen forstyrrer meiotiske prosesser. Imidlertid fungerer mange proteiner på flere punkter i meiose. Bruk av funksjonstap eller meiotiske nullmutanter kan derfor forstyrre en tidlig prosess, blokkere eller forstyrre den senere prosessen og gjøre det vanskelig å bestemme fenotypene knyttet til hver enkelt rolle. For å omgå denne utfordringen beskriver denne protokollen hvordan proteinene kan bli betinget utarmet fra kjernen i bestemte stadier av meiose mens de overvåker meiotiske hendelser ved hjelp av time-lapse mikroskopi. Spesielt beskriver denne protokollen hvordan cellene synkroniseres i profase I, hvordan anker bort-teknikken brukes til å tømme proteiner fra kjernen i bestemte meiotiske stadier, og hvordan time-lapse-avbildning brukes til å overvåke meiotisk kromosomsegregering. Som et eksempel på bruken av teknikken ble kinetochoreproteinet Ctf19 utarmet fra kjernen på forskjellige tidspunkter under meiose, og antall kromatinmasser ble analysert ved slutten av meiose II. Samlet sett kan denne protokollen tilpasses for å tømme forskjellige nukleære proteiner fra kjernen mens du overvåker de meiotiske divisjonene.
Introduction
Time-lapse fluorescensmikroskopi er et verdifullt verktøy for å studere dynamikken i meiotisk kromosomsegregering i spirende gjær 1,2. Spirende gjærceller kan induseres til å gjennomgå meiose gjennom sult av viktige næringsstoffer. Under meiose gjennomgår cellene en runde kromosomsegregering etterfulgt av to divisjoner for å lage fire meiotiske produkter som pakkes inn i sporer (figur 1). Individuelle celler kan visualiseres gjennom hvert stadium av meiose, noe som genererer romlige og tidsmessige data som lett kan gå glipp av fastcellebilder. Denne protokollen viser hvordan kombinasjon av time-lapse fluorescensmikroskopi med to tidligere etablerte metoder, det induserbare NDT80-systemet (NDT80-in) og anchor away-teknikken, kan brukes til å studere funksjonen til spesifikke proteiner i forskjellige meiotiske stadier.
NDT80-in-systemet er et kraftig verktøy for meiotisk cellesyklussynkronisering som er avhengig av det induserbare uttrykket til den midterste meiosetranskripsjonsfaktoren NDT80 4,5. NDT80-uttrykk kreves for profase I-utgang 6,7. Med NDT80-in-systemet er NDT80 under kontroll av GAL1-10-promotoren i celler som uttrykker Gal4-transkripsjonsfaktoren smeltet sammen med en østrogenreseptor (Gal4-ER)4,5. Fordi Gal4-ER bare kommer inn i kjernen når den er bundet til β-østradiol, arresterer NDT80-in-celler i profase I i fravær av β-østradiol, noe som tillater synkronisering av celler i profase I (figur 1). β-østradiol-addisjon fremmer translokasjonen av Gal4-ER-transkripsjonsfaktoren i kjernen, hvor den binder GAL1-10 for å drive uttrykk for NDT80, noe som fører til synkron inntreden i meiotiske divisjoner. Selv om time-lapse mikroskopi kan utføres uten synkronisering, er fordelen med å bruke synkronisering evnen til å legge til en inhibitor eller et stoff mens cellene er på et bestemt stadium av meiose.
Anker bort-teknikken er et induserbart system der et protein kan utarmes fra kjernen med tilsetning av rapamycin8. Denne teknikken er ideell for å studere nukleære proteiner under celledeling i spirende gjær fordi gjærceller gjennomgår lukket mitose og meiose, hvor kjernemuskulaturen ikke brytes ned. Videre er denne teknikken veldig nyttig for proteiner som har flere funksjoner gjennom meiose. I motsetning til for delesjoner, mutante alleler eller meiotiske nullalleler, kompromitterer ikke fjerning av et målprotein fra kjernen på et bestemt stadium målproteinaktiviteten i tidligere stadier, noe som muliggjør en mer nøyaktig tolkning av resultatene. Ankersystemet benytter shuttling av ribosomale underenheter mellom kjernen og cytoplasma som oppstår ved ribosomal modning8. For å tømme målproteinet fra kjernen, merkes målproteinet med FKBP12-rapamycinbindende domene (FRB) i en stamme der den ribosomale underenheten Rpl13A er merket med FKBP12. Uten rapamycin interagerer ikke FRB og FKBP12, og det FRB-merkede proteinet forblir i kjernen. Ved tilsetning av rapamycin danner rapamycin et stabilt kompleks med FKBP12 og FRB, og komplekset transporteres ut av kjernen på grunn av interaksjonen med Rpl13A (figur 1). For å forhindre celledød ved rapamycintilsetning, har celler tor1-1-mutasjonen av TOR1-genet . I tillegg inneholder disse cellene fpr1Δ , et nullallel av S. cerevisiae FKBP12-proteinet, som forhindrer endogen Fpr1 fra å utkonkurrere Rpl13A-FKBP12 for FRB- og rapamycinbinding. Ankeret bort bakgrunnsmutasjoner, tor1-1 og fpr1Δ, påvirker ikke meiotiske tidspunkter eller kromosomsegregering2.
