Summary

Testa cancerimmunotherapeutics i en humaniserad musmodell som bär mänskliga tumörer

Published: December 16, 2022
doi:

Summary

Detta protokoll beskriver genereringen av möss med humant immunsystem (HIS) för immunonkologistudier. Instruktioner och överväganden vid användning av denna modell för testning av humana immunotherapeutics på humana tumörer implanterade i denna modell presenteras med tonvikt på att karakterisera det mänskliga immunsystemets svar på tumören.

Abstract

Att vända den immunsuppressiva naturen hos tumörmikromiljön är avgörande för framgångsrik behandling av cancer med immunterapiläkemedel. Murina cancermodeller är extremt begränsade i sin mångfald och lider av dålig översättning till kliniken. För att fungera som en mer fysiologisk preklinisk modell för immunterapistudier har detta protokoll utvecklats för att utvärdera behandlingen av humana tumörer i en mus rekonstituerad med ett humant immunsystem. Detta unika protokoll visar utvecklingen av humant immunsystem (HIS, “humaniserad”) möss, följt av implantation av en mänsklig tumör, antingen en cellinjehärledd xenograft (CDX) eller en patienthärledd xenograft (PDX). HIS-möss genereras genom att injicera CD34 + humana hematopoetiska stamceller isolerade från navelsträngsblod i neonatal BRGS (BALB / c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα) mycket immunbristfälliga möss som också kan acceptera en xenogen tumör. Betydelsen av kinetiken och egenskaperna hos det mänskliga immunsystemets utveckling och tumörimplantation betonas. Slutligen beskrivs en fördjupad utvärdering av tumörmikromiljön med hjälp av flödescytometri. I många studier med användning av detta protokoll fann man att tumörmikromiljön hos enskilda tumörer rekapituleras i HIS-PDX-möss; “Heta” tumörer uppvisar stor immuninfiltration medan “kalla” tumörer inte gör det. Denna modell fungerar som en testplats för kombinationsimmunterapier för ett brett spektrum av mänskliga tumörer och representerar ett viktigt verktyg i strävan efter personlig medicin.

Introduction

Muscancermodeller är viktiga för att etablera grundläggande mekanismer för tumörtillväxt och immunflykt. Cancerbehandlingsstudier i musmodeller har dock gett begränsad översättning till kliniken på grund av begränsade syngena modeller och artspecifika skillnader 1,2. Framväxten av immunterapier som ett dominerande tillvägagångssätt för att kontrollera tumörer har upprepat behovet av en in vivo-modell med ett funktionellt mänskligt immunsystem. Framsteg inom humana immunsystemmöss (HIS-möss) under det senaste decenniet har gjort det möjligt att studera immunonkologi in vivo i en mängd olika cancertyper och immunterapeutiska medel 3,4,5,6. Humana tumörmodeller, inklusive cellinjehärledda och patienthärledda xenotransplantat (CDX respektive PDX), växer bra hos HIS-möss och är i de flesta fall nästan identiska med deras tillväxt i den immunbristfälliga värden som saknar human hematopoetisk engraftment 7,8. Baserat på detta viktiga fynd har forskare använt HIS-musmodellen för att studera humana immunterapier, inklusive kombinationsterapier utformade för att förändra tumörmikromiljön (TME) för att minska immunsuppression och därmed förbättra immunriktad tumördöd. Dessa prekliniska modeller hjälper till att ta itu med problemen med heterogenitet hos mänskliga cancerformer och kan också förutsäga behandlingsframgång samt övervaka immunrelaterade läkemedelstoxiciteter 9,10.

Produktionen av en musmodell med ett mänskligt immunsystem genom införande av humana hematopoetiska stamceller kräver en mottagande immunbristfällig mus som inte kommer att avvisa xenogramfen. Nuvarande HIS-musmodeller härrör från immunbristfälliga musstammar som rapporterades för över 30 år sedan. Den första immunbristfälliga musstammen som beskrevs var SCID-möss som saknade T- och B-celler11, följt av en hybrid NOD-SCID med en SIRPα-polymorfism som är ansvarig för musmakrofagtolerans mot mänskliga celler, på grund av ökad bindning för NOD SIRPα-allelen till den humana CD47-molekylen12,13. I början av 2000-talet var deletionen av den gemensamma gammakedjan av IL-2-receptorn (IL-2Rγc) på både BALB / c och NOD immunbristfälliga stammar en spelväxlare för förbättrad mänsklig engraftment, på grund av genetiska deletioner som förbjuder värd NK-cellutveckling14,15,16,17. Alternativa modeller, såsom BRG- och NRG-möss, uppnår T- och B-cellbrist genom deletion av Rag1– eller Rag2-genen, som krävs för omarrangemang av T- och B-cellreceptorgener och därmed mognad och överlevnad av lymfocyter18,19. BRGS-musen (BALB/c -Rag2 nullIl2RγCnullSirpα NOD) som används här kombinerar IL-2Rγ-kedjebristen ochNOD SIRPα-allelen på Rag2-/-bakgrunden, vilket resulterar i en mus med mycket immunbrist utan T-, B- eller NK-celler, men ändå med tillräcklig kraft och hälsa för att möjliggöra långvarig engraftment på mer än 30 veckor13.

