生体組織の その場で 放射輝度を測定するための組織内放射測定マイクロプローブ
Summary
本論文では、生体組織の その場で 放射輝度を測定する方法について説明します。この作業には、放射輝度と放射照度のさまざまな測定のためのマイクロスケールプローブの構築の詳細が含まれ、放射輝度の特性評価のための組織を取り付けるためのガイダンスを提供し、結果のデータを分析するための計算方法の概要を説明します。
Abstract
生物が不透明に見えるのは、主にその外側の組織層が入射光に対して強く散乱しているためです。血液などの強く吸収する顔料は、通常、吸光度が狭いため、吸光度ピークの外側の光の平均自由行程は非常に長くなる可能性があります。人々は組織を通して見ることができないので、彼らは一般的に脳、脂肪、骨のような組織にはほとんどまたはまったく光が含まれていないと想像します。しかし、光応答性オプシンタンパク質はこれらの組織の多くで発現しており、その機能はほとんどわかっていません。組織内部の放射輝度も光合成を理解するために重要です。たとえば、巨大なアサリは強く吸収しますが、組織の奥深くに藻類の密集した集団を維持します。堆積物やバイオフィルムなどのシステムを通る光の伝播は複雑になる可能性があり、これらのコミュニティは生態系の生産性に大きく貢献する可能性があります。そこで、生体組織内部のこれらの現象をよりよく理解するために、スカラー放射照度(点と交差する光子束)とダウンウェル放射照度(平面と垂直に交差する光子束)を測定するための光マイクロプローブを構築する方法が開発されました。この手法は、フィールドラボでも扱いやすいです。これらのマイクロプローブは、熱引きされた光ファイバから作られ、引っ張られたガラスピペットに固定されます。プローブの角度受容を変えるために、二酸化チタンと混合されたUV硬化型エポキシの10〜100μmサイズの球を、引っ張ってトリミングしたファイバーの端に固定します。プローブを生体組織に挿入し、マイクロマニピュレーターを用いてその位置を制御する。これらのプローブは、10〜100μmの空間分解能または単一細胞のスケールでin situ 組織放射輝度を測定することができます。これらのプローブは、生きているマウスの皮膚から4 mm下の脂肪細胞と脳細胞に到達する光を特徴付け、生きている藻類が豊富な巨大なハマグリ組織内で同様の深さに到達する光を特徴付けるために使用されました。
Introduction
驚いたことに、陸上動物や浅い海の住人は、視覚生理学や光合成さえものに十分な光を体内に持っています。たとえば、マウスの頭の中心(強いヘモグロビン吸光度バンドの外側)の光レベルは、外界に対して3〜4桁減衰します。これは、屋内と屋外の光レベルの違いです。したがって、強い散乱による組織または材料の不透明度は、強い光吸収による不透明度と同じではありません。光は、高濃度の細胞や粒子を含む水系を伝播する光と同様に、強い前方散乱系で長距離を伝播し続けることができます1。この観察は、オプシンタンパク質がすべての動物のすべての組織にほぼ遍在的に発現しているという事実に照らして特に顕著です。したがって、生体組織内で光がどのようにどこで減衰および散乱されるかを理解することが重要です。しかし、水生系とは異なり、生体組織では、機器を水柱に浸して放射輝度と放射照度の測定値を取得することは不可能であり、新しい技術が必要です。
生体組織の吸収および散乱特性を特徴付けるために以前に使用された他の方法には、組織反射率プローブおよび/または積分球2,3の測定、走査型共焦点顕微鏡4などの微視的方法、表面上のレーザー光の拡散の測定5、およびモンテカルロ放射伝達6などのモデリング技術が含まれる。.言及された実験方法は、多くの場合、組織構造に関する特定の、大型で高価な機器または詳細な知識を必要とし、一般に、組織の深部にある光の空間構造を特徴付ける能力に制限があります。
皮下注射針を使用して組織7、8、9を通して光ファイバを挿入する同様のプローブベースの方法もあります。私たちの経験では、修飾針は組織を穿刺するのに効果的ですが、かなりの力を必要とし、密集した細胞を継代するときに一般的に繊細な組織を引き裂きます。したがって、これらの針は一般に、組織層に1ミリメートル程度以上挿入するための外科的処置を必要とする。ここで説明する方法は、潤滑された引っ張りガラス支持体を使用して、組織の最小限の傷で、追加の手術なしで細胞間を滑ることができる。
この原稿は、高密度組織の深部までプローブし、現場での構築と使用に適したガラス支持光学マイクロプローブとポータブル電子機器を使用して、藻類マット10,11内の光を測定するというJorgensonらの研究に触発された方法を提示します。これらのプローブは、生体組織内のスカラー放射照度(あらゆる方向から点に当たる光)とダウンウェル放射輝度(水平面と交差する光)を高い空間分解能で特徴付けるように構築できます。これらのプローブはもともと、光共生型オオハマグリ12の組織内の放射伝達を測定するために開発されました。全組織の吸収と透過の標準的な測定は、すべての入射光が組織の表面で高強度を経験している少数の細胞によって吸収されるか、組織の体積全体で低強度を経験している多くの細胞によって吸収されるかに大きな違いがあるため、組織の光合成性能を特徴付けるのに十分ではありませんでした。第2のプロジェクトでは、これらのプローブを使用して、マウスの脳内の生体内放射照度を測定し13,14、それによって脳の深部で発現するオプシンの光環境を特徴付けた。これらのマイクロプローブは、すべての毛皮、皮膚、骨をそのままにしてマウス脳組織内の放射照度を測定するのに十分な小型で感度が高く、生理学的光レベルが脳深部オプシンを刺激するのに十分高いことを示しています。
このマイクロ光学プローブと測定セットアップは、特に光合成や目の外で発現される視覚色素の機能をより微妙に理解するために、生体組織内部の光を定量化および特性評価する必要がある研究者に役立つ可能性があります。この方法は、単独で、または他の技術と組み合わせて使用 して、社内に構築された小型のポータブル機器とタスク依存の調整可能なパラメータを使用して、生体組織内の光学特性と光伝播を低コストで完全に特徴付けることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、ほぼ単一細胞のスケールの空間分解能で大量の生体組織を通して光学環境を体系的に特徴付けるための技術を記述しています。この安価で柔軟性があり、フィールド扱いやすい方法は、生体システム内での光の伝播を研究する研究者に役立つ可能性があります。経験から、既存の方法7と比較して、これらのプローブは構築するのにもう少し練習とスキル…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ヨルゲンセン博士の同僚と彼の研究を紹介してくれたSanaz Vahidiniaに感謝します。この研究は、陸軍研究局(番号W911NF-10-0139)、海軍研究局(MURI賞番号N00014-09-1-1053)、およびNSF-INSPIRE賞NSF-1343158からの助成金によって支援されました。