For å demonstrere nytten av denne teknikken ble kinetochoreproteinet Ctf19 utarmet på forskjellige tidspunkter gjennom meiose. Ctf19 er en komponent i kinetochore som er dispenserbar i mitose, men kreves for riktig kromosomsegregering i meiose 9,10,11,12,13. I meiose kastes kinetochore i profase I, og Ctf19 er viktig for kinetochore re-montering 9,14. For denne protokollen ble celler med NDT80-in-systemet synkronisert, og anker bort-teknikken ble brukt til å tømme målproteinet Ctf19 fra kjernen før og etter frigjøringen fra profase I, og etter meiose I kromosomsegregering (figur 1). Denne protokollen kan tilpasses for å tømme andre proteiner av interesse i ethvert stadium av meiose og mitose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av nødvendige materialer
- Forbered reagenser for vekst og sporulering av gjærceller.
MERK: Hvis spirende gjærstammer er ade2 - og trp1-, supplere alle medier i trinn 1.1.1-1.1.3 med en endelig konsentrasjon på 0,01% adenin og 0,01% tryptofan fra 1% aksjer. Hvis sterilisering av media ved autoklav, legg til disse aminosyrene først etter at reagensene er autoklavert og tillatt å avkjøles til romtemperatur.- For vegetativ vekst, lag 2x syntetisk komplett + dekstrosemedium (2XSC) ved å oppløse 6,7 g gjærnitrogenbase uten aminosyrer, 2 g fullstendig aminosyreblanding og 20 g dekstrose i 500 ml vann. Steriliser blandingen ved autoklavering i 20 minutter ved 121 ° C eller filtrering gjennom et 0,2 μm filter.
- For det første trinnet med sporulering, fremstill 2x syntetisk komplett + acetatmedium (2XSCA) ved å oppløse 6,7 g gjærnitrogenbase uten aminosyrer, 2 g fullstendig aminosyreblanding og 20 g kaliumacetat i 500 ml vann. Steriliser blandingen ved autoklavering i 20 minutter ved 121 ° C eller filtrering gjennom et 0,2 μm filter.
- For det siste trinnet med sporulering, lag 1% kaliumacetat (1% KAc) ved å oppløse 5 g KAc i 500 ml vann. Steriliser blandingen ved autoklavering i 20 minutter ved 121 ° C eller filtrering gjennom et 0,2 μm filter.
- Forbered medisiner og reagenser for mikroskopi, synkronisering og anker bort.
- For å feste celler til dekselet under time-lapse-avbildning, gjør 1 mg / ml koncanavalin A (ConA) i 1x PBS. Filtersteriliser ved hjelp av et 0,2 μm filter og oppbevar små (~ 10 μL) aliquots ved -20 ° C.
- For å bruke NDT80-in-systemet, gjør 2 ml 1 mM β-østradiol oppløst i etanol. Filtersteriliser ved hjelp av et 0,2 μm filter og oppbevar aliquots (~ 500 μL) ved -20 ° C.
- For anker bort systemet, gjør 1 mg / ml rapamycin oppløst i DMSO. Filtersteriliser ved hjelp av et 0,2 μm filter og oppbevar små (~ 10 μL) aliquots ved -20 ° C.
MERK: Forbered små aliquots av rapamycin for å unngå flere fryse-tine sykluser av stoffet.
- Generer gjærstammer som inneholder NDT80-in-systemet (P GAL1,10-NDT80/PGAL1,10-NDT80; GAL4-ER / GAL4-ER) og et målprotein merket med FRB i ankeret bort genetisk bakgrunn (tor1-1 / tor1-1; fpr1Δ / fpr1Δ; Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)4,8. Ctf19-FRB ble brukt i denne studien. I tillegg ble en kopi av histonprotein Htb2 merket med mCherry for å muliggjøre overvåking av meiotisk progresjon og kromatinsegregering.
- Forbered et kammer for time-lapse-avbildning
- Begynn å klargjøre kammeret 6-24 timer før avbildning (figur 2). Klipp et kammer på 18 mm x 18 mm fra pipettespissboksen med en oppvarmet skalpell eller et annet skarpt blad.
- Bruk en plastpipettespiss for å spre et tynt lag silikonforseglingsmiddel rundt de nederste kantene av kammeret som vil feste seg til dekselet. Tilsett nok tetningsmasse slik at kantene på kammeret er helt dekket (se figur 2).
- Fest kammeret til et deksel på 24 mm x 50 mm ved å plassere kammeret forsiktig, tetningsmasse med forsiden ned, på dekselet. Forsikre deg om at det ikke er hull i tetningsmassen slik at kammeret ikke lekker.
- Spred 8-10 μL ConA på dekselet. Dispenser ConA på midten av dekselet og bruk en pipettespiss for å spre ConA i et tynt lag slik at den dekker det meste av dekselet som er omgitt av kammeret.
MERK: Plastkamre kan gjenbrukes på ubestemt tid. Etter at time-lapse-avbildningen er fullført, fjern kammeret fra dekselet ved hjelp av en barberhøvel, rengjør silikonforseglingsmiddelet fra kammeret og hold kamrene nedsenket i 95% etanol for fremtidig bruk.
