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Summary

In questo articolo, viene descritto un metodo per misurare la radianza in situ nei tessuti viventi. Questo lavoro include dettagli sulla costruzione di sonde su microscala per diverse misurazioni di radianza e irradianza, fornisce una guida per il montaggio del tessuto per la caratterizzazione della radianza e delinea metodi computazionali per analizzare i dati risultanti.

Abstract

Gli organismi appaiono opachi in gran parte perché i loro strati di tessuto esterno sono fortemente dispersi alla luce incidente; I pigmenti fortemente assorbenti, come il sangue, hanno tipicamente assorbanze strette, in modo tale che il percorso libero medio della luce al di fuori dei picchi di assorbanza può essere piuttosto lungo. Poiché le persone non possono vedere attraverso i tessuti, generalmente immaginano che tessuti come il cervello, il grasso e le ossa contengano poca o nessuna luce. Tuttavia, le proteine opsina fotosensibili sono espresse all’interno di molti di questi tessuti e le loro funzioni sono poco conosciute. La luminosità interna al tessuto è anche importante per comprendere la fotosintesi. Ad esempio, le vongole giganti assorbono fortemente ma mantengono una densa popolazione di alghe in profondità nel tessuto. La propagazione della luce attraverso sistemi come sedimenti e biofilm può essere complessa e queste comunità possono contribuire in modo significativo alla produttività dell’ecosistema. Pertanto, è stato sviluppato un metodo per costruire microsonde ottiche per misurare l’irraggiamento scalare (flusso di fotoni che interseca un punto) e l’irradianza downwelling (flusso di fotoni che attraversa un piano perpendicolarmente) per comprendere meglio questi fenomeni all’interno del tessuto vivente. Questa tecnica è trattabile anche nei laboratori sul campo. Queste microsonde sono costituite da fibre ottiche estratte dal calore che vengono poi fissate in pipette di vetro tirato. Per modificare l’accettazione angolare della sonda, una sfera di dimensioni 10-100 μm di resina epossidica polimerizzabile ai raggi UV mescolata con biossido di titanio viene quindi fissata all’estremità di una fibra tirata e tagliata. La sonda viene inserita nel tessuto vivente e la sua posizione viene controllata utilizzando un micromanipolatore. Queste sonde sono in grado di misurare la radianza dei tessuti in situ a risoluzioni spaziali di 10-100 μm o sulla scala di singole cellule. Queste sonde sono state utilizzate per caratterizzare la luce che raggiunge le cellule adipose e cerebrali 4 mm sotto la pelle di un topo vivente e per caratterizzare la luce che raggiunge profondità simili all’interno del tessuto di vongole giganti ricco di alghe viventi.

Introduction

Sorprendentemente, gli animali terrestri e gli abitanti dell’oceano poco profondi hanno abbastanza luce all’interno del loro corpo per la fisiologia visiva e persino la fotosintesi. Ad esempio, i livelli di luce al centro della testa di un topo (al di fuori delle forti bande di assorbimento dell’emoglobina) sono attenuati di tre o quattro ordini di grandezza rispetto al mondo esterno. Questa è all’incirca la differenza tra i livelli di luce all’interno e all’esterno. Quindi, l’opacità di un tessuto o materiale dovuta a una forte dispersione non è la stessa dell’opacità dovuta al forte assorbimento della luce. La luce può continuare a propagarsi su lunghe distanze in un sistema fortemente diffuso in avanti, simile alla luce che si propaga attraverso sistemi acquatici con alte concentrazioni di cellule e particelle¹. Questa osservazione è particolarmente saliente alla luce del fatto che le proteine opsina sono espresse quasi ubiquitariamente in tutti i tessuti di tutti gli animali. Pertanto, è importante capire come e dove la luce viene attenuata e dispersa all’interno del tessuto vivente. Tuttavia, a differenza dei sistemi acquatici, con i tessuti viventi, è impossibile immergere uno strumento nella colonna d’acqua e ottenere misurazioni di radianza e irraggiamento, ed è necessaria una nuova tecnica.

