Detta protokoll beskriver en metod för att samla in tårprover med hjälp av Schirmer-remsor och ett integrerat kvantitativt arbetsflöde för att upptäcka icke-invasiva biomarkörer för tårproteiner. Arbetsflödet för beredning av suspensionsfångar prover möjliggör snabb och robust tårprovsberedning och masspektrometrisk analys, vilket resulterar i högre peptidåtervinningsutbyte och proteinidentifiering än standardprocedurer i lösning.
Tårvätska är en av de lättillgängliga biovätskor som kan samlas in icke-invasivt. Tear proteomics har potential att upptäcka biomarkörer för flera ögonsjukdomar och tillstånd. Suspensionskolonnen har rapporterats vara ett effektivt och användarvänligt arbetsflöde för provberedning för bred tillämpning av nedströms proteomikanalys. Ändå har denna strategi inte studerats väl i analysen av humant tårproteom. Det aktuella protokollet beskriver ett integrerat arbetsflöde från kliniska humana tårprover till renade peptider för icke-invasiv forskning om biomarkörer för tårproteiner med hjälp av masspektrometri, vilket ger insikter i sjukdomsbiomarkörer och övervakning i kombination med bioinformatisk analys. En provberedning med proteinsuspensionsfällor tillämpades och demonstrerade upptäckten av tårproteom med snabba, reproducerbara och användarvänliga procedurer, som en universell, optimerad provberedning för analys av mänsklig tårvätska. I synnerhet överträffade suspensionsfällningsproceduren provberedning i lösning när det gäller peptidåterhämtning, proteinidentifiering och kortare provberedningstid.
Tear proteomics har fått uppmärksamhet för att utforska potentiella biomarkörer för okulära sjukdomar och tillstånd 1,2,3,4,5,6, för att få tillgång till patogenesen av det okulära och systemiska tillståndet, samt för att utnyttja fördelen med icke-invasiv tårprovsinsamling med Schirmer-remsor. Den tekniska utvecklingen av nästa generations masspektrometri har möjliggjort proteinkvantifiering i mikroliterskala med noggrannhet och precision som inte varit möjlig tidigare. Provberedningsmetoderna är ännu inte standardiserade. Ett robust och standardiserat arbetsflöde för provberedning är avgörande för framgångsrik klinisk tillämpning inom forskning om biomarkörer för tårproteiner. Arbetsflödet för provberedning av suspensionsfällor (S-Trap) rapporterades nyligen som en effektiv och känslig provberedningsmetod för bred nedströms proteomikanalys 7,8. Ändå har denna strategi inte rapporterats väl i analysen av humant tårproteom, överträffat filterstödd provberedning (FASP) och nedbrytning i lösning när det gäller enzymatisk nedbrytningseffektivitet och det större antalet proteinidentifiering genom masspektrometrisk analys9. Det S-Trap-baserade tillvägagångssättet demonstrerades vid beredning av näthinnevävnad 10, formalinfixerad, paraffininbäddad (FFPE) vävnad11, celler 12, mikroorganism 13 och flytande biopsier14,15.
Detta protokoll beskriver ett integrerat kvantitativt arbetsflöde från kliniska prover till enzymatiskt smält protein för upptäckten av en icke-invasiv biomarkörpanel för tårprotein med en snabb, reproducerbar och robust teknisk strategi. I korthet samlades tårvätskan upp med hjälp av en standard Schirmer-remsa och torkades omedelbart med en oftalmisk ramvärmare för att förhindra proteinautolys vid rumstemperatur. Inbäddade totalproteiner extraherades med hjälp av 5 % natriumdodecylsulfat (SDS) lysbuffert enligt tillverkarens förslag, följt av proteinanalysmätning. Det extraherade lysatet genomgick sedan standardreduktion med ditiotreitol (DTT) och alkylering med jodacetamid (IAA).