HIS-möss kan genereras på flera sätt, med human PBMC-injektion som den mest direkta metoden15,18,20. Dessa möss har dock en uttalad expansion av aktiverade humana T-celler som resulterar i transplantat mot värdsjukdom (GVHD) vid 12 veckors ålder, vilket förhindrar långtidsstudier. Alternativt kan humana hematopoetiska stamceller från navelsträngsblod (CB), benmärg och fosterlever också användas för engraftment och produktion av det mänskliga immunsystemet de novo. I detta system producerar de hematopoetiska stamcellerna ett humant immunsystem med flera linjer med generering av T, B och medfödda immunceller som är viktiga toleranta mot musvärden jämfört med PBMC-mössen som utvecklar mestadels T-celler. Därför är GVHD frånvarande eller kraftigt försenad, och studier kan utvidgas till möss upp till 10 månaders ålder. CB tillhandahåller en enkel, tillgänglig och icke-invasiv källa till CD34 + humana hematopoetiska stamceller som underlättar engraftment av flera HIS-möss med genetiskt identiska immunsystem 17,18,20,21. Under de senaste åren har HIS-musmodeller använts i stor utsträckning för att studera immunterapi och TME 3,4,5,6. Trots utvecklingen av humant härledda immunsystem hos dessa möss växer humana xenografttumörer i liknande takt jämfört med kontrollimmunbristfälliga möss och möjliggör det komplexa samspelet mellan cancercellerna och immuncellerna, vilket är viktigt för att upprätthålla mikromiljön hos den transplanterade PDX 3,7,8 . Detta protokoll har använts för att utföra över 50 studier som testar behandlingar i HIS-BRGS-möss med PDX och CDX. En viktig slutsats är att humana tumörer i HIS-mössen bibehåller sin unika TME som definieras genom molekylär utvärdering av tumören i förhållande till det initiala patientprovet och immuninfiltratkarakteristika 3,22,23. Vår grupp fokuserar på djupgående utvärdering av HIS i både immunorgan och tumör med hjälp av multiparameterflödescytometri. Här beskriver vi ett protokoll för humanisering av BRGS-möss, utvärdering av chimärism, implantation av humana tumörer, tumörtillväxtmätningar, administrering av cancerbehandling och analys av HIS-cellerna genom flödescytometri.

Protocol

Allt djurarbete utfördes enligt djurprotokoll godkända av University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Protocols #00593 och #00021). Allt djurarbete utfördes i enlighet med Office of Laboratory Animal Resources (OLAR), en ackrediterad anläggning av American Association for Laboratory Animal Care, vid University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus. Alla humana navelsträngsblodprover erhölls som donationer från avidentifierade givare och är därför inte föremål för god…

Representative Results

Efter flanktumörprotokollet och experimentell tidslinje (figur 1) studerades tumörtillväxt och immunsvar mot en riktad tyrosinkinashämmare (TKI) och kombinationsbehandling med nivolumab i två distinkta humana kolorektal cancer (CRC) PDX. TKI-läkemedlen har studerats i immunbristfälliga värdar för att utvärdera tumörtillväxt endast29. Denna modell möjliggjorde studier av förändringar i immunsvaret av TKI ensam, och ännu viktigare, i kombination med anti…

