Detta protokoll beskriver genereringen av möss med humant immunsystem (HIS) för immunonkologistudier. Instruktioner och överväganden vid användning av denna modell för testning av humana immunotherapeutics på humana tumörer implanterade i denna modell presenteras med tonvikt på att karakterisera det mänskliga immunsystemets svar på tumören.
Att vända den immunsuppressiva naturen hos tumörmikromiljön är avgörande för framgångsrik behandling av cancer med immunterapiläkemedel. Murina cancermodeller är extremt begränsade i sin mångfald och lider av dålig översättning till kliniken. För att fungera som en mer fysiologisk preklinisk modell för immunterapistudier har detta protokoll utvecklats för att utvärdera behandlingen av humana tumörer i en mus rekonstituerad med ett humant immunsystem. Detta unika protokoll visar utvecklingen av humant immunsystem (HIS, “humaniserad”) möss, följt av implantation av en mänsklig tumör, antingen en cellinjehärledd xenograft (CDX) eller en patienthärledd xenograft (PDX). HIS-möss genereras genom att injicera CD34 + humana hematopoetiska stamceller isolerade från navelsträngsblod i neonatal BRGS (BALB / c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα) mycket immunbristfälliga möss som också kan acceptera en xenogen tumör. Betydelsen av kinetiken och egenskaperna hos det mänskliga immunsystemets utveckling och tumörimplantation betonas. Slutligen beskrivs en fördjupad utvärdering av tumörmikromiljön med hjälp av flödescytometri. I många studier med användning av detta protokoll fann man att tumörmikromiljön hos enskilda tumörer rekapituleras i HIS-PDX-möss; “Heta” tumörer uppvisar stor immuninfiltration medan “kalla” tumörer inte gör det. Denna modell fungerar som en testplats för kombinationsimmunterapier för ett brett spektrum av mänskliga tumörer och representerar ett viktigt verktyg i strävan efter personlig medicin.
Muscancermodeller är viktiga för att etablera grundläggande mekanismer för tumörtillväxt och immunflykt. Cancerbehandlingsstudier i musmodeller har dock gett begränsad översättning till kliniken på grund av begränsade syngena modeller och artspecifika skillnader 1,2. Framväxten av immunterapier som ett dominerande tillvägagångssätt för att kontrollera tumörer har upprepat behovet av en in vivo-modell med ett funktionellt mänskligt immunsystem. Framsteg inom humana immunsystemmöss (HIS-möss) under det senaste decenniet har gjort det möjligt att studera immunonkologi in vivo i en mängd olika cancertyper och immunterapeutiska medel 3,4,5,6. Humana tumörmodeller, inklusive cellinjehärledda och patienthärledda xenotransplantat (CDX respektive PDX), växer bra hos HIS-möss och är i de flesta fall nästan identiska med deras tillväxt i den immunbristfälliga värden som saknar human hematopoetisk engraftment 7,8. Baserat på detta viktiga fynd har forskare använt HIS-musmodellen för att studera humana immunterapier, inklusive kombinationsterapier utformade för att förändra tumörmikromiljön (TME) för att minska immunsuppression och därmed förbättra immunriktad tumördöd. Dessa prekliniska modeller hjälper till att ta itu med problemen med heterogenitet hos mänskliga cancerformer och kan också förutsäga behandlingsframgång samt övervaka immunrelaterade läkemedelstoxiciteter 9,10.
Produktionen av en musmodell med ett mänskligt immunsystem genom införande av humana hematopoetiska stamceller kräver en mottagande immunbristfällig mus som inte kommer att avvisa xenogramfen. Nuvarande HIS-musmodeller härrör från immunbristfälliga musstammar som rapporterades för över 30 år sedan. Den första immunbristfälliga musstammen som beskrevs var SCID-möss som saknade T- och B-celler11, följt av en hybrid NOD-SCID med en SIRPα-polymorfism som är ansvarig för musmakrofagtolerans mot mänskliga celler, på grund av ökad bindning för NOD SIRPα-allelen till den humana CD47-molekylen12,13. I början av 2000-talet var deletionen av den gemensamma gammakedjan av IL-2-receptorn (IL-2Rγc) på både BALB / c och NOD immunbristfälliga stammar en spelväxlare för förbättrad mänsklig engraftment, på grund av genetiska deletioner som förbjuder värd NK-cellutveckling14,15,16,17. Alternativa modeller, såsom BRG- och NRG-möss, uppnår T- och B-cellbrist genom deletion av Rag1– eller Rag2-genen, som krävs för omarrangemang av T- och B-cellreceptorgener och därmed mognad och överlevnad av lymfocyter18,19. BRGS-musen (BALB/c -Rag2 nullIl2RγCnullSirpα NOD) som används här kombinerar IL-2Rγ-kedjebristen ochNOD SIRPα-allelen på Rag2-/-bakgrunden, vilket resulterar i en mus med mycket immunbrist utan T-, B- eller NK-celler, men ändå med tillräcklig kraft och hälsa för att möjliggöra långvarig engraftment på mer än 30 veckor13.
