Summary
O presente protocolo descreve um método que permite a análise da expressão gênica unicelular em populações de Pseudomonas syringae cultivadas dentro do apoplasto vegetal.
Abstract
Uma infinidade de microrganismos patogênicos atacam constantemente as plantas. O complexo de espécies de Pseudomonas syringae engloba bactérias Gram-negativas fitopatogênicas de especial relevância para um grande número de hospedeiros. P. syringae entra na planta pela superfície foliar e se multiplica rapidamente dentro do apoplasto, formando microcolônias que ocupam o espaço intercelular. A expressão constitutiva de proteínas fluorescentes pelas bactérias permite a visualização das microcolônias e o monitoramento do desenvolvimento da infecção em nível microscópico. Avanços recentes na análise unicelular têm revelado a grande complexidade alcançada pelas populações clonais isogênicas de bactérias. Essa complexidade, chamada de heterogeneidade fenotípica, é consequência de diferenças célula a célula na expressão gênica (não ligadas a diferenças genéticas) entre a comunidade bacteriana. Para analisar a expressão de loci individuais em nível unicelular, fusões transcricionais a proteínas fluorescentes têm sido amplamente utilizadas. Sob condições de estresse, como as que ocorrem durante a colonização do apoplasto vegetal, P. syringae diferencia-se em subpopulações distintas com base na expressão heterogênea de genes-chave de virulência (i.e., o sistema de secreção Hrp tipo III). No entanto, a análise de célula única de qualquer população de P. syringae recuperada do tecido vegetal é desafiadora devido aos detritos celulares liberados durante a ruptura mecânica intrínseca aos processos de inoculação e extração bacteriana. O presente relato detalha um método desenvolvido para monitorar a expressão de genes de interesse de P. syringae em nível unicelular durante a colonização de Arabidopsis e feijoeiro. A preparação das plantas e as suspensões bacterianas utilizadas para inoculação em câmara de vácuo são descritas. A recuperação de bactérias endofíticas de folhas infectadas por extração com fluido apoplásico também é explicada aqui. Tanto a inoculação bacteriana quanto os métodos de extração bacteriana são empiricamente otimizados para minimizar danos às células vegetais e bacterianas, resultando em preparações bacterianas ideais para análise de microscopia e citometria de fluxo.
Introduction
Bactérias patogênicas apresentam diferenças em fenótipos diversos, dando origem à formação de subpopulações dentro de populações geneticamente idênticas. Esse fenômeno é conhecido como heterogeneidade fenotípica e tem sido proposto como estratégia de adaptação durante interações bactéria-hospedeiro1. Avanços recentes na resolução óptica de microscópios confocais, citometria de fluxo e microfluídica, combinados com proteínas fluorescentes, têm fomentado análises unicelulares de populações bacterianas2.
A Pseudomonas syringae Gram-negativa é uma bactéria fitopatogênica arquetípica devido à sua importância acadêmica e econômica3. O ciclo de vida de P. syringae está ligado ao ciclo da água4. A P. syringae adentra os espaços intercelulares entre as células do mesofilo, o apoplasto foliar da planta, através de aberturas naturais como estômatos ou feridas5. Uma vez dentro do apoplasto, P. syringae depende do sistema de secreção tipo III (T3SS) e dos efetores translocados tipo III (T3E) para suprimir a imunidade vegetal e manipular as funções celulares das plantas em benefício do patógeno6. A expressão de T3SS e T3E depende do regulador mestre HrpL, um fator sigma alternativo que se liga aos motivos hrp-box na região promotora dos genes alvo7.
Ao gerar fusões transcricionais localizadas no cromossomo com genes de proteínas fluorescentes a jusante do gene de interesse, pode-se monitorar a expressão gênica com base nos níveis de fluorescência emitidos em nível de célula única8. Usando este método, estabeleceu-se que a expressão de hrpL é heterogênea tanto dentro de culturas bacterianas cultivadas em laboratório quanto dentro de populações bacterianas recuperadas do apoplasto vegetal 8,9. Embora a análise da expressão gênica em nível unicelular seja tipicamente realizada em culturas bacterianas cultivadas em meios de laboratório, tais análises também podem ser realizadas em populações bacterianas que crescem dentro da planta, fornecendo informações valiosas sobre a formação de subpopulações no contexto natural. Uma limitação potencial para a análise de populações bacterianas extraídas da planta é que os métodos clássicos de inoculação por infiltração por pressão de seringa no apoplasto, seguida de extração bacteriana por maceração do tecido foliar, tipicamente geram uma grande quantidade de restos celulares vegetais que interferem na análise a jusante10. A maioria dos debris celulares consiste em fragmentos autofluorescentes de cloroplastos que se sobrepõem à fluorescência da GFP, resultando em resultados enganosos.