Discussion

Under de senaste 6 åren, med hjälp av vår expertis inom både immunologi och humaniserade möss, har vårt forskargrupp utvecklat en välbehövlig preklinisk modell för att testa immunterapier på en mängd olika mänskliga tumörer 3,7,30,31. Detta protokoll betonar övervägande av modellens variabilitet, med särskild uppmärksamhet på de immunterapicentrerade humana T-cellpopulationern…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vill tacka både Animal Research Facility (OLAR) för deras vård av våra möss och Flow Cytometry Shared Resource som stöds av Cancer Center Support Grant (P30CA046934) vid vårt institut för deras enorma hjälp i allt vårt arbete. Vi tackar också både Gail Eckhardt och Anna Capasso för våra inledande samarbeten som studerar immunterapier mot humana PDX i vår HIS-BRGS-modell. Denna studie stöddes delvis av National Institutes of Health P30CA06934 Cancer Center Support Grant med användning av PHISM (Pre-clinical Human Immune System Mouse Models) Shared Resource, RRID: SCR_021990 and Flow Cytometry Shared Resource, RRID: SCR_022035. Denna forskning stöddes delvis av NIAID från National Institutes of Health under kontraktsnummer 75N93020C00058.

Materials

1 mL syringe w/needles McKesson 1031815
15 mL tubes Grenier Bio-One 188271
2-mercaptoethanol Sigma M6250
50 mL tubes Grenier Bio-One 227261
AutoMACS Pro Separator Miltenyi 130-092-545
BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin BD Bioscience BDB563792
BSA Fisher Scientific BP1600100
Cell Stim Cocktail Life Technologies 509305
Chill 15 Rack Miltenyi 130-092-952
Cotton-plugged glass pipettes Fisher Scientific 13-678-8B
Cultrex Basement membrane extract R&D Systems 363200502
Cytek Aurora Cytek
DNase Sigma 9003-98-9
eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set Invitrogen 00-5523-00
Embryonic Stemcell FCS Gibco 10439001
Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume Grenier Bio-One 616201
Excel Microsoft
FBS Benchmark 100-106 500mL
Ficoll Hypaque GE Healthcare 45001752
FlowJo Software BD Biosciences
Forceps – fine Roboz Surgical  RS5045
Forceps normal Dumont RS4919
Formaldehyde Fisher F75P1GAL
Frosted Glass Slides Corning 1255310
Gentlemacs C-Tubes Miltenyi    130-096-334
GentleMACS Dissociator Miltenyi 130-093-235
glass pipettes DWK Life Sciences 63A53
Glutamax Gibco 11140050
HBSS w/ Ca & Mg Sigma 55037C
HEPES Corning MT25060CI
IgG standard Sigma I2511
IgM standard Sigma 401108
IMDM Gibco 12440053
Liberase DL Roche 5466202001
LIVE/DEAD Fixable Blue Thermo L23105
MDA-MB-231 ATCC HTB-26
MEM Gibco 1140050
mouse anti-human IgG-AP Southern Biotech JDC-10
mouse anti-human IgG-unabeled Southern Biotech H2
mouse anti-human IgM-AP Southern Biotech UHB
mouse anti-human IgM-unlabeled Southern Biotech SA-DA4
MultiRad 350 Precision X-Ray
PBS Corning 45000-446
Pen Strep Gibco 15140122
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875713A
p-nitrophenyl substrate Thermo 34045
PRISM Graphpad
Rec Hu FLT3L R&D systems 308-FK-005/CF
Rec Hu IL6 R&D systems 206-IL-010/CF
Rec Hu SCF R&D systems 255SC010
RPMI 1640 Corning 45000-39
Saponin Sigma 8047-15-2
Scissors McKesson 862945
Serological pipettes 25 mL Fisher Scientific 1367811
Sterile filter Nalgene 567-0020
Sterile molecular water Sigma 7732-18-5
Yeti Cell Analyzer Bio-Rad 12004279
Zombie Green biolegend 423112