2. Sporulering av gjærceller
- Utfør følgende trinn for sult av gjærceller for å indusere det meiotiske programmet.
MERK: Disse trinnene er for sporulering av W303-stammen av gjær. Andre stammer kan kreve andre protokoller15. Sporuleringseffektivitet er svært variabel mellom laboratoriestammer, med W303 som viser en sporuleringseffektivitet på ~ 60% 16,17,18.- Ta en enkelt koloni av riktig diploid gjærstamme fra en plate og inokuler 2 ml 2XSC og la vokse ved 30 ° C på en rulletrommel i 12-24 timer til metning.
- Fortynn den mettede kulturen i 2XSCA ved å tilsette 80 μL av kulturen fra trinn 2,1,1 til 2 ml 2XSCA. La den vokse ved 30 °C på en rulletrommel i 12-16 timer. Ikke la stå i 2XSCA i mer enn 16 timer fordi celler kan bli syke eller autofluorescerende.
- Utfør to vasker ved å spinne ned kulturen ved 800 x g ved romtemperatur (25 °C) i 1 min, kaste væsken og resuspendere pelleten i 2 ml sterilt destillert vann.
- Etter den andre vasken, fjern væsken og resuspend pelleten i 2 ml 1% KAc og la den vokse ved 25 ° C på en rulletrommel i 8-12 timer. Celler som har kommet inn i meiose vil arrestere i pachytene av profase I.
- Profase I utgivelsessystem
- Tilsett β-østradiol direkte til sporuleringskulturen til en endelig konsentrasjon på 1 μM og virvle kulturrøret raskt. Den β-østradiol vil frigjøre celler fra profase I.
3. Uttømming av målprotein fra kjernen ved hjelp av anker unna-teknikken
- Tilsett rapamycin til cellene for å tømme det FRB-merkede proteinet fra kjernen på et bestemt stadium.
- For å tømme proteiner fra kjernen ved profase I-utgang, tilsett rapamycin til en endelig konsentrasjon på 1 μg / ml til sporulasjonskulturrøret samtidig som β-østradioltilsetning.
- For å tømme proteiner fra kjernen i et bestemt stadium av meiose, må du overvåke cellesyklusstadiet som starter på 60 minutter etter β-østradiol-tillegg. Hvert 20. minutt, pipette 5 μL kultur på en 24 mm x 40 mm dekselslip og dekk cellene med et deksel på 18 mm x 18 mm. Hold kulturer spinnende på rulletrommelen ved 25 ° C mellom tidspunkter.
- Bilde cellene ved hjelp av A594 / mCherry-filteret og 60x-målet for et fluorescensmikroskop. Sett prosentoverføringen til 2 % og eksponeringstiden til 250 ms. Tilstedeværelsen av en, to eller fire DNA-masser vil indikere det meiotiske stadiet hvor cellene har utviklet seg. Tilsett rapamycin til en endelig konsentrasjon på 1 μg / ml i det meiotiske stadiet av interesse.
- Hold cellene spinnende på rulletrommelen ved 25 °C til de er klare for avbildning. Nukleær uttømming av et målprotein skjer 30-45 minutter etter rapamycintilsetning 2,8.
4. Time-lapse fluorescensmikroskopi
- Lag en agarpute som skal brukes til å lage et monolag av celler for avbildning (se trinn 4.2).
- Klipp av og kast hetten og bunnen 1/3 av et 1,5 ml mikrofugerør for å lage en sylinder. Sylinderen vil tjene som en form for agarputen. Lag to sylindere for å ha en ekstra i tilfelle agar ikke polymeriseres riktig i den første.
- Plasser den kuttede mikrofugerørsylinderen på et rent glassglass med toppen av røret opp ned sittende på lysbildet.
- Lag 6 ml av en 5% agaroppløsning (bruk 1% KAc som løsningsmiddel) i et 50 ml beger og mikrobølgeovn det til agar er fullstendig oppløst.
MERK: Agaren vil lett koke over i mikrobølgeovnen; Se på agar og start og stopp mikrobølgeovnen når agar begynner å koke og virvle begeret. Start og stopp mikrobølgeovnen flere ganger for å oppløse agaren helt. Agaroppløsningen er laget i overkant av mengden som trengs for å sikre at agar oppløses helt. - Klipp av spissen av pipet for å lage en større åpning og pipet ~ 500 μL smeltet agar i hver mikrofuge rørsylinder. La den sitte ved romtemperatur til agaren stivner (~ 10-12 min).
- Forbereder gjærceller for avbildning
- Spinn ned 200 μL av sporuleringskulturen fra trinn 3,2 ved 800 x g i 2 minutter i 1 ml mikrosentrifugerør. Fjern og kast 180 μL av supernatanten. Resuspend pelleten i den gjenværende supernatanten ved å virvle og flikke på røret.
- Pipet 6 μL av de konsentrerte cellene på dekselet i midten av kammeret laget i trinn 1.4.
- Hold sylinderen med agarputen i trinn 4.1 og skyv den forsiktig av glassglasset. Forsikre deg om at agar er helt flatt i bunnen og bruk bunnen av en pipettespiss, bruk en liten mengde trykk på mikrofugeformen slik at agarputen skyves ut litt over rørets grense.