O presente protocolo descreve o processo de análise da heterogeneidade da expressão gênica unicelular em dois fisiossistemas modelo: o formado por P. syringae pv. tomateiro cepa DC3000 e Arabidopsis thaliana (Col-0), e a outra pelo P. syringae pv. phaseolicola cepa 1448A e plantas de feijão (cultivar Phaseolus vulgaris Canadian Wonder). Um método de inoculação é proposto baseado na infiltração a vácuo usando uma câmara de vácuo e uma bomba, resultando em um método rápido e livre de danos para infiltração de folhas inteiras. Além disso, como um aprimoramento dos protocolos convencionais, um método mais suave é usado para extrair a população bacteriana do apoplasto que reduz significativamente a ruptura tecidual, baseado na extração de fluido apoplástico através da aplicação de ciclos de pressão positiva e negativa usando uma pequena quantidade de volume dentro de uma seringa.
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Protocol
1. Preparo das plantas
- Prepare plantas de Arabidopsis Col-0 seguindo os passos abaixo.
- Encha um vaso de 10 cm de diâmetro com uma mistura de substrato vermiculita-planta 1:3 (ver Tabela de Materiais), previamente regado, e cubra o vaso com uma malha metálica de 15 cm x 15 cm com furos de 1,6 mm x 1,6 mm. Ajustar a malha metálica ao solo úmido com elástico (Figura 1A).
- Com um palito molhado, semeie sementes de Arabidopsis nos buracos da malha metálica. Coloque de três a quatro sementes em posições distantes dentro do vaso (Figura 1B, C).
- Cubra os vasos com uma cúpula de plástico para manter a umidade relativa alta e incube-os por 72 h a 4 °C para estratificação.
OBS: A estratificação (incubação em alta umidade e baixa temperatura, conforme descrito) melhora a velocidade de germinação e sincronia das sementes. - Transfira os vasos para uma câmara de crescimento de plantas em condições de dias curtos (8 h claro/16 h escuro a 21 °C, intensidade luminosa: 100 μmol·m−2·s−1, umidade relativa: 70%).
- Após a germinação das sementes (8-10 dias), utilizar a pinça para retirar a maior parte das plântulas, mantendo uma plântula em cada uma das posições do vaso (seis plântulas/vaso) (Figura 1D). Retire a cúpula de plástico para descobrir os potes.
NOTA: As plantas estarão prontas para uso 4-5 semanas após a germinação.
- Preparar plantas de feijão Phaseolus vulgaris (cultivar Canadian Wonder).
- Cubra o fundo de uma placa de Petri com um pedaço de papel toalha molhado e coloque as sementes de feijão por cima. Selar a placa de Petri com fita cirúrgica e incubar a 28 °C por 3-4 dias (Figura 2A).
- Transfira as sementes germinadas para um vaso de 10 cm de diâmetro preenchido com uma mistura úmida de vermiculita e substrato vegetal 1:3.
- Incubar em uma câmara de crescimento de plantas em ambientes de dias longos (16 h claro/8 h escuro a 23 °C, intensidade de luz: 100 μmol·m−2·s−1, umidade relativa: 70%).
OBS: As plantas estarão prontas para uso 10 dias após a germinação (Figura 2B).
2. Inoculação de Arabidopsis e feijoeiro
OBS: Neste estudo, as cepas P. syringae pv. tomateiro DC3000 e P. syringae pv. phaseolicola 1448A.
- Preparar o inóculo de P. syringae.
- Estirpe de P. syringae de interesse de um stock de glicerol de -80 °C para uma placa LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de NaCl, 5 g/L de extracto de levedura e 16 g/L de ágar bacteriológico, ver Tabela de Materiais) suplementada com os antibióticos adequados. Incubar a 28 °C durante 40-48 h.
