Summary

Anrikning av vuxna musdorsala rotganglier neuronkulturer genom immunpanorering

Published: February 24, 2023
doi:

Summary

Detta dokument beskriver ett immunpanoreringsprotokoll för vuxna musdorsala rotganglier. Genom att fästa antikroppar mot odlingsplattor kan vi negativt välja och ta bort icke-neuronala celler. Vi visar att kulturerna är berikade för neuroner med hjälp av detta protokoll, vilket möjliggör en djupgående studie av neuronala svar på manipulation.

Abstract

Dorsalrotganglierna (DRG) är perifera strukturer intill ryggmärgens dorsala horn, som rymmer cellkropparna hos sensoriska neuroner såväl som olika andra celltyper. Publicerade odlingsprotokoll hänvisar ofta till hela dissocierade DRG-kulturer som neuronala, trots närvaron av fibroblaster, Schwann-celler, makrofager och lymfocyter. Medan dessa hela DRG-kulturer är tillräckliga för avbildningsapplikationer där neuroner kan urskiljas baserat på morfologi eller färgning, är protein- eller RNA-homogenat som samlats in från dessa kulturer inte primärt neuronala ursprung. Här beskriver vi en immunpanoreringssekvens för odlade mus-DRG. Målet med denna metod är att berika DRG-kulturer för neuroner genom att ta bort andra celltyper. Immunopanering avser en metod för att avlägsna celltyper genom att vidhäfta antikroppar mot cellodlingsrätter. Med hjälp av dessa rätter kan vi negativt välja mot och minska antalet fibroblaster, immunceller och Schwann-celler i odling. Denna metod tillåter oss att öka andelen neuroner i kulturer.

Introduction

Dorsalrotganglierna (DRG) rymmer cellkropparna i de sensoriska neuronerna som innerverar perifera vävnader. Genom att studera dessa neuroner kan vi förstå den mekanistiska grunden för smärta och sensoriska tillstånd. DRG består emellertid inte av neuroner ensamma, utan innehåller också fibroblaster, Schwann-celler, makrofager och andra immunceller1. Trots närvaron av dessa olika celltyper kallas hela DRG-kulturer ofta i litteraturen som neuronala 2,3. Dessa kulturer är fortfarande användbara för neuronal undersökning genom avbildning eller flödescytometri, vilket skulle möjliggöra neuronal identifiering genom färgning, cellstorlek och / eller morfologi. För analyser såsom polymeraskedjereaktion (PCR) eller western blotting, där kulturer homogeniseras för RNA- eller proteinuppsamling, kan närvaron av icke-neuronala celltyper störa resultaten. Därför finns det ett behov av att öka andelen neuronala celler i DRG-kulturer.

Immunopanering är en teknik som används för att rena en mängd olika celltyper, inklusive kortikala neuroner, astrocyter, oligodendrocytprekursorceller och mikroglia. Enkelt uttryckt innebär det att en antikropp vidhäftas mot en cellytemarkör till en petriskål, avsedd att binda vissa celler (figur 1), och den kan användas för att välja antingen för eller mot celltyper av intresse 4,5,6. Immunpanorering av embryonala DRG hos råtta för att selektera mot icke-neuronala celler har tidigare beskrivits av Zuchero7. Vi har dock inte kunnat hitta ett immunopanoreringsprotokoll specifikt för DRG hos möss. I detta protokoll bygger vi vidare på de grundläggande klienterna i Zuchero-protokollet, men anpassade istället immunopanoreringssekvensen för att berika vuxna DRG-kulturer hos möss (figur 2). Detta är ett kraftfullt verktyg för att studera etablerade sensoriska neuroner i kultur. Det är fördelaktigt eftersom det möjliggör användning av vuxna möss från genetiska, sjukdoms- och skademodeller, så att deras sensoriska neuroner kan studeras med större specificitet.

Detta protokoll är fördelaktigt för läsare som vill öka andelen neuroner i vuxna mus DRG-kulturer. Emellertid kan immunpanoreringsstegen också utelämnas, och detta protokoll kan också användas för hela DRG-kulturer.