- Inverter formen slik at agarputen vender ned mot kammeret.
- Bruk tang, plasser forsiktig agarputen (fortsatt i mikrofugerørformen) på toppen av cellene. Bruk en pipettespiss til å skyve agarputen forsiktig rundt kammeret 10-20 ganger for å lage et monolag av celler på dekslet.
- La agarputen ligge i kammeret i 12-15 min. Dette trinnet vil tillate cellene å feste seg til ConA på dekselet.
- Overfør 2 ml sporuleringskultur fra trinn 3,2 til to mikrosentrifugerør og spinn ved 15 700 x g i 2 minutter. Overfør supernatanten til rene mikrofugerør og spinn igjen ved 15 700 x g i 2 minutter. Overfør supernatanten til rene mikrosentrifugerør som skal brukes i neste trinn.
MERK: Det er viktig å bruke den forbetingede KAc-supernatanten med β-østradiol og rapamycin for å sikre effektiv sporulering og fortsatt uttømming av proteinet av interesse. - Etter at agarputen har sittet i kammeret i 12-15 minutter, flyter og fjern agarputen før avbildning. For å gjøre det, tilsett 2 ml supernatant fra trinn 4.2.7 dråpevis til kammeret. Når væsken har nådd toppen av kammeret, vil agarputen mest sannsynlig flyte.
MERK: Hvis agarputen ikke flyter automatisk, vent 1-2 min. Hvis agarputen fortsatt ikke flyter, fjern den forsiktig med tang. Ideelt sett ville agarputen flyte på egen hånd fordi fjerning av den før flyting kan føre til fjerning av cellene. - Etter at agarputen har fløt, fjern den forsiktig med tang og kast den. Plasser et deksel på 24 mm x 50 mm på toppen av kammeret for å forhindre fordampning under avbildning.
- Sette opp en film på mikroskopet
MERK: Instruksjonene nedenfor er for et omvendt mikroskop utstyrt med en glidebryter som har plass til dekselet på 24 mm x 50 mm (se materialtabell for detaljer om mikroskop, kamera og programvare). Et 60x olje-nedsenkingsmål brukes til bildeopptak. Denne protokollen må kanskje endres når du bruker andre mikroskoper eller andre lysbildeholdere. De nøyaktige trinnene for å utføre trinn 4.3.2 til og med trinn 4.3.16 vil variere avhengig av mikroskopet og bildebehandlingsprogramvaren som brukes. Se pkt. 4.4 for instruksjoner for et annet mikroskop.- Monter dekselet inne i glidebryteren. Fest støpeleiren til siden av dekselet for å holde den fast i glideholderen.
- Åpne programvaren for bildeinnhenting. Bruk kurs- og finjusteringsknapper for å fokusere cellene ved hjelp av DIC eller brightfield.
- På hovedmenyen i bildeinnhentingsprogramvaren klikker du på Fil > Skaff (Løs 3D). Tre vinduer vil dukke opp.
- I vinduet som heter Resolve 3D, klikk på Erlenmeyer Flask-ikonet . Dette åpner et vindu med tittelen Design/Kjør eksperiment, som inneholder kontrollene for å sette opp et eksperiment for å sette opp en time-lapse-film.
- Under Utforming-fanen navigerer du til fanen merket Seksjonering. Merk av i boksen ved siden av Z-inndeling. Sett z-stablene som følger: Optisk seksjonsavstand = 1 μm, Antall optiske seksjoner = 5, Prøvetykkelse = 5,0 μm.
- Under kanalfanen klikker du på + -ikonet slik at ett kanalalternativ vises. Velg riktig kanal. For dette eksperimentet velger vi A594, som brukes til å avbilde mCherry. Merk av i boksen ved siden av Referansebilde, og angi Z-posisjonen midt i prøven fra rullegardinmenyen.
- Velg en verdi fra rullegardinmenyen ved siden av %T og Exp. for å angi henholdsvis prosent transmittans og eksponeringstid. For dette eksperimentet brukes 2% transmittans og 250 ms eksponeringstid i A594-kanalen, og 10% transmittans og 500 ms eksponeringstid brukes for lysfelt.
MERK: Eksponeringstiden og prosentoverføringen vil variere med forskjellige mikroskoper. For å unngå overeksponering, bruk den laveste prosentvise transmittansen og kortest mulig eksponeringstid som muliggjør riktig visualisering av proteinet av interesse. - Under Time-lapse-fanen merker du av i boksen ved siden av Time-lapse. I tabellen som vises, skriver du inn 10 under kolonnen min i time-lapse-raden og 10 under timer-kolonnen i raden total tid. Dette vil kjøre et tidskurs som tar bilder hvert 10. minutt i 10 timer.
- Merk av i boksen ved siden av Behold fokus med Ultimate Focus for å forhindre scenedrift under filmen. Under kategorien Punkter merker du av i boksen ved siden av Besøk punktliste.
- I hovedmenyen klikker du på Vis > punktliste. Et vindu kalt punktliste vil dukke opp. Flytt scenen til et område av kammeret som viser et monolag av celler. Klikk på Point i punktlistevinduet.
