Summary

Bewertung der Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Elimination von Milchbiofilmen unter Verwendung eines Ansatzes, der statische und dynamische Methoden kombiniert

Published: December 09, 2022
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz, der statische und dynamische Methoden kombiniert, um die Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Beseitigung von Biofilmen in der Milchindustrie zu bewerten. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit neuer biologischer oder chemischer Formulierungen zur Bekämpfung von Biofilmen zu testen.

Abstract

Das Vorhandensein von Biofilmen in der Milchindustrie ist von großer Bedeutung, da sie aufgrund ihrer hohen Beständigkeit gegen die meisten Clean-in-Place-Verfahren (CIP), die häufig in Verarbeitungsbetrieben verwendet werden, zur Herstellung unsicherer und veränderter Milchprodukte führen können. Daher ist es unerlässlich, neue Strategien zur Biofilmkontrolle für die Milchindustrie zu entwickeln. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Wirksamkeit organischer Peroxysäuren (Peressigsäure, Perpropionsäure und Permilchsäure sowie ein kommerzielles Desinfektionsmittel auf Peressigsäurebasis) zur Beseitigung von Milchbiofilmen mit einer Kombination aus statischen und dynamischen Methoden zu bewerten. Alle Desinfektionsmittel wurden an den stärksten Biofilm-produzierenden Bakterien entweder in einem einzelnen oder einem gemischten Biofilm unter Verwendung des MBEC-Assays (Minimum Biofilm eradication Concentration), einer statischen Hochdurchsatz-Screening-Methode, getestet. Eine Kontaktzeit von 5 Minuten mit den Desinfektionsmitteln in den empfohlenen Konzentrationen beseitigte erfolgreich sowohl die einzelnen als auch die gemischten Biofilme. Derzeit laufen Studien, um diese Beobachtungen mit dem Biofilmreaktor des Center for Disease Control (CDC), einer dynamischen Methode zur Nachahmung von In-situ-Bedingungen , zu bestätigen. Diese Art von Bioreaktor ermöglicht die Verwendung einer Edelstahloberfläche, die die meisten industriellen Geräte und Oberflächen ausmacht. Die vorläufigen Ergebnisse des Reaktors scheinen die Wirksamkeit organischer Peroxysäuren gegen Biofilme zu bestätigen. Der in dieser Studie beschriebene kombinierte Ansatz kann verwendet werden, um neue biologische oder chemische Formulierungen zur Bekämpfung von Biofilmen und zur Ausrottung von Mikroorganismen zu entwickeln und zu testen.

Introduction

Die Milchindustrie ist ein wichtiger Industriezweig weltweit, auch in Kanada, wo es mehr als 10.500 Milchviehbetriebe gibt, die jedes Jahr fast 90 Millionen hl Milch produzieren1. Trotz der strengen Hygieneanforderungen in der Milchindustrie, auch in Verarbeitungsbetrieben, stellt Milch ein hervorragendes Nährmedium für Mikroorganismen dar, und daher enthalten Milchprodukte wahrscheinlich Mikroorganismen, einschließlich Verderb oder pathogener Mikroorganismen. Diese Krankheitserreger können verschiedene Krankheiten verursachen; Zum Beispiel können Salmonella sp. und Listeria monocytogenes Gastroenteritis bzw. Meningitisverursachen 2. Verderbnisfördernde Mikroorganismen können die Qualität und die organoleptischen Eigenschaften von Milchprodukten beeinträchtigen, indem sie Gase, extrazelluläre Enzyme oder Säuren produzieren3. Auch das Aussehen und die Farbe der Milch können verändert sein, z.B. durch Pseudomonas spp.4.

Einige dieser Mikroorganismen können Biofilme auf verschiedenen Oberflächen, einschließlich Edelstahl, bilden. Solche Biofilme ermöglichen die Persistenz und Vermehrung von Mikroorganismen auf der Oberfläche der Geräte und damit die Kontamination der Milchprodukte5. Biofilme sind auch problematisch, da sie die Wärmeübertragung behindern und die Korrosion der Geräte beschleunigen können, was zu einem vorzeitigen Austausch der Geräte und damit zu wirtschaftlichen Verlusten führt6.