NOTA: O uso de antibióticos é recomendado se a cepa de interesse carrega um plasmídeo ou um gene de resistência genômica. As concentrações recomendadas de antibióticos para P. syringae são as seguintes: canamicina (15 μg/mL), gentamicina (10 μg/mL), ampicilina (300 μg/mL) (ver Tabela de Materiais). - Raspar a biomassa bacteriana e ressuspender em 5 mL de MgCl2 10 mM. Meça o OD600 e ajuste para 0,1 adicionando 10 mM MgCl2.
NOTA: Um OD600 de 0,1 de uma cultura de P. syringae corresponde a 5 x 107 UFC·mL−1. - Realizar diluições seriadas em 10 mM MgCl2 para atingir uma concentração final de inóculo de 5 x 105 UFC·mL−1. Preparar 200 mL de inóculo para as plantas de Arabidopsis e 50 mL para as plantas de feijão.
- Imediatamente antes da inoculação, adicionar o tensoativo Silwett L-77 (ver Tabela de Materiais) a uma concentração final de 0,02% para inoculação de feijão e 0,01% para Arabidopsis. Note que Silwett é um pouco prejudicial para o tecido Arabidopsis.
- Estirpe de P. syringae de interesse de um stock de glicerol de -80 °C para uma placa LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de NaCl, 5 g/L de extracto de levedura e 16 g/L de ágar bacteriológico, ver Tabela de Materiais) suplementada com os antibióticos adequados. Incubar a 28 °C durante 40-48 h.
- Realizar infiltração a vácuo.
- Para a infiltração de Arabidopsis, colocar dois palitos de madeira formando um X sobre o vaso (Figura 1E) e colocá-lo virado para baixo sobre uma placa de Petri de 14 cm de diâmetro contendo o inóculo de 200 mL (Figura 1F).
- Para a inoculação das folhas de feijão, introduzir a folha em um tubo centrífugo cônico de 50 mL contendo o inóculo (Figura 2C).
- Inserir as plantas imersas na solução de inóculo em câmara de vácuo (Figura 1G e Figura 2D) e dar um pulso de 500 mbar por 30 s para infiltração das folhas. Repetir o pulso de vácuo 2-3 vezes até que a folha esteja completamente infiltrada (Figura 1H e Figura 2E).
- Escorra o excesso de solução de inóculo com um pedaço de papel e devolva as plantas à câmara de crescimento correspondente.
3. Extração de bactérias do apoplasto
- Quatro dias após a inoculação, cortar a parte aérea da planta Arabidopsis ou a folha inoculada da planta de feijão e colocá-la em uma seringa de 20 mL sem agulha (Figura 2G). Para folhas de feijão, enrole a folha sobre si mesma, deixando a face abaxial para fora, como mostra a Figura 2F.
- Adicione volume suficiente de água destilada para cobrir o tecido (geralmente 10-15 mL).
- Insira o êmbolo e, com a seringa na posição vertical com a ponta apontada para cima, remova o excesso de ar e bolhas de ar dentro da seringa, batendo suavemente no barril até que todo o ar esteja localizado perto da ponta. Deslize então o êmbolo para retirar o ar. Quando houver o mínimo de ar possível dentro da seringa, cubra a ponta do barril da seringa com filme de parafina.
- Pressionar cuidadosamente o êmbolo para gerar pressão positiva até que o tecido fique mais escuro (Figura 1I e Figura 2H). Em seguida, truxe o êmbolo para gerar pressão negativa (Figura 1J e Figura 2I). Repita esta etapa de 3 a 5 vezes.
- Retirar o filme de parafina e o êmbolo e coletar o líquido contendo as bactérias extraídas do apoplasto, conforme Figura 2J.
4. Análise unicelular das bactérias extraídas do apoplasto
- Visualize por microscopia confocal seguindo os passos abaixo.
- Preparar uma solução de agarose a 1,5% em água destilada. Depois de derretido, adicione volume suficiente para preencher o espaço entre duas lâminas de microscopia colocadas lado a lado e coloque outra lâmina sobre ela (Figura 3). Deixe secar por 15 min e retire com cuidado a lâmina colocada na parte superior. Usando uma lâmina, corte a almofada de agarose em pedaços de 5 mm x 5 mm antes de usar.
- Paralelamente, centrifugar 1 mL da bactéria extraída do apoplasto a 12.000 x g por 1 min à temperatura ambiente, remover cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspender o pellet em 20 μL de água para concentrar as células. Coloque uma gota de 2 μL das células concentradas sobre uma lamínula de 0,17 mm e cubra a gota com um pedaço de 5 mm x 5 mm da almofada de agarose previamente obtida na etapa 1, conforme representado na Figura 3.