- Flytt scenen for å velge 25-30 punkter uten overlapping for å unngå å overeksponere cellene. Hvert felt vil bli avbildet i løpet av hvert kurs.
- I punktlistevinduet velger du Kalibrer alle for å angi det ultimate fokuset for hvert punkt. Under Design-fanen i Desgin/Kjør eksperiment-vinduet angir du punktverdiområdet (hentet fra punktlistevinduet) i boksen ved siden av Visit Point List. Under Kjør-fanen lagrer du filen til riktig destinasjon på datamaskinen. I vinduet Design/kjør eksperiment velger du Spill av-knappen (grønt trekantikon) for å starte filmen.
- Valgfri metode: Sette opp en film på et mikroskop
MERK: Disse instruksjonene er for et omvendt mikroskop utstyrt med en glidebryter som har plass til en 24 mm x 50 mm deksel. Se Materialtabell for spesifikasjoner for mikroskopet, kameraet og bildebehandlingsprogramvaren som brukes. Et 60x olje-nedsenkingsmål brukes til bildeopptak.- Monter dekselet inne i glidebryteren. Åpne programvaren for bildeinnhenting. Bruk kurs- og finjusteringsknapper for å fokusere celler ved hjelp av DIC eller brightfield. Høyreklikk i det åpne vinduet til programvaren. En rullegardinmeny vises.
- Klikk på Brukeranskaffelseskontroller > Brukeranskaffelse. Klikk på Program > Definer / Kjør eksperiment. Dette åpner et vindu merket ND Acquisition.
- I vinduet som åpnes, merk av i boksen ved siden av XY. Flytt scenen til ønsket sted, og klikk i boksen under Punktnavn for å velge plasseringen som et punkt. Gjenta dette til 25-30 punkter er valgt uten overlapping for å unngå å overeksponere cellene. Hvert felt vil bli avbildet i løpet av hvert kurs.
- Angi prosentvis transmisjon for hver fluorescerende kanal. Fordi stammene produserer Htb2-mCherry, brukes mCherry-filteret her. Under anskaffelsesvinduet som åpnet i trinn 4.3.3, navigerer du til 555 nm-knappen. Still inn prosentoverføringen til 5 % ved å justere glideskalaen under 555 nm-knappen til den leser 5 %.
- Still inn eksponeringstiden for hver fluorescerende kanal. Under Anskaffelse-vinduet velger du 200 ms fra rullegardinmenyen Eksponering.
MERK: Eksponeringstiden og prosentoverføringen vil variere med forskjellige mikroskoper. For å unngå overeksponering, bruk den laveste prosentvise transmittansen og kortest mulig eksponeringstid som muliggjør riktig visualisering av proteinet av interesse. - Klikk på boksen ved siden av Z i ND Acquisition-vinduet . Sett fem z-stabler av gjærcellene som er 1,2 μM fra hverandre.
- Klikk på boksen ved siden av λ. Velg de aktuelle kanalene som skal brukes til eksperimentet. For DIC, sørg for at Hjem er valgt fra rullegardinmenyen under Z pos. For mCherry, sørg for at Alle er valgt fra rullegardinmenyen under Z pos. Dette sikrer at bare en enkelt seksjon (midt i z-stacken) blir tatt for DIC.
- Merk av i boksen ved siden av Tid i ND-anskaffelsesvinduet . Merk av i boksen under Fase. I rullegardinmenyen under Intervall velger du 10 min. Under Varighet velger du 10 timer. Dette vil kjøre tidskurs slik at bilder tas hvert 10. minutt i 10 timer.
5. Analyse av kromatinsegregering
- Åpne Fiji-programvaren. Åpne ett synsfelt om gangen: Åpne DIC- og mCherry-kanalene for hvert felt.
- Ta maksimal intensitetsprojeksjon av mCherry-kanalen for å få et enkelt bilde: klikk på Image > Stacks > Z Project, velg Max Intensity fra rullegardinmenyen.
- Slå sammen DIC- og mCherry-kanalene i ett bilde: klikk på Image > Color > Merge Channels.
- Følg en enkelt celle gjennom meiose. Etter fullført meiosis II, registrer antall DNA-masser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å overvåke kromatinsegregering ble histonprotein Htb2 merket med mCherry. I profase I vises kromatinet som en enkelt Htb2-masse. Etter at homologe kromosomer segregerer i den første meiotiske delingen, fremstår kromatinet som to distinkte masser (figur 3A). Etter at søsterkromatidene segregerer, vises kromatinet som fire masser. Hvis noen kromosomer ikke fester seg til spindelmikrotubuli, kan ytterligere masser ses etter meiose I eller meiose II.
