مسبار دقيق للقياس الإشعاعي داخل الأنسجة لقياس الإشعاع في الموقع في الأنسجة الحية
Summary
في هذا البحث ، تم وصف طريقة لقياس الإشراق في الموقع في الأنسجة الحية. يتضمن هذا العمل تفاصيل عن بناء مجسات صغيرة الحجم لقياسات مختلفة للإشعاع والإشعاع ، ويوفر إرشادات لتركيب الأنسجة لتوصيف الإشعاع ، ويحدد الطرق الحسابية لتحليل البيانات الناتجة.
Abstract
تبدو الكائنات الحية معتمة إلى حد كبير لأن طبقات أنسجتها الخارجية تتشتت بقوة للضوء الساقط. عادة ما يكون للصبغات الممتصة بقوة ، مثل الدم ، امتصاص ضيق ، بحيث يمكن أن يكون متوسط المسار الحر للضوء خارج قمم الامتصاص طويلا جدا. نظرا لأن الناس لا يستطيعون الرؤية من خلال الأنسجة ، فإنهم يتخيلون عموما أن الأنسجة مثل الدماغ والدهون والعظام تحتوي على القليل من الضوء أو لا تحتوي على أي ضوء. ومع ذلك ، يتم التعبير عن بروتينات أوبسين المستجيبة للضوء داخل العديد من هذه الأنسجة ، ووظائفها غير مفهومة بشكل جيد. الإشراق الداخلي للأنسجة مهم أيضا لفهم التمثيل الضوئي. على سبيل المثال ، يمتص المحار العملاق بقوة ولكنه يحافظ على عدد كثيف من الطحالب في عمق الأنسجة. يمكن أن يكون انتشار الضوء من خلال أنظمة مثل الرواسب والأغشية الحيوية معقدا ، ويمكن أن تكون هذه المجتمعات مساهما رئيسيا في إنتاجية النظام الإيكولوجي. لذلك ، تم تطوير طريقة لبناء مجسات دقيقة ضوئية لقياس الإشعاع القياسي (تدفق الفوتون يتقاطع مع نقطة) وإشعاع هبوط البئر (تدفق الفوتون الذي يعبر المستوى بشكل عمودي) لفهم هذه الظواهر داخل الأنسجة الحية بشكل أفضل. هذه التقنية قابلة للتتبع أيضا في المختبرات الميدانية. هذه المجسات الدقيقة مصنوعة من ألياف بصرية مسحوبة بالحرارة يتم تثبيتها بعد ذلك في ماصات زجاجية مسحوبة. لتغيير القبول الزاوي للمسبار ، يتم بعد ذلك تثبيت كرة بحجم 10-100 ميكرومتر من الإيبوكسي القابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية الممزوج بثاني أكسيد التيتانيوم في نهاية الألياف المسحوبة والمشذبة. يتم إدخال المسبار في الأنسجة الحية ، ويتم التحكم في موضعه باستخدام micromanipulator. هذه المجسات قادرة على قياس إشعاع الأنسجة في الموقع بدقة مكانية تتراوح بين 10 و 100 ميكرومتر أو على مقياس الخلايا المفردة. تم استخدام هذه المسابير لتوصيف الضوء الذي يصل إلى الخلايا الدهنية وخلايا الدماغ 4 مم تحت جلد الفأر الحي ولتوصيف الضوء الذي يصل إلى أعماق مماثلة داخل أنسجة البطلينوس العملاقة الغنية بالطحالب الحية.