Clean-in-Place-Verfahren (CIP) ermöglichen es der Lebensmittelindustrie, das Wachstum von Mikroorganismen zu kontrollieren. Diese Verfahren beinhalten die sequentielle Verwendung von Natriumhydroxid, Salpetersäure und manchmal Desinfektionsmitteln, die hypochlorige Säure und Peressigsäure 7,8 enthalten. Obwohl hypochlorige Säure hochwirksam gegen Mikroorganismen ist, reagiert sie auch mit natürlichen organischen Stoffen, was zur Bildung toxischer Nebenprodukte führt9. Peressigsäure erzeugt keine schädlichen Nebenprodukte10; Seine Wirksamkeit gegen Biofilme in der Lebensmittelindustrie ist jedoch sehr unterschiedlich10,11. In jüngster Zeit wurden andere Peroxysäuren, einschließlich Perpropion- und Permilchsäuren, auf ihre antimikrobielle Aktivität untersucht, und sie scheinen eine gute Alternative für die Kontrolle des mikrobiellen Wachstums in Biofilmen zu sein12,13.

Daher zielte diese Studie darauf ab, die Wirksamkeit organischer Peroxysäuren (Peressigsäure, Perpropionsäure und Permilchsäure sowie ein Desinfektionsmittel auf Peressigsäurebasis) zur Beseitigung von Milchbiofilmen unter Verwendung eines Ansatzes zu bewerten, der den MBEC-Assay (Minimum Biofilm eradication Concentration), eine statische Hochdurchsatz-Screening-Methode und den Biofilmreaktor des Center for Disease Control (CDC), eine dynamische Methode, die in situ nachahmt Bedingungen. Der MBEC-Assay wird im Folgenden im Protokoll als “Biofilm-Mikrotiterplatten” bezeichnet. Das hier vorgestellte Protokoll und die repräsentativen Ergebnisse belegen die Wirksamkeit organischer Peroxysäuren und ihre mögliche Anwendung zur Bekämpfung mikrobieller Biofilme in der Milchindustrie.

Protocol

Die in diesem Artikel enthaltenen Arbeiten erfordern ein Labor der Biosicherheitsstufe 2 und wurden zuvor vom institutionellen Biosicherheitsausschuss der Université Laval genehmigt (Projektnummer 119689). HINWEIS: Das Flussdiagramm in Abbildung 1 stellt eine Zusammenfassung der Methodik dar, die statische und dynamische Ansätze kombiniert, die zur Bewertung der Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Beseitigung von Biofilmen verwendet wurde. <p class="jo…

Representative Results

Die REM-Analyse zeigt das Vorhandensein von Biofilmen, die von P. azotoformans PFl1A produziert werden, auf den Biofilm-Mikroplattenstiften (Abbildung 2A). Es kann eine dreidimensionale Biofilmstruktur beobachtet werden. Der P. azotoformans PFl1A wurde zuvor unter Verwendung von 96-Well-Mikrotiterplatten12 als starker Biofilmproduzent (A570 > 1,5) identifiziert. Darüber hinaus schien der PFl1A-Biofilm von P…

Discussion

Der MBEC-Assay (Biofilm Microplate Assay) war die erste Methode, die von der ASTM17 als Standard-Biofilm-Eradikationstest anerkannt wurde. Unsere und andere Studien haben gezeigt, dass es bei der Verwendung dieses Assays zwei kritische Schritte gibt: den Beschallungsschritt (Zeit und Leistung) und die Behandlungszeit des Desinfektionsmittels18. Stewart und Parker schlugen auch andere Parameter vor, die das Ergebnis des Assays beeinflussen könnten, wie z. B. die mikrobielle…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde vom Consortium de Recherche et Innovations en Bioprocédés Industriels au Québec (CRIBIQ) (2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc und dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (RDCPJ516460-17) unterstützt. Wir danken Teresa Paniconi für die kritische Durchsicht des Manuskripts.