Metoden beskrevet ovenfor ble brukt til å studere rollen til kinetochore-komponenten Ctf19 for å sikre riktig kromosomsegregering i spirende gjærmeiose. Anker bort gjærstammer som uttrykker Ctf19 merket med FRB ble synkronisert i profase I ved hjelp av NDT80-in-systemet (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; CTF19-FRB; GAL1-10 fremmet NDT80; GAL4-ER). Som en kontroll ble det brukt en NDT80-in-belastning med ankeret bort stammebakgrunn, men uten det FRB-merkede proteinet (tor1-1; fpr1Δ; RPL13A-FKBP12; GAL1-10 fremmet NDT80; GAL4-ER). Celler ble frigjort fra profase I-arrestasjonen ved tilsetning av β-østradiol. Rapamycin ble tilsatt for å tømme Ctf19-FRB fra kjernen enten ved frigjøring (før kinetochore-remontering), 45 minutter etter frigjøring (etter kinetochore-remontering, men før meiose I), eller 3 timer etter frigjøring (like før meiose II) (figur 3A-F). Etter tillegg av rapamycin ble time-lapse fluorescensmikroskopi utført, og bilder ble oppnådd hvert 10. minutt for gjenværende varighet av meiose.
Etter bildebehandling ble open access-programvaren Fiji brukt til å åpne bildene og utføre analyser for tall som viser tidsprogresjon (figur 3A-F). Antall DNA-masser etter meiose II ble talt i minst 100 celler som gjennomgikk meiose per tilstand. I villtypeceller med ankerbakgrunnen er det typisk fire DNA-masser på slutten av meiose II, som representerer de fire meioseproduktene (figur 3A). I en liten brøkdel av cellene er bare tre masser synlige etter meiose II (figur 3B,G). Imidlertid er det sannsynlig at tre masser er resultatet av en celle som har fire produkter av meiose, men to av disse massene vises sammen etter meiose II.
Når Ctf19-FRB er forankret bort på tidspunktet for frigjøring av profase I-utgang (t = 0 h), viser omtrent 47% av cellene mer enn fire DNA-masser ved fullføring av meiose, noe som tyder på en defekt i vedlegget av kinetochores og mikrotubuli (figur 3C, G). Ved forankring av Ctf19-FRB enten etter kinetochore-montering, men før meiose I (t = 45 min) eller før meiose II (t = 3 t), viser omtrent 16% av cellene ytterligere DNA-masser. Disse resultatene støtter hypotesen om at Ctf19 er viktig for kinetochore re-montering ved profase I-frigjøring, men er mindre viktig i kromosomsegregering når kinetochore er satt sammen igjen.
Resultatene oppnådd her viser at time-lapse mikroskopi kombinert med cellesyklussynkronisering og betinget uttømming av et målprotein tillater studier av et protein i et bestemt meiotisk stadium. Selv om Ctf19 ikke er avgjørende for mitose, er den meiotiske kinetochore omfattende omorganisert, og Ctf19 har en avgjørende rolle i kinetochore re-montering etter profase I exit 9,11,12. Resultatene i figur 3 viser at når Ctf19 er utarmet før kinetochore re-montering, viser en stor del av cellene ytterligere DNA-masser etter meiose II. Når Ctf19 er utarmet fra kjernen etter kinetochore-remontering, men før enten meiose I eller meiose II, er det færre celler som viser flere DNA-masser. Disse resultatene tyder på at den viktigste rollen for Ctf19 er på slutten av profase I. Denne forskjellen i kromosomsegregeringstroskap med uttømming av Ctf19 på forskjellige stadier fremhever viktigheten av å bruke stadiespesifikke betingede alleler for å studere funksjonen til proteiner spesielt i meiose I eller meiose II. En meiotisk nullmutant ville ha vist en alvorlig defekt og ville ikke ha gitt informasjon om rollen til Ctf19 på hvert trinn.
I tillegg, selv om CTF19 ikke er et essensielt gen, er det en kromosomoverføringstroskap (ctf) fenotype under vegetativ vekst av CTF19 mutanter 19. Bruk av et nullallel eller mutert CTF19-allel kan skape en populasjon av aneuploide celler som kanskje ikke gjennomgår meiose på riktig måte. Bruk av anker bort-teknikken og NDT80-in synkroniseringssystemet omgår dette problemet ved å nøyaktig tømme Ctf19 fra kjernen like før meiose I eller meiose II, noe som reduserer bekymringen for at de analyserte cellene var aneuploide.