Altri metodi precedentemente utilizzati per caratterizzare le proprietà di assorbimento e diffusione dei tessuti viventi includono la misurazione di sonde di riflettanza tissutale e / o l’integrazione di sfere^2,3, metodi microscopici come la microscopia confocale a scansione^4, la misurazione della diffusione della luce laser sulla superficie⁵ e tecniche di modellazione come il trasferimento radiativo Monte Carlo⁶. I metodi sperimentali menzionati spesso richiedono attrezzature specifiche, grandi e costose o conoscenze dettagliate sulla struttura del tessuto e sono generalmente limitati nella loro capacità di caratterizzare la struttura spaziale della luce in profondità all’interno del tessuto.

Esistono anche metodi simili basati su sonde che utilizzano un ago ipodermico per inserire una fibra ottica attraverso il tessuto ^7,8,9. Nella nostra esperienza, gli aghi modificati sono efficaci nel perforare i tessuti, ma richiedono una forza considerevole e generalmente strappano i tessuti delicati quando passano attraverso cellule densamente imballate. Pertanto, questi aghi richiedono generalmente una procedura chirurgica per inserire più di un millimetro o giù di lì in uno strato di tessuto. Il metodo qui descritto, utilizzando un supporto di vetro lubrificato e tirato, è in grado di scivolare tra le cellule con ferite minime del tessuto e senza ulteriori interventi chirurgici.

Questo manoscritto presenta un metodo ispirato al lavoro di Jorgenson e colleghi sulla misurazione della luce all’interno delle stuoie algali^10,11, utilizzando microsonde ottiche supportate da vetro ed elettronica portatile che sono suscettibili di sondare in profondità nel tessuto denso e di costruzione e uso sul campo. Queste sonde possono essere costruite per caratterizzare l’irradianza scalare (luce che colpisce un punto da tutte le direzioni) e la radianza discendente (luce che interseca un piano orizzontale) all’interno del tessuto vivente ad alte risoluzioni spaziali. Queste sonde sono state originariamente sviluppate per misurare il trasferimento radiativo all’interno del tessuto delle vongole giganti fotosimbionti¹². Le misurazioni standard di assorbimento e trasmissione del tessuto totale non erano sufficienti per caratterizzare le prestazioni fotosintetiche del tessuto, poiché fa una grande differenza se tutta la luce incidente viene assorbita da poche cellule che sperimentano un’alta intensità sulla superficie del tessuto o molte cellule che sperimentano basse intensità in tutto il volume del tessuto. In un secondo progetto, queste sonde sono state utilizzate per misurare l’irradianza in vivo all’interno del cervello di un topo^13,14, caratterizzando così l’ambiente luminoso delle opsine espresse in profondità nel cervello. Queste micro-sonde sono sia piccole che abbastanza sensibili da misurare l’irradianza all’interno del tessuto cerebrale del topo con tutta la pelliccia, la pelle e le ossa intatte e dimostrano che i livelli di luce fisiologica sono abbastanza alti da stimolare le opsine cerebrali profonde.

Questa sonda micro-ottica e la configurazione di misurazione potrebbero essere utili ai ricercatori che hanno bisogno di quantificare e caratterizzare la luce interna al tessuto biologico, in particolare per una comprensione più sfumata della fotosintesi o delle funzioni dei pigmenti visivi espressi al di fuori degli occhi. Questo metodo può essere utilizzato da solo o in combinazione con altre tecniche per caratterizzare completamente le proprietà ottiche e la propagazione della luce all’interno dei tessuti viventi a basso costo, con piccole apparecchiature portatili costruite internamente e con parametri regolabili dipendenti dal compito.

Protocol

Questo studio è conforme a tutte le normative etiche pertinenti dell’Università di Yale in materia di ricerca sugli animali vertebrati e invertebrati. 1. Costruire la microsonda ottica Costruzione del manicotto di vetro, materiale: pipetta Pasteur, 5.75 in(vedi tabella dei materiali)Utilizzando una clip a coccodrillo montabile (Table of Materials), montare la pipetta di vetro dall’estremità larga in modo che l’estremità c…