References

  1. Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).
  2. Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. Mouse models for cancer immunotherapy research. Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).
  3. Marin-Jimenez, J. A., et al. Testing cancer immunotherapy in a human immune system mouse model: correlating treatment responses to human chimerism, therapeutic variables and immune cell phenotypes. Frontiers in Immunology. 12, 607282 (2021).
  4. Yin, L., Wang, X. J., Chen, D. X., Liu, X. N., Wang, X. J. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. American Journal of Cancer Research. 10 (12), 4568-4584 (2020).
  5. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).
  6. Jin, K. T., et al. Development of humanized mouse with patient-derived xenografts for cancer immunotherapy studies: A comprehensive review. Cancer Science. 112 (7), 2592-2606 (2021).
  7. Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 37 (2019).
  8. Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. The FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
  9. Yong, K. S. M., et al. Humanized mouse as a tool to predict immunotoxicity of human biologics. Frontiers in Immunology. 11, 553362 (2020).
  10. Shen, H. W., Jiang, X. L., Gonzalez, F. J., Yu, A. M. Humanized transgenic mouse models for drug metabolism and pharmacokinetic research. Current Drug Metabolism. 12 (10), 997-1006 (2011).
  11. Bosma, G. C., Custer, R. P., Bosma, M. J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature. 301 (5900), 527-530 (1983).
  12. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. The Journal of Immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
  13. Legrand, N., et al. Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13224-13229 (2011).
  14. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  15. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  16. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  17. Traggiai, E., et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science. 304 (5667), 104-107 (2004).
  18. Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
  19. Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
  20. Stripecke, R., et al. Innovations, challenges, and minimal information for standardization of humanized mice. EMBO Molecular Medicine. 12 (7), (2020).
  21. Allen, T. M., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nature Immunology. 20 (7), 770-774 (2019).
  22. Gammelgaard, O. L., Terp, M. G., Preiss, B., Ditzel, H. J. Human cancer evolution in the context of a human immune system in mice. Molecular Oncology. 12 (10), 1797-1810 (2018).
  23. Rios-Doria, J., Stevens, C., Maddage, C., Lasky, K., Koblish, H. K. Characterization of human cancer xenografts in humanized mice. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000416 (2020).
  24. Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. (93), e52037 (2014).
  25. Lang, J., Weiss, N., Freed, B. M., Torres, R. M., Pelanda, R. Generation of hematopoietic humanized mice in the newborn BALB/c-Rag2null Il2rγnull mouse model: a multivariable optimization approach. Clinical Immunology. 140 (1), 102-116 (2011).
  26. Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: a multifaceted challenge. Cytometry Part A. 97 (2), 116-125 (2020).
  27. Bagby, S., et al. Development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies. Journal of Visualized Experiments. (115), e54393 (2016).
  28. Laajala, T. D., et al. Optimized design and analysis of preclinical intervention studies in vivo. Scientific Reports. 6, 30723 (2016).
  29. Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
  30. Tentler, J. J., et al. RX-5902, a novel beta-catenin modulator, potentiates the efficacy of immune checkpoint inhibitors in preclinical models of triple-negative breast cancer. BMC Cancer. 20 (1), 1063 (2020).
  31. Lang, J., et al. Development of an adrenocortical cancer humanized mouse model to characterize anti-PD1 effects on tumor microenvironment. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (1), 26-42 (2020).
  32. Lang, J., et al. Studies of lymphocyte reconstitution in a humanized mouse model reveal a requirement of T cells for human B cell maturation. The Journal of Immunology. 190 (5), 2090-2101 (2013).
  33. Katano, I., et al. NOD-Rag2null IL-2Rγnull mice: an alternative to NOG mice for generation of humanized mice. Experimental Animalas. 63 (3), 321-330 (2014).
  34. Brehm, M. A., et al. Parameters for establishing humanized mouse models to study human immunity: analysis of human hematopoietic stem cell engraftment in three immunodeficient strains of mice bearing the IL2rγ(null) mutation. Clinical Immunology. 135 (1), 84-98 (2010).
  35. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of immunodeficient mice bearing human immune systems by the engraftment of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 1438, 67-78 (2016).
  36. Andre, M. C., et al. Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2Rγnull mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells. The Journal of Immunology. 185 (5), 2710-2720 (2010).
  37. Wunderlich, M., et al. Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice. PLoS One. 13 (12), 0209034 (2018).
  38. Lee, J., Brehm, M. A., Greiner, D., Shultz, L. D., Kornfeld, H. Engrafted human cells generate adaptive immune responses to Mycobacterium bovis BCG infection in humanized mice. BMC Immunology. 14, 53 (2013).
  39. Masse-Ranson, G., et al. Accelerated thymopoiesis and improved T-cell responses in HLA-A2/-DR2 transgenic BRGS-based human immune system mice. European Journal of Immunology. 49 (6), 954-965 (2019).
  40. Oswald, E., et al. Immune cell infiltration pattern in non-small cell lung cancer PDX models is a model immanent feature and correlates with a distinct molecular and phenotypic make-up. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (4), 004412 (2022).

Play Video

Cite This Article
Lanis, J. M., Lewis, M. S., Strassburger, H., Larsen, K., Bagby, S. M., Dominguez, A. T. A., Marín-Jiménez, J. A., Pelanda, R., Pitts, T. M., Lang, J. Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors. J. Vis. Exp. (190), e64606, doi:10.3791/64606 (2022).

View Video