Summary

Bruk av time-lapse mikroskopi og trinnspesifikk nukleær uttømming av proteiner for å studere meiose i S. cerevisiae

Published: October 11, 2022
doi:

Summary

Time-lapse mikroskopi er et verdifullt verktøy for å studere meiose i spirende gjær. Denne protokollen beskriver en metode som kombinerer cellesyklussynkronisering, time-lapse-mikroskopi og betinget uttømming av et målprotein for å demonstrere hvordan man studerer funksjonen til et bestemt protein under meiotisk kromosomsegregering.

Abstract

Time-lapse fluorescensmikroskopi har revolusjonert forståelsen av meiotiske cellesyklushendelser ved å gi tidsmessige og romlige data som ofte ikke ses ved å avbilde faste celler. Spirende gjær har vist seg å være en viktig modellorganisme for å studere meiotisk kromosomsegregering fordi mange meiotiske gener er svært konserverte. Time-lapse mikroskopi av meiose i spirende gjær gjør det mulig å overvåke forskjellige meiotiske mutanter for å vise hvordan mutasjonen forstyrrer meiotiske prosesser. Imidlertid fungerer mange proteiner på flere punkter i meiose. Bruk av funksjonstap eller meiotiske nullmutanter kan derfor forstyrre en tidlig prosess, blokkere eller forstyrre den senere prosessen og gjøre det vanskelig å bestemme fenotypene knyttet til hver enkelt rolle. For å omgå denne utfordringen beskriver denne protokollen hvordan proteinene kan bli betinget utarmet fra kjernen i bestemte stadier av meiose mens de overvåker meiotiske hendelser ved hjelp av time-lapse mikroskopi. Spesielt beskriver denne protokollen hvordan cellene synkroniseres i profase I, hvordan anker bort-teknikken brukes til å tømme proteiner fra kjernen i bestemte meiotiske stadier, og hvordan time-lapse-avbildning brukes til å overvåke meiotisk kromosomsegregering. Som et eksempel på bruken av teknikken ble kinetochoreproteinet Ctf19 utarmet fra kjernen på forskjellige tidspunkter under meiose, og antall kromatinmasser ble analysert ved slutten av meiose II. Samlet sett kan denne protokollen tilpasses for å tømme forskjellige nukleære proteiner fra kjernen mens du overvåker de meiotiske divisjonene.

Introduction

Time-lapse fluorescensmikroskopi er et verdifullt verktøy for å studere dynamikken i meiotisk kromosomsegregering i spirende gjær 1,2. Spirende gjærceller kan induseres til å gjennomgå meiose gjennom sult av viktige næringsstoffer. Under meiose gjennomgår cellene en runde kromosomsegregering etterfulgt av to divisjoner for å lage fire meiotiske produkter som pakkes inn i sporer (figur 1). Individuelle celler kan visualiseres gjennom hvert stadium av meiose, noe som genererer romlige og tidsmessige data som lett kan gå glipp av fastcellebilder. Denne protokollen viser hvordan kombinasjon av time-lapse fluorescensmikroskopi med to tidligere etablerte metoder, det induserbare NDT80-systemet (NDT80-in) og anchor away-teknikken, kan brukes til å studere funksjonen til spesifikke proteiner i forskjellige meiotiske stadier.

NDT80-in-systemet er et kraftig verktøy for meiotisk cellesyklussynkronisering som er avhengig av det induserbare uttrykket til den midterste meiosetranskripsjonsfaktoren NDT80 4,5. NDT80-uttrykk kreves for profase I-utgang 6,7. Med NDT80-in-systemet er NDT80 under kontroll av GAL1-10-promotoren i celler som uttrykker Gal4-transkripsjonsfaktoren smeltet sammen med en østrogenreseptor (Gal4-ER)4,5. Fordi Gal4-ER bare kommer inn i kjernen når den er bundet til β-østradiol, arresterer NDT80-in-celler i profase I i fravær av β-østradiol, noe som tillater synkronisering av celler i profase I (figur 1). β-østradiol-addisjon fremmer translokasjonen av Gal4-ER-transkripsjonsfaktoren i kjernen, hvor den binder GAL1-10 for å drive uttrykk for NDT80, noe som fører til synkron inntreden i meiotiske divisjoner. Selv om time-lapse mikroskopi kan utføres uten synkronisering, er fordelen med å bruke synkronisering evnen til å legge til en inhibitor eller et stoff mens cellene er på et bestemt stadium av meiose.

