Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz, der statische und dynamische Methoden kombiniert, um die Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Beseitigung von Biofilmen in der Milchindustrie zu bewerten. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit neuer biologischer oder chemischer Formulierungen zur Bekämpfung von Biofilmen zu testen.
Das Vorhandensein von Biofilmen in der Milchindustrie ist von großer Bedeutung, da sie aufgrund ihrer hohen Beständigkeit gegen die meisten Clean-in-Place-Verfahren (CIP), die häufig in Verarbeitungsbetrieben verwendet werden, zur Herstellung unsicherer und veränderter Milchprodukte führen können. Daher ist es unerlässlich, neue Strategien zur Biofilmkontrolle für die Milchindustrie zu entwickeln. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Wirksamkeit organischer Peroxysäuren (Peressigsäure, Perpropionsäure und Permilchsäure sowie ein kommerzielles Desinfektionsmittel auf Peressigsäurebasis) zur Beseitigung von Milchbiofilmen mit einer Kombination aus statischen und dynamischen Methoden zu bewerten. Alle Desinfektionsmittel wurden an den stärksten Biofilm-produzierenden Bakterien entweder in einem einzelnen oder einem gemischten Biofilm unter Verwendung des MBEC-Assays (Minimum Biofilm eradication Concentration), einer statischen Hochdurchsatz-Screening-Methode, getestet. Eine Kontaktzeit von 5 Minuten mit den Desinfektionsmitteln in den empfohlenen Konzentrationen beseitigte erfolgreich sowohl die einzelnen als auch die gemischten Biofilme. Derzeit laufen Studien, um diese Beobachtungen mit dem Biofilmreaktor des Center for Disease Control (CDC), einer dynamischen Methode zur Nachahmung von In-situ-Bedingungen , zu bestätigen. Diese Art von Bioreaktor ermöglicht die Verwendung einer Edelstahloberfläche, die die meisten industriellen Geräte und Oberflächen ausmacht. Die vorläufigen Ergebnisse des Reaktors scheinen die Wirksamkeit organischer Peroxysäuren gegen Biofilme zu bestätigen. Der in dieser Studie beschriebene kombinierte Ansatz kann verwendet werden, um neue biologische oder chemische Formulierungen zur Bekämpfung von Biofilmen und zur Ausrottung von Mikroorganismen zu entwickeln und zu testen.
Die Milchindustrie ist ein wichtiger Industriezweig weltweit, auch in Kanada, wo es mehr als 10.500 Milchviehbetriebe gibt, die jedes Jahr fast 90 Millionen hl Milch produzieren1. Trotz der strengen Hygieneanforderungen in der Milchindustrie, auch in Verarbeitungsbetrieben, stellt Milch ein hervorragendes Nährmedium für Mikroorganismen dar, und daher enthalten Milchprodukte wahrscheinlich Mikroorganismen, einschließlich Verderb oder pathogener Mikroorganismen. Diese Krankheitserreger können verschiedene Krankheiten verursachen; Zum Beispiel können Salmonella sp. und Listeria monocytogenes Gastroenteritis bzw. Meningitisverursachen 2. Verderbnisfördernde Mikroorganismen können die Qualität und die organoleptischen Eigenschaften von Milchprodukten beeinträchtigen, indem sie Gase, extrazelluläre Enzyme oder Säuren produzieren3. Auch das Aussehen und die Farbe der Milch können verändert sein, z.B. durch Pseudomonas spp.4.
Einige dieser Mikroorganismen können Biofilme auf verschiedenen Oberflächen, einschließlich Edelstahl, bilden. Solche Biofilme ermöglichen die Persistenz und Vermehrung von Mikroorganismen auf der Oberfläche der Geräte und damit die Kontamination der Milchprodukte5. Biofilme sind auch problematisch, da sie die Wärmeübertragung behindern und die Korrosion der Geräte beschleunigen können, was zu einem vorzeitigen Austausch der Geräte und damit zu wirtschaftlichen Verlusten führt6.
Clean-in-Place-Verfahren (CIP) ermöglichen es der Lebensmittelindustrie, das Wachstum von Mikroorganismen zu kontrollieren. Diese Verfahren beinhalten die sequentielle Verwendung von Natriumhydroxid, Salpetersäure und manchmal Desinfektionsmitteln, die hypochlorige Säure und Peressigsäure 7,8 enthalten. Obwohl hypochlorige Säure hochwirksam gegen Mikroorganismen ist, reagiert sie auch mit natürlichen organischen Stoffen, was zur Bildung toxischer Nebenprodukte führt9. Peressigsäure erzeugt keine schädlichen Nebenprodukte10; Seine Wirksamkeit gegen Biofilme in der Lebensmittelindustrie ist jedoch sehr unterschiedlich10,11. In jüngster Zeit wurden andere Peroxysäuren, einschließlich Perpropion- und Permilchsäuren, auf ihre antimikrobielle Aktivität untersucht, und sie scheinen eine gute Alternative für die Kontrolle des mikrobiellen Wachstums in Biofilmen zu sein12,13.
