Summary

Kultur og avbildning av Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Skiver fra resected Human Tumor Specimens

Published: December 09, 2022
doi:

Summary

Vi beskriver en protokoll for produksjon, kultur og visualisering av humane kreftformer, som har metastasert til peritoneale overflater. Resekterte tumorprøver kuttes ved hjelp av en vibratome og dyrkes på permeable innlegg for økt oksygenering og levedyktighet, etterfulgt av avbildning og nedstrømsanalyser ved hjelp av konfokalmikroskopi og flowcytometri.

Abstract

Pseudomyxoma peritonei (PMP) er en sjelden tilstand som skyldes spredning av en mucinøs primærtumor og den resulterende akkumuleringen av mucinutskillende tumorceller i bukhulen. PMP kan oppstå fra ulike typer kreftformer, inkludert blindtarm, eggstokk og kolorektal, selv om appendikeale neoplasmer er langt den vanligste etiologien. PMP er utfordrende å studere på grunn av sin (1) sjeldenhet, (2) begrensede murine modeller, og (3) mucinøs, acellulær histologi. Metoden som presenteres her tillater sanntidsvisualisering og undersøkelse av disse tumortypene ved bruk av pasientavledede ex vivo organotypiske skiver i et preparat der tumormikromiljøet (TME) forblir intakt. I denne protokollen beskriver vi først fremstilling av tumorskiver ved hjelp av en vibratomi og påfølgende langtidskultur. For det andre beskriver vi konfokal avbildning av tumorskiver og hvordan man overvåker funksjonelle avlesninger av levedyktighet, kalsiumavbildning og lokal spredning. Kort sagt, skiver er lastet med bildebehandlingsfarger og plasseres i et bildekammer som kan monteres på et konfokalmikroskop. Time-lapse-videoer og konfokale bilder brukes til å vurdere den opprinnelige levedyktigheten og cellulær funksjonalitet. Denne prosedyren utforsker også translasjonell cellulær bevegelse og parakrine signaleringsinteraksjoner i TME. Til slutt beskriver vi en dissosiasjonsprotokoll for tumorskiver som skal brukes til flowcytometrianalyse. Kvantitativ flowcytometrianalyse kan brukes til benk-til-seng-terapeutisk testing for å bestemme endringer som skjer i immunlandskapet og epitelcelleinnhold.

Introduction

Pseudomyxoma peritonei (PMP) er sjeldent syndrom med en forekomst på 1 per million mennesker per år1. De fleste PMP-tilfeller skyldes metastaser fra appendikeale svulster. Gitt at mus ikke har en menneskelignende blindtarm, er modellering av denne typen kreft fortsatt ekstremt utfordrende. Mens den primære sykdommen ofte kan kureres ved kirurgisk reseksjon, er behandlingsmuligheter for metastatisk sykdom begrenset. Derfor er begrunnelsen for å utvikle denne nye organotypiske skivemodellen å studere patobiologien til PMP. Til dags dato er det ingen appendikale organoidmodeller som kan dyrkes evig; Imidlertid ble en nylig modell vist å være nyttig for farmakologisk testing av terapeutiske midler og immunterapi2. Som sådan har vi tilpasset et organotypisk skivekultursystem, som har blitt brukt i andre typer menneskelige kreftformer, som hjerne, bryst, bukspyttkjertel, lunge, eggstokk og andre 3,4,5,6.

I tillegg til appendikeale neoplasmer, skyldes PMP av og til andre tumortyper, inkludert eggstokkreft7, og i sjeldne tilfeller intraduktale papillære mucinøse neoplasmer8 og tykktarmskreft9. I tillegg har disse svulstene en tendens til å vokse sakte, med dårlige engrafthastigheter i pasientavledet xenograft (PDX) modeller10,11. Gitt disse utfordringene, er det et uoppfylt behov for å utvikle modeller for å studere denne sykdommen for å begynne å forstå patobiologien til PMP, og hvordan disse kreftcellene: rekrutteres til peritoneale overflater, sprer seg og unnslipper immunovervåking.

Mens de er kuttet fra den systemiske vaskulære sirkulasjonen, inneholder tumorskiver cellulære og acellulære komponenter, inkludert den ekstracellulære matrisen, stromale celler, immunceller, kreftceller, endotelceller og nerver. Dette semi-intakte mikromiljøet muliggjør funksjonell undersøkelse av disse celletypene, noe som er unikt fordelaktig sammenlignet med 3D-organoidkulturer, som bare består av kreftceller12. Mens organotypiske skivekulturer er fordelaktige i noen henseender, er de også iboende en lavkapasitetsbasert tilnærming, sammenlignet med 3D-organoider, som kan utvides, og er egnet for multiplekset undersøkelsesterapeutisk legemiddelscreening13,14,15. Når det gjelder PMP, er det ikke rapportert om pålitelig etablering og evigvarende passering av PMP-deriverte organoider16. Dette skyldes sannsynligvis den langsomt voksende naturen til PMP-avledede tumorceller, samt det lave antallet ondartede epitelceller som finnes i disse mucinøse svulstene. Gitt behovet for å utvikle modeller for å studere PMP, er organotypiske skiver unikt egnet til å studere denne sykdommen. Vi presenterer en protokoll for å forberede, avbilde og analysere PMP fra humane prøver.