Anker bort-teknikken er et induserbart system der et protein kan utarmes fra kjernen med tilsetning av rapamycin8. Denne teknikken er ideell for å studere nukleære proteiner under celledeling i spirende gjær fordi gjærceller gjennomgår lukket mitose og meiose, hvor kjernemuskulaturen ikke brytes ned. Videre er denne teknikken veldig nyttig for proteiner som har flere funksjoner gjennom meiose. I motsetning til for delesjoner, mutante alleler eller meiotiske nullalleler, kompromitterer ikke fjerning av et målprotein fra kjernen på et bestemt stadium målproteinaktiviteten i tidligere stadier, noe som muliggjør en mer nøyaktig tolkning av resultatene. Ankersystemet benytter shuttling av ribosomale underenheter mellom kjernen og cytoplasma som oppstår ved ribosomal modning8. For å tømme målproteinet fra kjernen, merkes målproteinet med FKBP12-rapamycinbindende domene (FRB) i en stamme der den ribosomale underenheten Rpl13A er merket med FKBP12. Uten rapamycin interagerer ikke FRB og FKBP12, og det FRB-merkede proteinet forblir i kjernen. Ved tilsetning av rapamycin danner rapamycin et stabilt kompleks med FKBP12 og FRB, og komplekset transporteres ut av kjernen på grunn av interaksjonen med Rpl13A (figur 1). For å forhindre celledød ved rapamycintilsetning, har celler tor1-1-mutasjonen av TOR1-genet . I tillegg inneholder disse cellene fpr1Δ , et nullallel av S. cerevisiae FKBP12-proteinet, som forhindrer endogen Fpr1 fra å utkonkurrere Rpl13A-FKBP12 for FRB- og rapamycinbinding. Ankeret bort bakgrunnsmutasjoner, tor1-1 og fpr1Δ, påvirker ikke meiotiske tidspunkter eller kromosomsegregering2.

For å demonstrere nytten av denne teknikken ble kinetochoreproteinet Ctf19 utarmet på forskjellige tidspunkter gjennom meiose. Ctf19 er en komponent i kinetochore som er dispenserbar i mitose, men kreves for riktig kromosomsegregering i meiose 9,10,11,12,13. I meiose kastes kinetochore i profase I, og Ctf19 er viktig for kinetochore re-montering 9,14. For denne protokollen ble celler med NDT80-in-systemet synkronisert, og anker bort-teknikken ble brukt til å tømme målproteinet Ctf19 fra kjernen før og etter frigjøringen fra profase I, og etter meiose I kromosomsegregering (figur 1). Denne protokollen kan tilpasses for å tømme andre proteiner av interesse i ethvert stadium av meiose og mitose.

Protocol

1. Forberedelse av nødvendige materialer Forbered reagenser for vekst og sporulering av gjærceller.MERK: Hvis spirende gjærstammer er ade2 – og trp1-, supplere alle medier i trinn 1.1.1-1.1.3 med en endelig konsentrasjon på 0,01% adenin og 0,01% tryptofan fra 1% aksjer. Hvis sterilisering av media ved autoklav, legg til disse aminosyrene først etter at reagensene er autoklavert og tillatt å avkjøles til romtemperatur.For vegetativ vekst, lag 2x syntetisk kom…

Representative Results

For å overvåke kromatinsegregering ble histonprotein Htb2 merket med mCherry. I profase I vises kromatinet som en enkelt Htb2-masse. Etter at homologe kromosomer segregerer i den første meiotiske delingen, fremstår kromatinet som to distinkte masser (figur 3A). Etter at søsterkromatidene segregerer, vises kromatinet som fire masser. Hvis noen kromosomer ikke fester seg til spindelmikrotubuli, kan ytterligere masser ses etter meiose I eller meiose II. Metoden …