Protocol

Alla djurförsök utfördes med godkännande från University of Alberta Health Sciences Animal Care and Use Committee (protokoll 0000274). 1. Beredning av reagens För dag 1, förbered följande reagens: vatten av cellodlingskvalitet; Poly-D-lysin – Bered en stam genom att rekonstituera hela flaskan i 50 ml vatten av odlingskvalitet till en lagerkoncentration på 100 μg/ml, förvara vid 4 °C och späd stammen 1:10 i vatten av odlingskvalitet till en slutlig koncen…

Representative Results

De fasta cellerna färgade med DAPI och β3-tubulin avbildades sedan med ett konfokalt screeningsystem med högt innehåll. Bilder analyserades med lämplig kommersiell programvara för att bestämma procentandelen DAPI-positiva celler som sammärktes med β3-tubulin (figur 3). Hela DRG-kulturer bestämdes ha 42,36% ± 6,4% β3-tubulinfärgning, och immunpanerade DRG-kulturer bestämdes ha 71,44% ±7,43% β3-tubulinfärgning. Detta avslöjar en signifikant ökning av neuronal anrikning med i…

Discussion

Detta immunpanoreringsprotokoll ökar andelen neuronala celler i DRG-primärkulturer. För bästa resultat bör dissektioner göras i tid, och DRG bör trimmas av överflödiga nerver. Dissociationssteget bör övervakas noggrant och bör inte överstiga 1 h för att förhindra att cellerna utsätts för onödig stress. När det gäller immunpanorering specifikt bör varje platta försiktigt snurras halvvägs för att cellerna ska få tillgång till de belagda antikropparna. Plattorna bör också ses under ett odlingsmik…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av ett projektbidrag från Canadian Institutes of Health Research (FRN-162434) och ett Discovery Grant från MS Society of Canada (EGID-3761). Författarna vill tacka Dr. Sun och Cross Cancer Institute för utbildning och användning av ImageXpress-systemet.

Materials

0.2 um Syringe filters Fisher 723-2520
100 mm petri dishes ThermoFisher FB0875712
24 well black glass-bottom plates Cellvis P24-1.5H-N
70 um cell strainer Cedarlane 15-1070-1(BI)
B27+ supplement Gibco A3582801
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906 for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%)
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A4161 for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%)
CD45 antibody BD Pharmigen 550539
DAPI Invitrogen D1306
DMEM Gibco 11960069
DNAse Worthington LS002007 for stemxyme solution and panning buffer
D-PBS Sigma Aldrich D8662
EBSS Sigma Aldrich E6267 for DNAse solution
Filter paper P8 grade ThermoFisher 09-795K for 8% PFA
Glutamax ThermoFisher 35050061
goat-anti-mouse IgG Jackson Immunoresearch 115-005-020 for O4 dish 
goat-anti-rabbit 488 Invitrogen A11008
goat-anti-rabbit IgG Jackson Immunoresearch 115-005-003 for PDGFRB dish
goat-anti-rat IgG Jackson Immunoresearch 115-005-044 for CD45 dish
HBSS -/- Sigma Aldrich 14175145
Insulin Sigma Aldrich I2643
laminin Invitrogen 23017-015
N-acetyl cysteine Sigma Aldrich A8199
Neurobasal Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
O4 antibody n/a n/a Hybridoma
Ovomucoid trypsin inhibitor Cedarlane LS003086 for low ovo
paraformaldehyde prills Sigma Aldrich 441244 for 8% PFA
PDGFRB antibody Abcam AB32570
penicillin/ streptomycin Gibco 15140-122
Poly-D-Lysine Sigma Aldrich P6407
Progesterone Sigma Aldrich P8783 for SATO
Putrescine dihydrochrloride  Sigma Aldrich P5780 for SATO
Sodium phosphate dibasic Fisher S374-1 for 0.2 M PB
Sodium Phosphate monobasic dihydrate Sigma Aldrich 04269 for 0.2 M PB
Sodium Pyruvate ThermoFisher 11360070
Sodium Selenite Sigma Aldrich S5261 for SATO
Stemxyme I Cedarlane LS004107 for tissue dissociation; combination collagenase
Transferrin Sigma Aldrich T1147 for SATO
Tris-HCl Millipore Sigma T5941
trypan blue Gibco 15250-061
β3-Tubulin Sigma-Aldrich T2200

References

  1. Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. Human dorsal root ganglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 271 (2019).
  2. Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
  3. Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569 (2018).
  4. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  5. Nolle, A., et al. Enrichment of Glial Cells From Human Post-mortem Tissue for Transcriptome and Proteome Analysis Using Immunopanning. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 772011 (2021).
  6. Barres, B. A. Designing and troubleshooting immunopanning protocols for purifying neural cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (12), 1342-1347 (2014).
  7. Zuchero, J. B. Purification of dorsal root ganglion neurons from rat by immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (8), 826-838 (2014).
  8. Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Developmental Biology. 83 (2), 311-327 (1981).
  9. Sommer, I., Schachner, M. Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes. Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).
  10. Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Research. Brain Research Reviews. 48 (3), 457-476 (2005).
  11. Viveiros, A., et al. In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss. Cells. 11 (3), 351 (2022).

Play Video

Cite This Article
Maguire, A. D., Plemel, J. R., Kerr, B. J. Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning. J. Vis. Exp. (192), e64603, doi:10.3791/64603 (2023).

View Video