Introduction
والمثير للدهشة أن الحيوانات البرية وسكان المحيطات الضحلة لديهم ما يكفي من الضوء داخل أجسامهم لعلم وظائف الأعضاء البصرية وحتى التمثيل الضوئي. على سبيل المثال ، يتم تخفيف مستويات الضوء في وسط رأس الفأر (خارج نطاقات امتصاص الهيموغلوبين القوية) بثلاثة أو أربعة أوامر من حيث الحجم بالنسبة للعالم الخارجي. هذا هو الفرق تقريبا بين مستويات الإضاءة في الداخل والخارج. لذا ، فإن عتامة الأنسجة أو المواد بسبب التشتت القوي ليست هي نفسها العتامة بسبب امتصاص الضوء القوي. يمكن للضوء أن يستمر في الانتشار لمسافات طويلة في نظام تشتت قوي إلى الأمام ، على غرار الضوء الذي ينتشر عبر الأنظمة المائية ذات التركيزات العالية من الخلايا والجسيمات1. هذه الملاحظة بارزة بشكل خاص في ضوء حقيقة أن بروتينات الأوبسين يتم التعبير عنها في كل مكان تقريبا في جميع أنسجة جميع الحيوانات. وبالتالي ، من المهم أن نفهم كيف وأين يتم تخفيف الضوء وتشتيته داخل الأنسجة الحية. ومع ذلك ، على عكس الأنظمة المائية ، مع الأنسجة الحية ، من المستحيل غمر أداة في عمود الماء والحصول على قياسات الإشعاع والإشعاع ، ومن الضروري استخدام تقنية جديدة.
تشمل الطرق الأخرى المستخدمة سابقا لتوصيف خصائص الامتصاص والتشتت للأنسجة الحية قياس مجسات انعكاس الأنسجة و / أو دمج المجالات2،3 ، والطرق المجهرية مثل المسح المجهري متحد البؤر4 ، وقياس انتشار ضوء الليزر على السطح5 ، وتقنيات النمذجة مثل النقل الإشعاعي لمونت كارلو6. غالبا ما تتطلب الطرق التجريبية المذكورة معدات محددة وكبيرة ومكلفة أو معرفة مفصلة حول بنية الأنسجة وهي محدودة بشكل عام في قدرتها على توصيف البنية المكانية للضوء في عمق الأنسجة.
هناك أيضا طرق مماثلة قائمة على المسبار تستخدم إبرة تحت الجلد لإدخال ألياف بصرية من خلال الأنسجة7،8،9. في تجربتنا ، الإبر المعدلة فعالة في ثقب الأنسجة ولكنها تتطلب قوة كبيرة وتمزق الأنسجة الحساسة بشكل عام عند المرور عبر الخلايا المعبأة بكثافة. لذلك ، تتطلب هذه الإبر عموما إجراء جراحيا لإدخال أكثر من ملليمتر أو نحو ذلك في طبقة الأنسجة. الطريقة الموصوفة هنا ، باستخدام دعامة زجاجية مشحمة ومسحوبة ، قادرة على الانزلاق بين الخلايا مع الحد الأدنى من جرح الأنسجة وبدون جراحة إضافية.
تقدم هذه المخطوطة طريقة مستوحاة من عمل يورغنسون وزملائه على قياس الضوء داخل حصائر الطحالب10،11، باستخدام مجسات مجهرية بصرية مدعومة بالزجاج وإلكترونيات محمولة قابلة للسبر العميق في الأنسجة الكثيفة والبناء والاستخدام في هذا المجال. يمكن بناء هذه المجسات لتوصيف الإشعاع القياسي (الضوء الذي يضرب نقطة من جميع الاتجاهات) وإشعاع هبوط القاع (الضوء الذي يتقاطع مع مستوى أفقي) داخل الأنسجة الحية بدقة مكانية عالية. تم تطوير هذه المسابير في الأصل لقياس الانتقال الإشعاعي داخل أنسجة المحار العملاق الضوئي12. لم تكن القياسات القياسية لامتصاص وانتقال الأنسجة الكلية كافية لتوصيف أداء التمثيل الضوئي للأنسجة ، لأنه يحدث فرقا كبيرا سواء تم امتصاص كل الضوء الساقط من قبل عدد قليل من الخلايا التي تعاني من كثافة عالية على سطح النسيج أو العديد من الخلايا التي تعاني من كثافة منخفضة في جميع أنحاء حجم النسيج. في مشروع ثان ، تم استخدام هذه المجسات لقياس الإشعاع في الجسم الحي داخل دماغ الفأر13,14 ، وبالتالي تمييز البيئة الضوئية للأوبسينات المعبر عنها في أعماق الدماغ. هذه المجسات الدقيقة صغيرة وحساسة بما يكفي لقياس الإشعاع داخل أنسجة دماغ الفأر مع سلامة جميع الفراء والجلد والعظام وإثبات أن مستويات الضوء الفسيولوجي مرتفعة بسهولة بما يكفي لتحفيز عمليات الدماغ العميقة.
يمكن أن يكون هذا المسبار البصري الدقيق وإعداد القياس مفيدا للباحثين الذين يحتاجون إلى تحديد وتوصيف الضوء الداخلي للأنسجة البيولوجية ، خاصة من أجل فهم أكثر دقة لعملية التمثيل الضوئي أو وظائف الأصباغ البصرية المعبر عنها خارج العينين. يمكن استخدام هذه الطريقة بمفردها أو بالاقتران مع تقنيات أخرى لتوصيف الخصائص البصرية وانتشار الضوء داخل الأنسجة الحية بشكل كامل بتكلفة منخفضة ، مع معدات محمولة صغيرة مدمجة داخليا وذات معلمات قابلة للتعديل تعتمد على المهام.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول تقنية لتوصيف البيئة البصرية بشكل منهجي من خلال حجم كبير من الأنسجة الحية بدقة مكانية تقريبا على نطاق الخلايا المفردة. يمكن أن تكون هذه الطريقة غير المكلفة والمرنة والقابلة للتتبع الميداني مفيدة لأي باحث يدرس انتشار الضوء داخل الأنظمة الحية. من التجربة ، مقارنة بالطرق ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون ساناز فاهيدينيا على تعريفنا بزملاء الدكتور يورغنسن وعمله. تم دعم هذا البحث بمنح من مكتب أبحاث الجيش (رقم W911NF-10-0139) ، ومكتب البحوث البحرية (من خلال جائزة MURI رقم N00014-09-1-1053) ، وجائزة NSF-INSPIRE NSF-1343158.
Materials
| 1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31 | Edmond Optics | 37-935 | Part 2 of manipulator for lowering sample |
| 1/4" thick acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K754 | For making Petri dish holder |
| 3/4" mini spring clamp | Anvil | 99693 | Use as weight for pulling optical fiber |
| 8 mm biopsy punch | Fisher Scientific | NC9324386 | For tissue sample |
| Butane Torch | McMaster-Carr | MT-51 | Heat source for pulling fiber and pipette |
| Collimating lens | Thorlabs | LLG5A1-A | To collimate light source through liquid light guide |
| Compressed air | McMaster-Carr | 7437K35 | For drying pulled fiber and pipette |
| Cyanoacrylate glue – liquid | McMaster-Carr | 66635A31 | For securing tapered fiber end at top of pulled pipette |
| Electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps |
| Fine grade carborundum paper | McMaster-Carr | 4649A24 | Small triangle on exacto knife holder works well |
| Gelatin | Knox | 10043000048679 | For securing the tissue biopsy in the petri dish |
| Glass Pasteur Pipete | Fisher Scientific | 13-678-20B | Disposable glass pipette 5.75" in length |
| Insulin syringes, 31G needle | BD | 320440 | For applying glue |
| Isopropanol | McMaster-Carr | 54845T42 | For cleaning pulled fiber and pipette |
| Kimwipe | Cole-Parmer | SKU 33670-04 | For wiping optical fiber and glass pipette clean |
| LED driver | Thorlabs | LEDD1B | For powering the UV LEDs |
| Light source for measurements | Cole-Parmer | UX-78905-05 | Low heat white light source for measurements |
| Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage | Edmond Optics | 55-023 | Part 1 of manipulator for lowering sample |
| Liquid light guide | Thorlabs | LLG5-4T | For light source in measurements |
| Magnetic feet | Siskiyou | MGB 8-32 | For use with magnetic strips |
| Magnetic strips | Siskiyou | MS-6.0 | For mounting magnetically to breadboard |
| Manipulator #1 | Siskiyou | MX10R | 4-axis manipulator with pipette holder |
| Opaquer pen, small | WindowTint | TOP01 | For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe |
| Optical breadboard | Edmond Optics | 03-640 | For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source |
| Optical fibers | Ocean Optics | P-100-2-UV-VIS | About 4 fibers are good to have |
| Plasma light source | Thorlabs | HPLS345 | For tissue radiometry measurements |
| Plastic plier clamp | McMaster-Carr | 5070A11 | Plier clamp used for weight in pulling pipette |