Daher zielte diese Studie darauf ab, die Wirksamkeit organischer Peroxysäuren (Peressigsäure, Perpropionsäure und Permilchsäure sowie ein Desinfektionsmittel auf Peressigsäurebasis) zur Beseitigung von Milchbiofilmen unter Verwendung eines Ansatzes zu bewerten, der den MBEC-Assay (Minimum Biofilm eradication Concentration), eine statische Hochdurchsatz-Screening-Methode und den Biofilmreaktor des Center for Disease Control (CDC), eine dynamische Methode, die in situ nachahmt Bedingungen. Der MBEC-Assay wird im Folgenden im Protokoll als “Biofilm-Mikrotiterplatten” bezeichnet. Das hier vorgestellte Protokoll und die repräsentativen Ergebnisse belegen die Wirksamkeit organischer Peroxysäuren und ihre mögliche Anwendung zur Bekämpfung mikrobieller Biofilme in der Milchindustrie.
Der MBEC-Assay (Biofilm Microplate Assay) war die erste Methode, die von der ASTM17 als Standard-Biofilm-Eradikationstest anerkannt wurde. Unsere und andere Studien haben gezeigt, dass es bei der Verwendung dieses Assays zwei kritische Schritte gibt: den Beschallungsschritt (Zeit und Leistung) und die Behandlungszeit des Desinfektionsmittels18. Stewart und Parker schlugen auch andere Parameter vor, die das Ergebnis des Assays beeinflussen könnten, wie z. B. die mikrobielle…
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde vom Consortium de Recherche et Innovations en Bioprocédés Industriels au Québec (CRIBIQ) (2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc und dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (RDCPJ516460-17) unterstützt. Wir danken Teresa Paniconi für die kritische Durchsicht des Manuskripts.
0.2 µm filters | Corning | 09-754-28 | diameter: 50 mm, PTFE- Membrane |
316 stainless-steel disc coupon | Biosurface Technologies Corporation | RD128-316 | |
316 stainless-steel slide coupon | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2128-316 | |
96-microtiter plate | Corning | 07-200-89 | cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 27225 | store at RT |
Aluminium stubs | Electron Microscopy Science | 75830-10 | 32x5mm |
Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16220 | store at -20 °C |
AB204-S/FACT Analytical balance | Mettler Toledo | AB204-S | |
Bacterial Vent Filter (0.45 µm) | Biosurface Technologies Corporation | BST 02915 | |
BioDestroy | Groupe Sani Marc | 09-10215 | commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT |
Carboy LDPE 20 L | Cole Parmer | 06031-52 | |
CDC biofilm reactor | Biosurface Technologies Corporation | CRB 90 | bioreactor |
Cerium (IV) sulphate | Thermo Scientific | 35650-K2 | store at RT |
Confocal laser scanning microscope LSM 700 | Zeiss | LSM 700 | |
Dey-Engley neutralizing broth | Millipore | D3435-500G | store at 4 °C |
EMS950x + 350s gold sputter | Electron Microscopy Sciences | ||
Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14121 | with BDMA |
Ethyl alcohol 95%, USP | Greenfield global | P016EA95 | store at RT |
Ferroin indicator solution | Sigma Aldrich | 318922-100ML | store at RT |
Filling/venting cap | Cole Parmer | RK-06258-00 | |
FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at – 20 °C |
Glass flow break | Biosurface Technologies Corporation | FB 50 | |
Gold with silver paint | Electron Microscopy Sciences | 12684-15 | |
Heating plate set | Biosurface Technologies Corporation | 110V Stir Plate | |
Hex screwdriver | Biosurface Technologies Corporation | CBR 5497 | |
Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | store at 4 °C |
Inoculating loops | VWR | 12000-812 | sterile, 10 µl |
Lactic acid | Laboratoire MAT | LU-0200 | store at RT |
MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head | Cole Parmer | 77200-60 | |
MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base | Innovotech | 19111 | Biofilm microtiter plate |
Oxford agar base | Thermo Scientific | OXCM0856B | store at 4 °C |
Plastic coupon holder | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203 | |
Plastic slide holder rod | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203-GL | |
Potassium iodide | Fisher Chemical | P410-500 | store at RT |
Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm) | Wiha | 26015 | |
Propionic acid | Laboratoire MAT | PF-0221 | store at RT |
Sartorius BCE822-1S Entris® II Basic Essential Toploading Balance | Cole Parmer | UZ-11976-3 | |
Scanning electron microscope JSM-6360LV model | JEOL | JSM-6360LV | SEM and user control interface |
Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.205 | (LxØ): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
Screw cap tube, 50 mL | Sarstedt | 62.547.205 | (LxØ): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
Sodium Cacodylate Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | store at -20 °C |
Sodium thiosulfate | Thermo Scientific | AC124270010 | store at RT |
Sonication bath | Fisher | 15-336-122 | 5,7 L |
Starch solution | Anachemia | AC8615 | store at RT |
Sulfuric acid | Sigma Aldrich | 258105-500ML | store at RT |
Tryptic soy agar | BD Bacto | DF0369-17-6 | store at RT |
Tryptic soy broth | BD Bacto | DF0370-17-3 | store at RT |
Tubing Masterflex L/S 16 25' | Cole Parmer | MFX0642416 | |
Tubing Masterflex L/S 18 25' | Cole Parmer | MFX0642418 | |
Tygon SPT-3350 silicon tubing | Saint-Gobain | ABW18NSF | IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in. |
Vortex | Cole Palmer | UZ-04724-00 | |
Water bath | VWR | 89202-970 | |
Zen software | Zeiss |