Discussion

Denne protokollen kombinerer NDT80-in-systemet for å synkronisere celler, anker bort-teknikken for å tømme proteiner fra kjernen, og fluorescens time-lapse-mikroskopi for å avbilde spirende gjærceller under meiose. NDT80-in-systemet er en metode for synkronisering av meiotisk cellesyklus som benytter en profase I-arrestasjon og frigjøring 4,8. Selv om individuelle celler vil variere litt i mengden tid brukt i hvert av de påfølgende meiot…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Light Microscopy Imaging Center ved Indiana University. Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd fra National Institutes of Health (GM105755).

Materials

β-estradiol Millipore Sigma E8875 Make 1mM stocks in 95% EtOH
0.22 uM Threaded Bottle-top Filter Millipore Sigma S2GPT02RE
100% EtOH Fisher Scientific 22-032-601
10X PBS Fisher Scientific BP399500 Dilute 1:10 to use as solvent for ConA
24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 VWR North American 48393241
25 mm x 75 mm microscope slides VWR North American 48300-026
Adenine hemisulfate salt Millipore Sigma A9126 To supplement SC, SCA, and 1% Kac
Bacto Agar BD 214030
Concanavialin A Mllipore Sigma C2010 Make as 1mg/mL in 1X PBS
CoolSNAP HQ2 CCD camera Photometrics Used in Section 4.3
D-glucose Fisher Scientific D16-10
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids BD 291920
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore Sigma D5879
Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope Nikon Used in Section 4.4
Fiji NIH Download from https://fiji.sc/
GE Personal DeltaVision Microscope Applied Precision Used in Section 4.3
L-Tryptophan  Millipore Sigma T0254 To supplement SC, SCA, and 1% Kac
Modeling Clay Crayola  2302880000 To secure coverslip in slide holder
NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software Nikon Used in Section 4.4
ORCA-Fustion BT Camera Hamamatsu C15440-20UP Used in Section 4.4
Plastic pipette tip holder Dot Scientific LTS1000-HR Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. 
Pottassium Acetate Fisher Scientific BP264
Rapamycin Fisher Scientific BP29631 Make 1mg/mL stocks in DMSO
Silicone Sealant Aqueon 100165001 Also known as aquarium glue.
SoftWorx7.0.0  Imaging Software Applied Precision Used in Section 4.3
Synthetic Complete Mixture (Kaiser)  Formedium DSCK2500
Type N immersion oil  Nikon MXA22166

References

  1. Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
  2. Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation. Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136 (2020).
  3. van Werven, F. J., Amon, A. Regulation of entry into gametogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).
  4. Carlile, T. M., Amon, A. Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin. Cell. 133 (2), 280-291 (2008).
  5. Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2. Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).
  6. Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).
  7. Chu, S., Herskowitz, I. Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80. Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).
  8. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  9. Borek, W. E., et al. The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly. Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).
  10. Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).
  11. Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore. Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).
  12. Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).
  13. Fernius, J., Marston, A. L. Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3. PLoS Genetics. 5 (9), 1000629 (2009).
  14. Meyer, R. E., et al. Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).
  15. Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).
  16. Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast. Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).
  17. Ben-Ari, G., et al. Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast. PLoS Genetics. 2 (11), 195 (2006).
  18. Primig, M., et al. The core meiotic transcriptome in budding yeasts. Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).
  19. Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).
  20. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  21. Byers, B., Goetsch, L. Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature. Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).
  22. Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).
  23. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  24. Robinett, C., et al. C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).
  25. Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion. Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).
  26. Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis. Cell. 72 (3), 365-378 (1993).
  27. Scherthan, H., et al. Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).

Play Video

Cite This Article
Cairo, G., MacKenzie, A., Tsuchiya, D., Lacefield, S. Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae. J. Vis. Exp. (188), e64580, doi:10.3791/64580 (2022).

View Video