| Polystyrene Petri dishes | Thomas scientific | 3488N10 | Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top |
| Razor blades | McMaster-Carr | 3962A3 | For stripping jacketing from optical fiber |
| Silicone oil lubricant | Thomas scientific | 1232E30 | For reducing friction between probe and tissue |
| Software for analyzing data | Matlab | Chosen software for data analysis | |
| Spectrometer + spectrometer software | Avantes | AvaSpec-2048L | Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer |
| Titanium dioxide powder | Sigma Aldrich | 718467-100G | For making scattering sphere |
| Toolour tabletop clip | Toolour | Toolour0004 | For holding pipette while pulling and for holding finished probes |
| Trigger-action bar clamps | mcMaster-Carr | 51755A2 | Good for holding optical fibers while pulling or curing |
| UV curable adhesive | Delo Photobond | GB368 | For making scattering sphere |
| UV light source | Thorlabs | M365FP1 | Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time |
| White LED light source | Thorlabs | MCWHF2 | For characterizing pulled fiber and scattering sphere |
References
- Williams, J. Optical properties of the ocean. Reports on Progress in Physics. 36 (12), 1567-1608 (2001).
- Solonenko, M., et al. In vivo reflectance measurement of optical properties, blood oxygenation and motexafin lutetium uptake in canine large bowels, kidneys and prostates. Physics in Medicine & Biology. 47 (6), 857-873 (2002).
- Vásquez-Elizondo, R. M., Enríquez, S. Light absorption in coralline algae (Rhodophyta): A morphological and functional approach to understanding species distribution in a coral reef lagoon. Frontiers in Marine Science. 4, 393 (2017).
- Samatham, R. Optical properties of mutant versus wild-type mouse skin measured by reflectance-mode confocal scanning laser microscopy (rCSLM). Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041309 (2008).
- Dimofte, A., Finlay, J. C., Zhu, T. C. A method for determination of the absorption and scattering properties interstitially in turbid media. Physics in Medicine & Biology. 50 (10), 2291-2311 (2005).
- Wang, L., Jacques, S. L., Zheng, L. MCML-Monte Carlo modeling of light transport in multi-layered tissues. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 47 (2), 131-146 (1995).
- Wangpraseurt, D., Larkum, A. W. D., Ralph, P. J., Kühl, M. Light gradients and optical microniches in coral tissues. Frontiers in Microbiology. 3, 316 (2012).
- Garcia-Pichel, F. A SCALAR IRRADIANCE FIBER-OPTIC MICROPROBE FOR THE MEASUREMENT OF ULTRAVIOLET RADIATION AT HIGH SPATIAL RESOLUTION. Photochemistry and Photobiology. 61 (3), 248-254 (1995).
- Rickelt, L. F. Fiber-Optic Probes for Small-Scale Measurements of Scalar Irradiance. Photochemistry and Photobiology. 92 (2), 331-342 (2016).
- Jorgensen, B. B. A simple fiber-optic microprobe for high resolution light measurements: Application in marine sediment. Limnology and Oceanography. 31 (6), 1376-1383 (1986).
- Kühl, M., Lassen, C., Jørgensen, B. B. Optical properties of microbial mats: Light measurements with fiber-optic microprobes. Microbial Mats. NATO ASI Series. 35, (1994).
- Holt, A. L., Vahidinia, S., Gagnon, Y. L., Morse, D. E., Sweeney, A. M. Photosymbiotic giant clams are transformers of solar flux. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140678 (2014).
- Nayak, G., et al. Adaptive thermogenesis in mice is enhanced by opsin 3-dependent adipocyte light sensing. Cell Reports. 30 (3), 672-686 (2020).
- Zhang, K. X., et al. Violet-light suppression of thermogenesis by opsin 5 hypothalamic neurons. Nature. 585 (7825), 420-425 (2020).