HIS-möss kan genereras på flera sätt, med human PBMC-injektion som den mest direkta metoden15,18,20. Dessa möss har dock en uttalad expansion av aktiverade humana T-celler som resulterar i transplantat mot värdsjukdom (GVHD) vid 12 veckors ålder, vilket förhindrar långtidsstudier. Alternativt kan humana hematopoetiska stamceller från navelsträngsblod (CB), benmärg och fosterlever också användas för engraftment och produktion av det mänskliga immunsystemet de novo. I detta system producerar de hematopoetiska stamcellerna ett humant immunsystem med flera linjer med generering av T, B och medfödda immunceller som är viktiga toleranta mot musvärden jämfört med PBMC-mössen som utvecklar mestadels T-celler. Därför är GVHD frånvarande eller kraftigt försenad, och studier kan utvidgas till möss upp till 10 månaders ålder. CB tillhandahåller en enkel, tillgänglig och icke-invasiv källa till CD34 + humana hematopoetiska stamceller som underlättar engraftment av flera HIS-möss med genetiskt identiska immunsystem 17,18,20,21. Under de senaste åren har HIS-musmodeller använts i stor utsträckning för att studera immunterapi och TME 3,4,5,6. Trots utvecklingen av humant härledda immunsystem hos dessa möss växer humana xenografttumörer i liknande takt jämfört med kontrollimmunbristfälliga möss och möjliggör det komplexa samspelet mellan cancercellerna och immuncellerna, vilket är viktigt för att upprätthålla mikromiljön hos den transplanterade PDX 3,7,8 . Detta protokoll har använts för att utföra över 50 studier som testar behandlingar i HIS-BRGS-möss med PDX och CDX. En viktig slutsats är att humana tumörer i HIS-mössen bibehåller sin unika TME som definieras genom molekylär utvärdering av tumören i förhållande till det initiala patientprovet och immuninfiltratkarakteristika 3,22,23. Vår grupp fokuserar på djupgående utvärdering av HIS i både immunorgan och tumör med hjälp av multiparameterflödescytometri. Här beskriver vi ett protokoll för humanisering av BRGS-möss, utvärdering av chimärism, implantation av humana tumörer, tumörtillväxtmätningar, administrering av cancerbehandling och analys av HIS-cellerna genom flödescytometri.
Under de senaste 6 åren, med hjälp av vår expertis inom både immunologi och humaniserade möss, har vårt forskargrupp utvecklat en välbehövlig preklinisk modell för att testa immunterapier på en mängd olika mänskliga tumörer 3,7,30,31. Detta protokoll betonar övervägande av modellens variabilitet, med särskild uppmärksamhet på de immunterapicentrerade humana T-cellpopulationern…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka både Animal Research Facility (OLAR) för deras vård av våra möss och Flow Cytometry Shared Resource som stöds av Cancer Center Support Grant (P30CA046934) vid vårt institut för deras enorma hjälp i allt vårt arbete. Vi tackar också både Gail Eckhardt och Anna Capasso för våra inledande samarbeten som studerar immunterapier mot humana PDX i vår HIS-BRGS-modell. Denna studie stöddes delvis av National Institutes of Health P30CA06934 Cancer Center Support Grant med användning av PHISM (Pre-clinical Human Immune System Mouse Models) Shared Resource, RRID: SCR_021990 and Flow Cytometry Shared Resource, RRID: SCR_022035. Denna forskning stöddes delvis av NIAID från National Institutes of Health under kontraktsnummer 75N93020C00058.
1 mL syringe w/needles | McKesson | 1031815 | |
15 mL tubes | Grenier Bio-One | 188271 | |
2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
50 mL tubes | Grenier Bio-One | 227261 | |
AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | 130-092-545 | |
BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin | BD Bioscience | BDB563792 | |
BSA | Fisher Scientific | BP1600100 | |
Cell Stim Cocktail | Life Technologies | 509305 | |
Chill 15 Rack | Miltenyi | 130-092-952 | |
Cotton-plugged glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
Cultrex Basement membrane extract | R&D Systems | 363200502 | |
Cytek Aurora | Cytek | ||
DNase | Sigma | 9003-98-9 | |
eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | |
Embryonic Stemcell FCS | Gibco | 10439001 | |
Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume | Grenier Bio-One | 616201 | |
Excel | Microsoft | ||
FBS | Benchmark | 100-106 500mL | |
Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 45001752 | |
FlowJo Software | BD Biosciences | ||
Forceps – fine | Roboz Surgical | RS5045 | |
Forceps normal | Dumont | RS4919 | |
Formaldehyde | Fisher | F75P1GAL | |
Frosted Glass Slides | Corning | 1255310 | |
Gentlemacs C-Tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
GentleMACS Dissociator | Miltenyi | 130-093-235 | |
glass pipettes | DWK Life Sciences | 63A53 | |
Glutamax | Gibco | 11140050 | |
HBSS w/ Ca & Mg | Sigma | 55037C | |
HEPES | Corning | MT25060CI | |
IgG standard | Sigma | I2511 | |
IgM standard | Sigma | 401108 | |
IMDM | Gibco | 12440053 | |
Liberase DL | Roche | 5466202001 | |
LIVE/DEAD Fixable Blue | Thermo | L23105 | |
MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
MEM | Gibco | 1140050 | |
mouse anti-human IgG-AP | Southern Biotech | JDC-10 | |
mouse anti-human IgG-unabeled | Southern Biotech | H2 | |
mouse anti-human IgM-AP | Southern Biotech | UHB | |
mouse anti-human IgM-unlabeled | Southern Biotech | SA-DA4 | |
MultiRad 350 | Precision X-Ray | ||
PBS | Corning | 45000-446 | |
Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
p-nitrophenyl substrate | Thermo | 34045 | |
PRISM | Graphpad | ||
Rec Hu FLT3L | R&D systems | 308-FK-005/CF | |
Rec Hu IL6 | R&D systems | 206-IL-010/CF | |
Rec Hu SCF | R&D systems | 255SC010 | |
RPMI 1640 | Corning | 45000-39 | |
Saponin | Sigma | 8047-15-2 | |
Scissors | McKesson | 862945 | |
Serological pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 1367811 | |
Sterile filter | Nalgene | 567-0020 | |
Sterile molecular water | Sigma | 7732-18-5 | |
Yeti Cell Analyzer | Bio-Rad | 12004279 | |
Zombie Green | biolegend | 423112 |