Figur 1: Oversikt over eksperimentet. Tegneserie av gjærcelle som viser et enkelt par homologe kromosomer. NDT80-in celler går inn i meiose og arresteres ved profase I. Etter tilsetning av β-østradiol går celler inn i de meiotiske divisjonene synkront. Tilsetning av rapamycin bestemmer når målproteinet (merket med en stjerne) er forankret bort. I dette eksperimentet ble målproteinet Ctf19 forankret bort på tre forskjellige tidspunkter ved å legge til rapamycin (RAP) samtidig som profase I (RAP-addisjon ved t = 0 min), etter profase I-frigjøring (RAP-addisjon ved t = 45 min), og etter meiose I kromosomsegregering (RAP-tillegg ved t = 3 timer). De tykke svarte pilene indikerer cellesyklusstadiet av rapamycintilsetning og derfor målproteinuttømming. Forkortelser: RAP = rapamycin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kammeroppsett for time-lapse-avbildningseksperimenter. (A) Gjenbrukbart kammer (høyre) kuttet fra en pipettespissholderinnsats (venstre). Pipettespissholderinnsatsen er kuttet med et rødglødende blad for å fjerne en 4 kvadratisk x 4 kvadratisk del av innsatsen. De stiplede linjene indikerer en prøveseksjon av spissholderen som kan kuttes for å lage et kammer. De resterende plastdelerne innenfor den 4 kvadrat x 4 kvadratiske utskjæringen er trimmet bort og et hult kammer forblir (høyre). (B) For å lage det endelige kammeret, tilsettes silikonforseglingsmiddel til kanter på den ene siden av kammeret, og plasseres deretter på toppen av en dekkslipp. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Tiden Ctf19 er forankret bort påvirker kromatinsegregeringen. (A-F) Representative time lapse-bilder av celler som uttrykker Htb2-mCherry under meiose. Bilder ble tatt hvert 10. minutt, umiddelbart etter tillegg av β-østradiol. Skala barer = 5 μm. Tall øverst til høyre i hver ramme merker tiden som har gått mellom hver ramme, og tid 0 angir rammen der kromatin segregerer i meiose I. Bare celler som fullførte de meiotiske divisjonene ble talt. (A) Wildtype celle (ingen protein merket med FRB) der β-østradiol ble tilsatt 12 timer etter KAc-overføring. Cellen inneholder fire DNA-masser etter fullføring av meiose II. (B) Ctf19-FRB-celle der rapamycin ble tilsatt ved t = 0 (samtidig med β-østradioltillegg). Denne cellen viser tre DNA-masser etter meiose II. (C) Ctf19-FRB-celle der rapamycin ble tilsatt ved t = 0 (samtidig med β-østradiol-tillegg). Denne cellen viser fem DNA-masser etter meiose II. (D) Ctf19-FRB-celle der rapamycin ble tilsatt ved t = 0 (samtidig med β-østradiol-tillegg). Denne cellen dør etter å ha fullført meiose II. (E) Ctf19-FRB-celle hvor rapamycin ble tilsatt 45 minutter etter β-østradioltillegg. Denne cellen viser fem DNA-masser etter meiose II. (F) Ctf19-FRB-celle der rapamycin ble tilsatt 45 minutter etter β-østradioltillegg. Etter meiose II er seks DNA-masser til stede. (G) Kvantifisering av antall DNA-masser i minst 100 celler for hver tilstand (to filmer analysert for hver tilstand). t = under hver bar indikerer tidspunktet da rapamycin ble tilsatt i forhold til β-østradiol tillegg. Forkortelser: MII = meiose II. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen kombinerer NDT80-in-systemet for å synkronisere celler, anker bort-teknikken for å tømme proteiner fra kjernen, og fluorescens time-lapse-mikroskopi for å avbilde spirende gjærceller under meiose. NDT80-in-systemet er en metode for synkronisering av meiotisk cellesyklus som benytter en profase I-arrestasjon og frigjøring 4,8. Selv om individuelle celler vil variere litt i mengden tid brukt i hvert av de påfølgende meiotiske stadiene, vil de fleste celler opprettholde en høy grad av synkronisering gjennom de meiotiske divisjonene.
Anker bort-teknikken er et tilpasningsdyktig verktøy for mitotiske og meiotiske studier. Ved å endre ankeret bort målprotein og tidspunktet for rapamycintilsetning, kan denne metoden tilpasses for å studere forskjellige proteiner i et hvilket som helst stadium av spirende gjærmeiose. Vanlige metoder for å lage betingede mutanter for å studere spirende gjærmitose er ikke alltid egnet for meiotiske studier. For eksempel krever bruk av en repressibel promotor ofte en endring i karbonkilde for å endre uttrykket av målproteinet, noe som kan forstyrre meiose20. Temperaturfølsomme mutanter er avhengige av en temperaturendring for å redusere eller avskaffe aktiviteten til målproteinet. Mange av disse betingede mutantene kan ikke brukes i meiotiske studier fordi skiftende næringsforhold eller temperatur kan forstyrre meiose21,22,23. Videre kan delesjoner eller mutanter begrense studier av meiose fordi uttrykk for et mutantprotein tidlig i meiose kan blokkere eller påvirke senere stadier negativt. Forankringsteknikken kan omgå disse utfordringene fordi den ikke er avhengig av endringer i ernæring eller temperatur8. Videre kan uttømming av proteinet reguleres midlertidig slik at tidspunktet for rapamycintilsetning bestemmer når proteinet vil bli forankret bort.
En begrensning av anker bort-teknikken er at den kanskje ikke er egnet for ikke-nukleære proteiner fordi den er avhengig av Rpl13A ribosomal subenhet som et anker for å transportere målproteinet ut av kjernen. Imidlertid er det andre anvendelser av anker bort-teknikken ved å endre protein-protein-interaksjonene som også kan være nyttige under meiose, for eksempel forankring av proteiner til komplekser eller tethering dem til membraner8. Tidligere studier viser at nukleær uttømming av målproteiner skjer innen 30 minutter med rapamycintilsetning 2,8. Det er imidlertid mulig at noen proteiner trenger en lengre eller kortere periode for å bli transportert ut av kjernen. For å sikre at målproteinet blir skysset ut av kjernen, kan målproteinet merkes med FRB smeltet til GFP (FRB-GFP) for å overvåke hvor lang tid mellom rapamycintilsetning og nukleær uttømming. En annen begrensning av ankersystemet er at noen proteiner er følsomme for FRB- og FRB-GFP-taggene ved C-terminalen. Som sådan er N-terminal merking av målproteinet med FRB en alternativ strategi for å forankre bort et målprotein.