- Visualize a preparação bacteriana sob o microscópio confocal (ver Tabela de Materiais). Para identificar bactérias verde-fluorescentes, utilizar o laser de excitação a 488 nm e um filtro de emissão variando de 500 nm a 550 nm. Para identificar todas as bactérias, use o campo brilhante e mescle os dois campos.
- Processe as imagens confocais usando Fiji (consulte Tabela de Materiais). Para fazer isso, use o plugin MicrobeJ para identificar o contorno da célula bacteriana e medir a intensidade da fluorescência em seu interior.
NOTA: A aquisição de imagens a partir de bactérias isoladas (não agrupadas) é recomendada para esta análise.
- Realizar análise por citometria de fluxo.
- Pegue uma alíquota das suspensões de bactérias extraídas do apoplasto para analisar usando o citômetro de fluxo. Adquira 100.000 eventos.
- Para discriminar entre bactérias e restos vegetais, analise o apoplasto extraído de uma planta não inoculada e compare o dot plot mostrando seu tamanho de célula de dispersão direta (FSC) versus tamanho de célula de dispersão lateral (SSC) com o da suspensão bacteriana extraída de apoplasto. Para identificar bactérias não fluorescentes, utilizar os apoplastos extraídos das plantas inoculadas com bactérias isogênicas não fluorescentes e comparar suas emissões fluorescentes.
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Representative Results
A expressão do sistema de secreção tipo III é essencial para o crescimento bacteriano dentro da planta. A expressão oportuna dos genes T3SS é obtida através de uma intrincada regulação, cujo centro é o fator sigma HrpL da função extracitoplasmática (LEC), o principal ativador da expressão de genes relacionados ao T3SS11. Uma análise da expressão de hrpL foi previamente realizada usando uma fusão transcricional localizada em cromossomos com um gene gfp sem promotor a jusante e seguindo os padrões de expressão por microscopia confocal e citometria de fluxo9. Essas fusões são geradas através da integração homóloga mediada por recombinação de construções codificadas por plasmídeos geradas por PCR e clonagem tradicional e carregam os últimos 500 pares de bases da ORF do gene de interesse (incluindo o códon STOP) e 500 pares de bases da sequência imediatamente a jusante, flanqueando o sítio de ligação do ribossomo e a ORF do gene repórter de fluorescência a ser usado (neste caso, GFP), seguido por um de resistência a antibióticos (neste caso, o gene NPT2 que confere resistência à canamicina). Assim, estabeleceu-se que populações de P. syringae extraídas de apoplasto expressando genes relacionados ao T3SS, incluindo hrpL, são heterogêneas na planta9. Neste precedente, os resultados representativos da microscopia de fluorescência confocal e da análise por citometria de fluxo da expressão de hrpL são mostrados em células bacterianas individuais das cepas modelo Pph 1448A (Pph) e Pto DC3000 (Pto), extraídas das folhas de feijão ou Arabidopsis, respectivamente, após colonização do apoplasto foliar (Figura 4). Em cada cepa, o gene hrpL cromossômico de P. syringae carrega uma fusão transcricional a jusante para um gene gfp sem promotor que permite monitorar a atividade do promotor nativo de hrpL seguindo os níveis de expressão de GFP 8,9.