Representative Results

Questo protocollo descrive la procedura per la costruzione di una sonda micro-ottica che può essere utilizzata per misurare l’irradianza downwelling (la luce che raggiunge un punto da una direzione) o, con l’aggiunta di una punta sferica a diffusione di luce, per misurare l’irradianza scalare (la luce che raggiunge un punto da tutte le direzioni). Queste sonde possono misurare l’irradianza a risoluzioni spaziali che si avvicinano alle scale di lunghezza delle singole cellule all’interno del tessuto vivente. Questo proto…

Discussion

Questo protocollo descrive una tecnica per caratterizzare sistematicamente l’ambiente ottico attraverso un grande volume di tessuto vivente con una risoluzione spaziale approssimativamente sulla scala delle singole cellule. Questo metodo economico, flessibile e trattabile sul campo potrebbe essere utile a tutti i ricercatori che studiano la propagazione della luce all’interno dei sistemi viventi. Per esperienza, rispetto ai metodi esistenti⁷, queste sonde richiedono un po ‘più di pratica e abilit…

Materials

1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31	Edmond Optics	37-935	Part 2 of manipulator for lowering sample
1/4" thick acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K754	For making Petri dish holder
3/4" mini spring clamp	Anvil	99693	Use as weight for pulling optical fiber
8 mm biopsy punch	Fisher Scientific	NC9324386	For tissue sample
Butane Torch	McMaster-Carr	MT-51	Heat source for pulling fiber and pipette
Collimating lens	Thorlabs	LLG5A1-A	To collimate light source through liquid light guide
Compressed air	McMaster-Carr	7437K35	For drying pulled fiber and pipette
Cyanoacrylate glue – liquid	McMaster-Carr	66635A31	For securing tapered fiber end at top of pulled pipette
Electrical tape	McMaster-Carr	76455A21	For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps
Fine grade carborundum paper	McMaster-Carr	4649A24	Small triangle on exacto knife holder works well
Gelatin	Knox	10043000048679	For securing the tissue biopsy in the petri dish
Glass Pasteur Pipete	Fisher Scientific	13-678-20B	Disposable glass pipette 5.75" in length
Insulin syringes, 31G needle	BD	320440	For applying glue
Isopropanol	McMaster-Carr	54845T42	For cleaning pulled fiber and pipette
Kimwipe	Cole-Parmer	SKU 33670-04	For wiping optical fiber and glass pipette clean
LED driver	Thorlabs	LEDD1B	For powering the UV LEDs
Light source for measurements	Cole-Parmer	UX-78905-05	Low heat white light source for measurements
Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage	Edmond Optics	55-023	Part 1 of manipulator for lowering sample
Liquid light guide	Thorlabs	LLG5-4T	For light source in measurements
Magnetic feet	Siskiyou	MGB 8-32	For use with magnetic strips
Magnetic strips	Siskiyou	MS-6.0	For mounting magnetically to breadboard
Manipulator #1	Siskiyou	MX10R	4-axis manipulator with pipette holder
Opaquer pen, small	WindowTint	TOP01	For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe
Optical breadboard	Edmond Optics	03-640	For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source
Optical fibers	Ocean Optics	P-100-2-UV-VIS	About 4 fibers are good to have
Plasma light source	Thorlabs	HPLS345	For tissue radiometry measurements
Plastic plier clamp	McMaster-Carr	5070A11	Plier clamp used for weight in pulling pipette
Polystyrene Petri dishes	Thomas scientific	3488N10	Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top
Razor blades	McMaster-Carr	3962A3	For stripping jacketing from optical fiber
Silicone oil lubricant	Thomas scientific	1232E30	For reducing friction between probe and tissue
Software for analyzing data	Matlab		Chosen software for data analysis
Spectrometer + spectrometer software	Avantes	AvaSpec-2048L	Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer
Titanium dioxide powder	Sigma Aldrich	718467-100G	For making scattering sphere
Toolour tabletop clip	Toolour	Toolour0004	For holding pipette while pulling and for holding finished probes
Trigger-action bar clamps	mcMaster-Carr	51755A2	Good for holding optical fibers while pulling or curing
UV curable adhesive	Delo Photobond	GB368	For making scattering sphere
UV light source	Thorlabs	M365FP1	Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time
White LED light source	Thorlabs	MCWHF2	For characterizing pulled fiber and scattering sphere