Materials

0.2 µm filters  Corning 09-754-28 diameter: 50 mm, PTFE- Membrane
316 stainless-steel disc coupon Biosurface Technologies Corporation RD128-316
316 stainless-steel slide coupon Biosurface Technologies Corporation CBR 2128-316
96-microtiter plate Corning 07-200-89 cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate 
Acetic acid Sigma Aldrich 27225 store at RT
Aluminium stubs Electron Microscopy Science 75830-10 32x5mm
Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25% Electron Microscopy Sciences 16220 store at -20 °C
AB204-S/FACT Analytical balance Mettler Toledo AB204-S
Bacterial Vent Filter (0.45 µm) Biosurface Technologies Corporation BST 02915
BioDestroy Groupe Sani Marc 09-10215 commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT
Carboy LDPE 20 L Cole Parmer 06031-52
CDC biofilm reactor Biosurface Technologies Corporation CRB 90 bioreactor
Cerium (IV) sulphate Thermo Scientific 35650-K2 store at RT
Confocal laser scanning microscope  LSM 700 Zeiss LSM 700
Dey-Engley neutralizing broth Millipore D3435-500G store at 4 °C
EMS950x + 350s gold sputter  Electron Microscopy Sciences
Epoxy resin Electron Microscopy Sciences 14121 with BDMA
Ethyl alcohol 95%, USP Greenfield global P016EA95 store at RT
Ferroin indicator solution Sigma Aldrich 318922-100ML store at RT
Filling/venting cap Cole Parmer RK-06258-00
FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit Invitrogen L10316 fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at – 20 °C
Glass flow break Biosurface Technologies Corporation FB 50
Gold with silver paint  Electron Microscopy Sciences 12684-15
Heating plate set Biosurface Technologies Corporation 110V Stir Plate
Hex screwdriver Biosurface Technologies Corporation CBR 5497
Hydrogen peroxide Sigma 216763 store at 4 °C
Inoculating loops VWR 12000-812 sterile, 10 µl
Lactic acid Laboratoire MAT LU-0200 store at RT
MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head Cole Parmer 77200-60
MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base Innovotech 19111 Biofilm microtiter plate
Oxford agar base Thermo Scientific OXCM0856B store at 4 °C
Plastic coupon holder Biosurface Technologies Corporation CBR 2203
Plastic slide holder rod Biosurface Technologies Corporation CBR 2203-GL
Potassium iodide Fisher Chemical P410-500 store at RT
Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm) Wiha 26015
Propionic acid Laboratoire MAT PF-0221 store at RT
Sartorius BCE822-1S Entris® II Basic Essential Toploading Balance Cole Parmer  UZ-11976-3
Scanning electron microscope JSM-6360LV model JEOL JSM-6360LV SEM and user control interface
Screw cap tube, 15 mL Sarstedt 62.554.205 (LxØ): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE
Screw cap tube, 50 mL Sarstedt 62.547.205 (LxØ): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences  12300 store at -20 °C
Sodium thiosulfate Thermo Scientific AC124270010 store at RT
Sonication bath Fisher 15-336-122 5,7 L
Starch solution Anachemia AC8615 store at RT
Sulfuric acid Sigma Aldrich 258105-500ML store at RT
Tryptic soy agar BD Bacto DF0369-17-6 store at RT
Tryptic soy broth BD Bacto DF0370-17-3 store at RT
Tubing Masterflex L/S 16 25' Cole Parmer MFX0642416
Tubing Masterflex L/S 18 25' Cole Parmer MFX0642418
Tygon SPT-3350 silicon tubing  Saint-Gobain ABW18NSF IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in.
Vortex Cole Palmer UZ-04724-00
Water bath  VWR 89202-970
Zen software Zeiss

References

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Goetz, C., Niboucha, N., Jubinville, E., Jean, J. Evaluation of the Efficacy of Organic Peroxyacids for Eradicating Dairy Biofilms Using an Approach Combining Static and Dynamic Methods. J. Vis. Exp. (190), e64619, doi:10.3791/64619 (2022).

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