Protocol

Avidentifisering og oppkjøp av alle vev ble utført under en IRB-godkjent protokoll ved University of California, San Diego. 1. Fremstilling av humant PMP-vev for vevsbehandling og kultur Transport av tumorvev og mikrodisseksjonForbered transport- og kulturmediet: fullfør 10% (v / v) Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin (Pen streptokokker). Ved vevsankomst og i henhold til en institusjonel…

Representative Results

Kort sagt, humane tumorprøver fra PMP oppnås under en IRB-godkjent protokoll. Vevet fremstilles, mikrodissekeres og størknes i en agaroseform som skal kuttes ved hjelp av en vibratome (figur 1A; Video 1). Etter kutt plasseres vevsskiver og dyrkes på permeable innsatsmembraner (figur 1B), som kan brukes til avbildningsanalyser in situ, samt til cellulær og funksjonell avhør ved hjelp av flowcytometri, konfokal bildeanalyse og cytot…

Discussion

Dette manuskriptet beskriver en teknikk som kan brukes til å dyrke, forhøre og analysere humane pseudomyxoma peritonei (PMP) tumorprøver. Vi har benyttet mange nedstrøms funksjonelle analyser for å forhøre tumorimmunmikromiljøet og en plattform for benk-til-senge-testing.

Selv om metoden er svært effektiv i våre hender, vil det kreve litt øvelse å kutte tumorprøver ved hjelp av en vibratom. Vi opplevde nemlig problemer som skyldtes svært mucinøse prøver, samt prøver som feilakt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gjerne takke Kersi Pestonjamasp fra Moores Cancer Center imaging kjerneanlegg for hjelp med mikroskopene UCSD Specialized Cancer Support Center P30 stipend 2P30CA023100. Dette arbeidet ble i tillegg støttet av et JoVE-publikasjonsstipend (JRW), samt sjenerøse gaver fra boet til Elisabeth og Ad Creemers, Euske Family Foundation, Gastrointestinal Cancer Research Fund og Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).

Materials

1 M CaCl2 solution Sigma 21115
1 M HEPES solution Sigma H0887
1 M MgCl2 solution  Sigma M1028
100 micron filter ThermoFisher 22-363-549
22 x 40 glass coverslips Daiggerbrand G15972H
3 M KCl solution Sigma 60135
5 M NaCl solution Sigma S5150
ATPγS  Tocris  4080
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
Calcein-AM  Invitrogen L3224
CD11b  Biolegend 101228
CD206  Biolegend 321140
CD3 Biolegend 555333
CD4  Biolegend 357410
CD45  Biolegend 304006
CD8  Biolegend 344721
CellTiter-Glo  Promega G9681
DMEM  Thermo Fisher 11965084
DPBS  Sigma Aldrich D8537
FBS, heat inactivated ThermoFisher 16140071
Fc-block  BD Biosciences 564220
Fluo-4 Thermo Fisher F14201
Gentle Collagenase/Hyaluronidase  Stem Cell 7912
Imaging Chamber Warner Instruments RC-26
Imaging Chamber Platform Warner Instruments PH-1
LD-Blue  Biolegend L23105
L-Glutamine 200 mM ThermoFisher 25030081
LIVE/DEAD imaging dyes Thermofisher R37601
Nikon Ti microscope  Nikon Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. 
Peristaltic pump  Isamtec ISM832C
Propidium Iodide Invitrogen L3224
Vacuum silicone grease Sigma Z273554-1EA

References

  1. Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J. Pseudomyxoma peritonei. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2 (1), 44-50 (2010).
  2. Votanopoulos, K. I., et al. Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study. Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).
  3. Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).
  4. Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
  5. Misra, S., et al. Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 2133 (2019).
  6. Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture. Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).
  7. Seidman, J. D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases. The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).
  8. Mizuta, Y., et al. Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas. Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).
  9. Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review. Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).
  10. Fleten, K. G., et al. Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models. Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).
  11. Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. W., Govindarajan, V. Patient-derived xenograft mouse models of pseudomyxoma peritonei recapitulate the human inflammatory tumor microenvironment. Cancer Medicine. 5 (4), 711-719 (2016).
  12. Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
  13. Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
  14. Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
  15. Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
  16. Carr, N. J. New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy. Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).
  17. Votanopoulos, K. I., et al. Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy. Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).
  18. Weitz, J., et al. An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape. Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).
  19. Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
  20. Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).

Play Video

Cite This Article
Weitz, J., Montecillo Gulay, K. C., Hurtado de Mendoza, T., Tiriac, H., Baumgartner, J., Kelly, K., Veerapong, J., Lowy, A. M. Culture and Imaging of Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Slices from Resected Human Tumor Specimens. J. Vis. Exp. (190), e64620, doi:10.3791/64620 (2022).

View Video