Bactérias extraídas de apoplasto podem ser usadas para diferentes análises. Aqui, 300 μL das cepas bacterianas do repórter acima mencionadas foram extraídas do apoplasto de Arabidopsis ou plantas de feijão infectadas e usadas para aquisição de dados usando um sistema de citômetro de fluxo (ver Tabela de Materiais). A emissão de laser a 488 nm e o filtro FITC foram usados para detecção de GFP. A análise por citometria de fluxo mostra a distribuição de fluorescência em células bacterianas individuais dentro da população. A expressão heterogênea de hrpL pode ser claramente observada por citometria de fluxo em Pto extraído de apoplasto de Arabidopsis e em Pph extraído de apoplasto de feijão, incluindo bactérias HrpLOFF (não expressando GFP), e esses resultados são suportados pelo exame microscópico das amostras correspondentes (Figura 4). Os gráficos de dot plot (painéis esquerdos) mostram a distribuição da intensidade de fluorescência da GFP versus o tamanho da célula na população (Figura 4A), enquanto os histogramas mostram a intensidade da fluorescência da GFP versus a contagem de células (Figura 4B). Essas duas diferentes representações gráficas dos dados citométricos permitem ao pesquisador estabelecer nuances visuais sutis e fornecer informações complementares. Como controle para autofluorescência bacteriana, foi utilizada a cepa selvagem não GFP correspondente (painel superior na Figura 4A e histograma cinza na Figura 4B). Isso permite identificar a área do gráfico onde as bactérias não-GFP dentro da população são exibidas. As análises por citometria de fluxo também geram dados quantitativos. Como exemplo, as porcentagens de células HrpLON (fluorescentes) são extraídas em populações de Pto e Pph extraídas de apoplasos. A Figura 4C mostra como as porcentagens de HrpLON foram maiores do que as porcentagens correspondentes de célulasHrpL OFF (não fluorescentes) nessas populações, particularmente no modelo Pto. Esses dados também podem ser usados para calcular a fluorescência média ou mediana para toda a população. Neste experimento em particular, a intensidade média de fluorescência da GFP foi obtida, que foi maior para a população de Pto do que para Pph, de acordo com sua maior porcentagem de células ON. Os níveis médios constituem dados de nível populacional comparáveis aos dados obtidos através de técnicas de células não únicas, como RT-qPCR ou RNAseq. Finalmente, o coeficiente de variação robusto (RCV)12, calculado como o terceiro quartil menos o primeiro quartil dividido pela mediana, também é mostrado. O RCV é frequentemente usado em estudos de citometria de fluxo para estimar a dispersão dos dados (ou seja, heterogeneidade da expressão dentro da população)13. No presente estudo, o RCV foi ligeiramente maior para Pph do que para Pto, embora a diferença não tenha sido suficiente para caracterizar a distribuição da expressão dentro das populações dessas duas cepas como significativamente diferente. A heterogeneidade da expressão da hrpL pode ser confirmada visualmente com as imagens de microscopia confocal (Figura 4D). O uso de almofadas de ágar para preparação de microscopia resulta em visualização mais fácil e imagens de maior qualidade das células individuais, uma vez que empurra as bactérias para uma única camada e impede o movimento bacteriano. Os procedimentos de inoculação e extração bacteriana descritos neste protocolo minimizam a quantidade de restos vegetais dentro da preparação bacteriana, permitindo assim a análise da expressão bacteriana por essas diferentes técnicas (Figura 4).
Figura 1: Inoculação bacteriana e extração de apoplasto em plantas de Arabidopsis. (A) Preparo da panela com a malha metálica devidamente fixada. (B) Semeando sementes com palito para distribuí-las conforme indicado em (C). (D) Plantas de Arabidopsis prontas para inoculação. (E) Dois palitos de madeira facilitam a imersão das plantas na solução bacteriana sem atingir o vaso ou o solo (F). (G) O conjunto pode ser colocado dentro da câmara de vácuo. (H) As folhas infiltradas ficam mais escuras após a liberação do vácuo da câmara. (I) As folhas destacadas são colocadas em uma seringa de 20 mL e cobertas com água. (J) Ciclos de pressão positiva e negativa resultam na extração das bactérias apoplásticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Inoculação bacteriana e extração de apoplasto em feijoeiro. (A) Germinação de sementes de feijão em placas de Petri forradas com papel higiênico úmido. (B) Planta de feijão pronta para inoculação. (C) Folha de feijão imersa na solução bacteriana contida em um tubo de 50 mL. (D) As folhas são inoculadas dentro de uma câmara de vácuo até que o tecido fique mais escuro (E). (F) A folha de feijão é enrolada, colocada dentro de uma seringa de 20 mL e coberta com água (G). (H) Ciclos de pressão positiva e negativa (I) resultam na extração das bactérias apoplásticas que podem ser recuperadas em um tubo (J). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representação esquemática da fixação e preparo da almofada de ágar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise das bactérias extraídas de apoplasto obtidas de Arabidopsis ou folhas de feijão 4 dias após a inoculação com P. syringae pv. tomate (Pto) ou P. syringae pv. phaseolicola (Pph), respectivamente. A expressão de hrpL::gfp é monitorada como fluorescência GFP. (A) A análise por citometria de fluxo é representada como um gráfico de pontos (dispersão direta [tamanho da célula] vs. intensidade de fluorescência GFP). Bactérias não-GFP indicam uma cepa selvagem de Pto ou Pph. A linha vertical delimita 99% da população não GFP. (B) A análise por citometria de fluxo é representada como histogramas (contagem de células vs. intensidade de fluorescência da GFP). O histograma cinza representa a cepa não-GFP. (C) Dados quantitativos foram gerados a partir da análise por citometria de fluxo. A porcentagem de células ON e OFF é calculada com base na distribuição mostrada no gráfico de pontos. A média indica a fluorescência média obtida no experimento. O coeficiente de variação robusto (RCV) é calculado como o terceiro quartil menos o primeiro quartil dividido pela mediana. (D) Imagens de microscopia de fluorescência mostrando níveis heterogêneos de GFP associados à expressão de hrpL. As setas brancas destacam bactérias exibindo baixos níveis ou nenhuma fluorescência de GFP. Barra de escala: 3 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método aqui apresentado descreve um procedimento não invasivo que permite a infiltração de bactérias no tecido foliar da planta, permitindo a inoculação rápida de grandes volumes e minimizando a ruptura tecidual. Uma das características do complexo de espécies de P. syringae é a capacidade de sobreviver e proliferar no interior do apoplasto vegetal e na superfície da planta como epífita14. Assim, não se pode descartar a possibilidade de que as bactérias extraídas pelo presente protocolo sejam provenientes apenas do apoplasto vegetal. No entanto, foi previamente demonstrado, por microscopia confocal, que a proporção de bactérias na superfície foliar é notavelmente menor em comparação com o crescimento bacteriano dentro da folha daplanta5. Isso pode ser verificado pelo exame microscópico da superfície foliar antes da extração. Além disso, as cepas de P. syringae utilizadas como modelo no presente protocolo, Pto DC3000 e Pph 1448A, demonstraram desempenho como epífitas fracas15, representando uma proporção irrelevante das bactérias extraídas. No entanto, para que o método seja adaptado a outros patossistemas, uma etapa prévia de descontaminação da superfície foliar pode ter que ser adicionada ao presente protocolo.
Métodos tradicionais de inoculação, como a infiltração foliar com seringa16, causam dano tecidual maior e difícil de estimar no local da inoculação, resultando em necrose tecidual. Além disso, a quantidade de danos é muito variável entre os diferentes pontos de inoculação. Além disso, diferentes espécies de plantas variam em sua tolerância à infiltração foliar. Por exemplo, as folhas de Arabidopsis são fáceis de infiltrar, enquanto as folhas de feijão são mais recalcitrantes. As condições de crescimento também afetam o nível de tolerância à infiltração de uma determinada espécie. Métodos tradicionais de inoculação mais suaves, como o mergulho foliar ou pulverização foliar, resultando em uma entrada bacteriana mais natural e livre de danos e colonização do tecido, no entanto, limitam inerentemente o tamanho das populações bacterianas obtidas, frequentemente abaixo do limiar necessário para análise subsequente das amostras de bactérias apoplásicas5 . O método de inoculação proposto reduz significativamente a ativação de necrose nas áreas inoculadas resultantes da pressão da seringa, evitando a limitação do tamanho da amostra bacteriana e fornece uma maneira fácil, reprodutível e rápida de inocular áreas foliares consideráveis.
Algumas técnicas que requerem a inoculação de grandes áreas teciduais podem ser muito demoradas e trabalhosas, aumentando as chances de causar dano tecidual. Com a aplicação desse método, podemos inocular cinco ou mais plantas de Arabidopsis , ou uma folha inteira de feijão, em apenas uma etapa, sem comprometer a integridade tecidual. Essa técnica pode ser adaptada para inocular um número maior de plantas ou para outras espécies vegetais de interesse agronômico ou acadêmico, como Nicotiana benthamiana, tomate ou soja. A concentração do tensoativo, utilizada para reduzir a tensão superficial de água para facilitar a infiltração da suspensão bacteriana, deve ser ajustada e testada com antecedência, dependendo da espécie vegetal, pois concentrações mais elevadas do surfactante podem resultar em necrose tecidual em alguns casos. Além disso, a quantidade de pressão aplicada e a duração do processo de inoculação devem ser ajustadas à resistência oferecida pela folha da planta em diferentes espécies para garantir resultados ótimos.