Materials
| 1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31 | Edmond Optics | 37-935 | Part 2 of manipulator for lowering sample |
| 1/4" thick acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K754 | For making Petri dish holder |
| 3/4" mini spring clamp | Anvil | 99693 | Use as weight for pulling optical fiber |
| 8 mm biopsy punch | Fisher Scientific | NC9324386 | For tissue sample |
| Butane Torch | McMaster-Carr | MT-51 | Heat source for pulling fiber and pipette |
| Collimating lens | Thorlabs | LLG5A1-A | To collimate light source through liquid light guide |
| Compressed air | McMaster-Carr | 7437K35 | For drying pulled fiber and pipette |
| Cyanoacrylate glue – liquid | McMaster-Carr | 66635A31 | For securing tapered fiber end at top of pulled pipette |
| Electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps |
| Fine grade carborundum paper | McMaster-Carr | 4649A24 | Small triangle on exacto knife holder works well |
| Gelatin | Knox | 10043000048679 | For securing the tissue biopsy in the petri dish |
| Glass Pasteur Pipete | Fisher Scientific | 13-678-20B | Disposable glass pipette 5.75" in length |
| Insulin syringes, 31G needle | BD | 320440 | For applying glue |
| Isopropanol | McMaster-Carr | 54845T42 | For cleaning pulled fiber and pipette |
| Kimwipe | Cole-Parmer | SKU 33670-04 | For wiping optical fiber and glass pipette clean |
| LED driver | Thorlabs | LEDD1B | For powering the UV LEDs |
| Light source for measurements | Cole-Parmer | UX-78905-05 | Low heat white light source for measurements |
| Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage | Edmond Optics | 55-023 | Part 1 of manipulator for lowering sample |
| Liquid light guide | Thorlabs | LLG5-4T | For light source in measurements |
| Magnetic feet | Siskiyou | MGB 8-32 | For use with magnetic strips |
| Magnetic strips | Siskiyou | MS-6.0 | For mounting magnetically to breadboard |
| Manipulator #1 | Siskiyou | MX10R | 4-axis manipulator with pipette holder |
| Opaquer pen, small | WindowTint | TOP01 | For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe |
| Optical breadboard | Edmond Optics | 03-640 | For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source |
| Optical fibers | Ocean Optics | P-100-2-UV-VIS | About 4 fibers are good to have |
| Plasma light source | Thorlabs | HPLS345 | For tissue radiometry measurements |
| Plastic plier clamp | McMaster-Carr | 5070A11 | Plier clamp used for weight in pulling pipette |
| Polystyrene Petri dishes | Thomas scientific | 3488N10 | Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top |
| Razor blades | McMaster-Carr | 3962A3 | For stripping jacketing from optical fiber |
| Silicone oil lubricant | Thomas scientific | 1232E30 | For reducing friction between probe and tissue |
| Software for analyzing data | Matlab | Chosen software for data analysis | |
| Spectrometer + spectrometer software | Avantes | AvaSpec-2048L | Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer |
| Titanium dioxide powder | Sigma Aldrich | 718467-100G | For making scattering sphere |
| Toolour tabletop clip | Toolour | Toolour0004 | For holding pipette while pulling and for holding finished probes |
| Trigger-action bar clamps | mcMaster-Carr | 51755A2 | Good for holding optical fibers while pulling or curing |
| UV curable adhesive | Delo Photobond | GB368 | For making scattering sphere |
| UV light source | Thorlabs | M365FP1 | Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time |
| White LED light source | Thorlabs | MCWHF2 | For characterizing pulled fiber and scattering sphere |
References
- Williams, J. Optical properties of the ocean. Reports on Progress in Physics. 36 (12), 1567-1608 (2001).
- Solonenko, M., et al. In vivo reflectance measurement of optical properties, blood oxygenation and motexafin lutetium uptake in canine large bowels, kidneys and prostates. Physics in Medicine & Biology. 47 (6), 857-873 (2002).
- Vásquez-Elizondo, R. M., Enríquez, S. Light absorption in coralline algae (Rhodophyta): A morphological and functional approach to understanding species distribution in a coral reef lagoon. Frontiers in Marine Science. 4, 393 (2017).
- Samatham, R. Optical properties of mutant versus wild-type mouse skin measured by reflectance-mode confocal scanning laser microscopy (rCSLM). Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041309 (2008).
- Dimofte, A., Finlay, J. C., Zhu, T. C. A method for determination of the absorption and scattering properties interstitially in turbid media. Physics in Medicine & Biology. 50 (10), 2291-2311 (2005).
- Wang, L., Jacques, S. L., Zheng, L. MCML-Monte Carlo modeling of light transport in multi-layered tissues. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 47 (2), 131-146 (1995).
- Wangpraseurt, D., Larkum, A. W. D., Ralph, P. J., Kühl, M. Light gradients and optical microniches in coral tissues. Frontiers in Microbiology. 3, 316 (2012).
- Garcia-Pichel, F. A SCALAR IRRADIANCE FIBER-OPTIC MICROPROBE FOR THE MEASUREMENT OF ULTRAVIOLET RADIATION AT HIGH SPATIAL RESOLUTION. Photochemistry and Photobiology. 61 (3), 248-254 (1995).
- Rickelt, L. F. Fiber-Optic Probes for Small-Scale Measurements of Scalar Irradiance. Photochemistry and Photobiology. 92 (2), 331-342 (2016).
- Jorgensen, B. B. A simple fiber-optic microprobe for high resolution light measurements: Application in marine sediment. Limnology and Oceanography. 31 (6), 1376-1383 (1986).
- Kühl, M., Lassen, C., Jørgensen, B. B. Optical properties of microbial mats: Light measurements with fiber-optic microprobes. Microbial Mats. NATO ASI Series. 35, (1994).
- Holt, A. L., Vahidinia, S., Gagnon, Y. L., Morse, D. E., Sweeney, A. M. Photosymbiotic giant clams are transformers of solar flux. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140678 (2014).
- Nayak, G., et al. Adaptive thermogenesis in mice is enhanced by opsin 3-dependent adipocyte light sensing. Cell Reports. 30 (3), 672-686 (2020).
- Zhang, K. X., et al. Violet-light suppression of thermogenesis by opsin 5 hypothalamic neurons. Nature. 585 (7825), 420-425 (2020).