For å overvåke kromatinsegregering uttrykte spirende gjærceller Htb2-mCherry. I denne stammen er Htb2-proteinet merket ved sitt endogene lokus, noe som sikrer at Htb2 uttrykkes normalt. Andre fluorescerende merkede proteiner kan også brukes til å overvåke ulike aspekter av meiose. Når du konstruerer en stamme for time-lapse-avbildning, er det viktig å vurdere at noen proteiner er følsomme for C-terminale fluorescerende koder. Vekst- og sporuleringsanalyser av stammen som inneholder det fluorescerende merkede proteinet, sikrer at taggen ikke endrer proteinets funksjon. En utfordring med time-lapse fluorescensmikroskopi er å utsette celler for nok fluorescens slik at fluorescerende proteiner oppdages samtidig som celledød eller bremsing av meiose fra overflødig eksponering unngås. Et viktig feilsøkingstrinn er å finne passende mikroskop- og kamerainnstillinger for å oppnå denne balansen. Den nødvendige eksponeringstiden vil variere noe mellom proteiner, så flere iterasjoner av et eksperiment bør utføres for å bestemme riktig eksponeringstid. Når du bruker kammermetoden beskrevet her for time-lapse-avbildningseksperimenter, er et spesielt følsomt trinn å oppnå et monolag av celler som skal avbildes. Uten et monolag akkumuleres celler oppå hverandre, noe som gir en utfordring for riktig bildebehandling og dataanalyse. Å bruke en agarpute, som hjelper cellene til å feste seg til ConA og sprer celler rundt kammeret, er en billig og effektiv måte å skaffe monolag på. Å flytte agarputen for å spre celler rundt kammeret slik at et monolag oppnås, kan være utfordrende. Å sikre at agarputen gjør svært små bevegelser under flytteprosessen, kan hjelpe til med å lage et monolag. Å lage et gjenbrukbart kammer muliggjør billig generering av time-lapse-bildedata. Med riktig rengjøring og desinfisering kan plastkamrene beskrevet her gjenbrukes på ubestemt tid. Det er best praksis at kamrene fjernes fra dekselet umiddelbart etter time-lapse-avbildning og lagres i 95% etanol til neste bruk.
Time-lapse-avbildning gir informasjon om cellesyklusen som kan gå glipp av fra avbildning av faste celler 1,2. For eksempel, når man overvåker varigheten av de meiotiske stadiene, kan variasjoner mellom enkeltceller undersøkes mer nøyaktig når man avbilder levende celler sammenlignet med populasjoner av faste celler. Fordi gjærproteiner lett kan merkes med fluorescerende proteiner, kan kobling av fluorescens time-lapse-avbildning med NDT80-in-systemet og ankeroperasjonsteknikken tilpasses for ytterligere studier, for eksempel overvåking av individuell kromosomsegregering og tidspunktet for spesifikke meiotiske stadier. Når du overvåker cellesyklusprogresjon etter profase I-frigjøring i NDT80-in-celler, er det avgjørende å ha et protein merket med et fluorescerende molekyl som vil markere stadiene av meiose. Individuelle kromosomer kan overvåkes gjennom meiose ved å integrere gjentakelser av lac operon (LacO) nær sentromere av et kromosom i celler som uttrykker LacI-GFP. LacI-GFP binder seg tett til LacO og visualiseres som et lyst fokus, som kan følges gjennom de meiotiske divisjonene ved time-lapse mikroskopi24,25. Ulike proteiner med fluorescerende koder har blitt brukt til å overvåke varigheten av meiotiske stadier. Disse inkluderer Tub1, den α-tubulin-underenheten som inkorporerer i mikrotubuli; Zip1, en komponent i det synaptonemale komplekset; og Spc42, en spindelstangkroppskomponent 1,2,26,27.
Avslutningsvis inkorporerer denne metoden meiotisk cellesyklussynkronisering, betinget uttømming av et målprotein og time-lapse fluorescensmikroskopi for å studere meiotisk kromosomsegregering. Ved å avbilde spirende gjærceller under meiose og bruke betingede mutanter som bare påvirker de tiltenkte stadiene av meiose, kan denne metoden gi nøyaktige data om meiotisk cellesyklus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Light Microscopy Imaging Center ved Indiana University. Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd fra National Institutes of Health (GM105755).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
References
- Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
- Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).
- van Werven, F. J., Amon, A. Regulation of entry into gametogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).
- Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
- Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).
- Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).
- Chu, S., Herskowitz, I. Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80. Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Borek, W. E., et al. The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly. Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).
- Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).
- Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).
- Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).
- Fernius, J., Marston, A. L. Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3. PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).
- Meyer, R. E., et al. Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).
- Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).
- Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).
- Ben-Ari, G., et al. Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast. PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).
- Primig, M., et al. The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).
- Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).
- Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
- Byers, B., Goetsch, L. Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature. Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).
- Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Robinett, C., et al. C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).
- Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).
- Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72 (3), 365-378 (1993).
- Scherthan, H., et al. Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).