Efter försurning med fosforsyra tillsattes suspensionsfångande proteinfällningsbuffert innehållande 90 % metanol och 100 mM trietylammoniumbikarbonat (TEAB) till aggregatproteinerna. Provet överfördes sedan till en ny upphängningsfångande mikrokolonn. Enzymatisk nedbrytning med sekvenseringsklassad trypsin i förhållandet 1:25 (vikt/vikt, trypsin: protein) vid 47 °C i 1 timme. De resulterande peptiderna eluerades sedan via centrifugering, sekventiellt med 50 mM TEAB, 0,2 % vattenhaltig myrsyra (FA) och 50 % acetonitril (ACN) innehållande 0,2 % FA. De eluerade peptiderna vakuumtorkades och rekonstituerades i 0,1 % FA. Peptidkoncentrationen mättes och justerades till 0,5 μg/μL för masspektrometrisk analys.
För att uppnå exakta resultat med denna metod bör kraftfria engångshandskar bäras i alla procedurer från tårprovsinsamling för att undvika provkontaminering. Det är viktigt att undvika bubblor och luftspalter mellan filtret och provlösningen i varje steg genom att använda mikrospinnkolonner. Om provvolymen är större än kolonnernas kapacitet, rekommenderas att upprepa processen. Detta protokoll har visat sig vara mer effektivt än det traditionella lösningsprotokollet när det gäller beredningstid, proteinåtervinning och total proteinidentifiering. Detta beror till stor del på att proverna genomgår de flesta av de nödvändiga procedurerna på samma kolonn, till skillnad från lösningsmetoden som involverar flera överföringssteg såsom acetonutfällning, uppslutning och sanering (avsaltning), vilket ökar sannolikheten för variationer i de resulterande data.
Förutom de tårprover som samlas in med mikrokapillärmetoden16,17, ger detta FASP-arbetsflöde med upphängningsfångande mikrokolonn en alternativ provberedningsmetod som möjliggör snabb och robust tårprovberedning som samlas in med Schirmer-remsor, med minimal materialförberedelse och användarvänliga steg att följa. Detta möjliggör reproducerbar tårprovsberedning för stora kohortstudier över flera ögonsjukdomar eller tillstånd med förbättrad peptidåterhämtning och proteinidentifiering av MS jämfört med procedurer i lösning. Denna tillförlitliga process kan användas regelbundet vid beredning av tårbiomarkörprover för forskning och andra kliniska ändamål. Viktigast av allt är att det kräver minimal personalutbildning för insamling på plats och förnekar behovet av provförvaring i en frys. Proverna torkas på plats för att minimera proteinautolys och nedbrytning. Därför möjliggör detta bekväm leverans via post för att underlätta nedströmsanalys, i motsats till att använda mikrokapillärrör.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av InnoHK-initiativet och Hongkongs regering i den särskilda administrativa regionen. Forskningscentrum för SHARP Vision; och Research Centre for Chinese Medicine Innovation (RCMI) vid Hong Kong Polytechnic University.
9 mm Plastic Screw Thread Vials | Thermo Scientific | C4000-11 | |
Acetonitrile, LCMS Grade | Anaqua | AC-1026 | |
Centrifuge MiniSpin plus | Eppendorf | 5453000097 | |
DL-dithiothreitol (DTT), BioUltra | Sigma-Aldrich | 43815 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
Formic acid, ACS reagent, ≥96% | Sigma-Aldrich | 695076 | |
Frame Heater OPTIMONSUN Electronic | Breitfeld & Schliekert GmbH | 1203166 | |
Iodoacetamide (IAA), BioUltra | Sigma-Aldrich | I1149 | |
Methanol, HPLC Grade | Anaqua | MA-1292 | |
Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes, 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 368632 | |
Phosphoric acid, 85 wt.% in H2O | Sigma-Aldrich | 345245 | |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A53225 | |
Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry | Sciex | TripleTOF 6600 | |
Schirmer Ophthalmic Strips | Entod Research Cell UK Ltd | I-DEW Tearstrips | |
S-Trap Micro Column | Protifi | C02-micro-80 | |
SureSTART 9 mm Screw Caps | Thermo Scientific | CHSC9-40 | |
Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M | Sigma-Aldrich | 18597 | |
Ultra-performance Liquid Chromatography | Eksigent | NanoLC 400 | |
UltraPure Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | 15525017 |