Com relação à extração de apoplastos, o método atual também minimiza a ruptura tecidual, reduzindo a quantidade de restos vegetais presentes na amostra extraída. Isso permite amostras mais limpas, resultando em análises mais eficientes por meio de diferentes técnicas, como RNA-seq, citometria de fluxo ou microscopia, como mostrado no exemplo. A recuperação da população bacteriana patogênica de seu ambiente apoplásico com mínima ruptura de tecidos e células vegetais é um desafio. P. syringae coloniza os espaços intercelulares do apoplasto, formando microcolônias. O uso de um patógeno extracelular, como a P. syringae, permite métodos como o aqui apresentado, uma vez que a ruptura tecidual e celular não é necessária para a recuperação bacteriana. As rodadas de pressão positiva e negativa rompem as microcolônias, dispersando as bactérias e permitindo sua fácil e rápida extração através de aberturas naturais (estômatos), evitando qualquer alteração na expressão gênica que possa acompanhar longos tempos de incubação, como os necessários para métodos mais suaves de recuperação apoplástica. O exame microscópico do tecido vegetal remanescente suporta a remoção da maioria da população bacteriana. Protocolos de extração do fluido apoplástico têm sido amplamente utilizados para estudar a complexidade do fluido apoplástico17. Esses protocolos contêm uma etapa final de centrifugação para limpar ainda mais o fluido apoplástico recuperado. Aqui, ciclos suaves de pressão positiva e negativa usando o êmbolo da seringa foram usados em vez disso, reduzindo assim a contaminação da amostra com detritos celulares do hospedeiro enquanto tinha muito pouco impacto na eficiência da recuperação bacteriana. Um método clássico de extração bacteriana suave consiste na incubação de discos foliares ou plântulas com um tensoativo por 1-2 h18. Este método não é tão eficiente quanto o aqui apresentado para extrair bactérias; entretanto, sua principal limitação para a análise da expressão gênica é o efeito do tempo de incubação necessário sobre o perfil de expressão da população. O método aqui apresentado permite a rápida recuperação e análise imediata da população apoplástica, reduzindo o risco de contornar os resultados da expressão gênica em nível celular.
A heterogeneidade fenotípica em bactérias patogênicas tem sido amplamente estudada utilizando meios laboratoriais homogêneos. O estudo de populações bacterianas cultivadas em seu nicho natural é muitas vezes limitado devido a barreiras técnicas, como a dificuldade de recuperar populações bacterianas sem contaminação excessiva com restos de células hospedeiras que interfere nas análises unicelulares a jusante. Este método combinado de inoculação e extração permite a geração de grandes populações apoplásticas de patógenos bacterianos para análises unicelulares.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Projeto Grant RTI2018-095069-B-I00 financiado pelo MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ e pelo "ERDP A way of making Europe". O J.S.R. foi financiado pelo Plano Andaluz de Investigação, Desenvolvimento e Inovação (PAIDI 2020). N.L.P. foi financiado pelo Projeto Grant P18-RT-2398 do Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.17 mm coverslip | No special requirements | ||
| 1.6 x 1.6 mm metal mesh | Buzifu | Fiberglass screen mesh | |
| 10 cm diameter pots | No special requirements | ||
| 140 mm Petri dishes | No special requirements | ||
| 20 mL syringe | No special requirements | ||
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | ||
| Agarose | Merk | ||
| Ampicillin sodium | GoldBio | ||
| Bacteriological agar | Roko | ||
| Confocal Microscope Stellaris | Leica Microsystems | ||
| FACSVerse cell analyzer | BD Biosciences | ||
| Fiji software | |||
| Gentamycin sulfate | Duchefa | G-0124 | |
| Kanamycin monosulfate | Phytotechnology | K378 | |
| MgCl2 | Merk | ||
| NaCl | Merk | ||
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | ||
| Plant substrate | No special requirements | ||
| Silwet L-77 | Cromton Europe Ltd | ||
| Toothpicks | No special requirements | ||
| Tryptone | Merk | ||
| Tweezers | No special requirements | ||
| Vacuum chamber 25 cm diameter | Kartell | 554 | |
| Vacuum pump | GAST | DOA-P504-BN | |
| Vermiculite | No special requirements | ||
| Yeast Extract | Merk |
References
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