Vi beskriver en protokoll for produksjon, kultur og visualisering av humane kreftformer, som har metastasert til peritoneale overflater. Resekterte tumorprøver kuttes ved hjelp av en vibratome og dyrkes på permeable innlegg for økt oksygenering og levedyktighet, etterfulgt av avbildning og nedstrømsanalyser ved hjelp av konfokalmikroskopi og flowcytometri.
Pseudomyxoma peritonei (PMP) er en sjelden tilstand som skyldes spredning av en mucinøs primærtumor og den resulterende akkumuleringen av mucinutskillende tumorceller i bukhulen. PMP kan oppstå fra ulike typer kreftformer, inkludert blindtarm, eggstokk og kolorektal, selv om appendikeale neoplasmer er langt den vanligste etiologien. PMP er utfordrende å studere på grunn av sin (1) sjeldenhet, (2) begrensede murine modeller, og (3) mucinøs, acellulær histologi. Metoden som presenteres her tillater sanntidsvisualisering og undersøkelse av disse tumortypene ved bruk av pasientavledede ex vivo organotypiske skiver i et preparat der tumormikromiljøet (TME) forblir intakt. I denne protokollen beskriver vi først fremstilling av tumorskiver ved hjelp av en vibratomi og påfølgende langtidskultur. For det andre beskriver vi konfokal avbildning av tumorskiver og hvordan man overvåker funksjonelle avlesninger av levedyktighet, kalsiumavbildning og lokal spredning. Kort sagt, skiver er lastet med bildebehandlingsfarger og plasseres i et bildekammer som kan monteres på et konfokalmikroskop. Time-lapse-videoer og konfokale bilder brukes til å vurdere den opprinnelige levedyktigheten og cellulær funksjonalitet. Denne prosedyren utforsker også translasjonell cellulær bevegelse og parakrine signaleringsinteraksjoner i TME. Til slutt beskriver vi en dissosiasjonsprotokoll for tumorskiver som skal brukes til flowcytometrianalyse. Kvantitativ flowcytometrianalyse kan brukes til benk-til-seng-terapeutisk testing for å bestemme endringer som skjer i immunlandskapet og epitelcelleinnhold.
Pseudomyxoma peritonei (PMP) er sjeldent syndrom med en forekomst på 1 per million mennesker per år1. De fleste PMP-tilfeller skyldes metastaser fra appendikeale svulster. Gitt at mus ikke har en menneskelignende blindtarm, er modellering av denne typen kreft fortsatt ekstremt utfordrende. Mens den primære sykdommen ofte kan kureres ved kirurgisk reseksjon, er behandlingsmuligheter for metastatisk sykdom begrenset. Derfor er begrunnelsen for å utvikle denne nye organotypiske skivemodellen å studere patobiologien til PMP. Til dags dato er det ingen appendikale organoidmodeller som kan dyrkes evig; Imidlertid ble en nylig modell vist å være nyttig for farmakologisk testing av terapeutiske midler og immunterapi2. Som sådan har vi tilpasset et organotypisk skivekultursystem, som har blitt brukt i andre typer menneskelige kreftformer, som hjerne, bryst, bukspyttkjertel, lunge, eggstokk og andre 3,4,5,6.
I tillegg til appendikeale neoplasmer, skyldes PMP av og til andre tumortyper, inkludert eggstokkreft7, og i sjeldne tilfeller intraduktale papillære mucinøse neoplasmer8 og tykktarmskreft9. I tillegg har disse svulstene en tendens til å vokse sakte, med dårlige engrafthastigheter i pasientavledet xenograft (PDX) modeller10,11. Gitt disse utfordringene, er det et uoppfylt behov for å utvikle modeller for å studere denne sykdommen for å begynne å forstå patobiologien til PMP, og hvordan disse kreftcellene: rekrutteres til peritoneale overflater, sprer seg og unnslipper immunovervåking.
Mens de er kuttet fra den systemiske vaskulære sirkulasjonen, inneholder tumorskiver cellulære og acellulære komponenter, inkludert den ekstracellulære matrisen, stromale celler, immunceller, kreftceller, endotelceller og nerver. Dette semi-intakte mikromiljøet muliggjør funksjonell undersøkelse av disse celletypene, noe som er unikt fordelaktig sammenlignet med 3D-organoidkulturer, som bare består av kreftceller12. Mens organotypiske skivekulturer er fordelaktige i noen henseender, er de også iboende en lavkapasitetsbasert tilnærming, sammenlignet med 3D-organoider, som kan utvides, og er egnet for multiplekset undersøkelsesterapeutisk legemiddelscreening13,14,15. Når det gjelder PMP, er det ikke rapportert om pålitelig etablering og evigvarende passering av PMP-deriverte organoider16. Dette skyldes sannsynligvis den langsomt voksende naturen til PMP-avledede tumorceller, samt det lave antallet ondartede epitelceller som finnes i disse mucinøse svulstene. Gitt behovet for å utvikle modeller for å studere PMP, er organotypiske skiver unikt egnet til å studere denne sykdommen. Vi presenterer en protokoll for å forberede, avbilde og analysere PMP fra humane prøver.
Dette manuskriptet beskriver en teknikk som kan brukes til å dyrke, forhøre og analysere humane pseudomyxoma peritonei (PMP) tumorprøver. Vi har benyttet mange nedstrøms funksjonelle analyser for å forhøre tumorimmunmikromiljøet og en plattform for benk-til-senge-testing.
Selv om metoden er svært effektiv i våre hender, vil det kreve litt øvelse å kutte tumorprøver ved hjelp av en vibratom. Vi opplevde nemlig problemer som skyldtes svært mucinøse prøver, samt prøver som feilakt…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Kersi Pestonjamasp fra Moores Cancer Center imaging kjerneanlegg for hjelp med mikroskopene UCSD Specialized Cancer Support Center P30 stipend 2P30CA023100. Dette arbeidet ble i tillegg støttet av et JoVE-publikasjonsstipend (JRW), samt sjenerøse gaver fra boet til Elisabeth og Ad Creemers, Euske Family Foundation, Gastrointestinal Cancer Research Fund og Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).
1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
ATPγS | Tocris | 4080 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
CD11b | Biolegend | 101228 | |
CD206 | Biolegend | 321140 | |
CD3 | Biolegend | 555333 | |
CD4 | Biolegend | 357410 | |
CD45 | Biolegend | 304006 | |
CD8 | Biolegend | 344721 | |
CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |