Denne artikkelen beskriver en ny metode for å studere atferd ved tømming av mus ved å innlemme videoovervåking i den konvensjonelle tomromspotanalysen. Denne tilnærmingen gir tidsmessig, romlig og volumetrisk informasjon om tomromshendelsene og detaljer om museadferd i dagens lyse og mørke faser.
Normal tømmingsadferd er resultatet av den koordinerte funksjonen til blæren, urinrøret og urinrørsfinkterne under riktig kontroll av nervesystemet. For å studere frivillig tømmingsadferd i musemodeller har forskere utviklet VSA, en metode som måler antall og areal av urinflekker avsatt på et filterpapir som fôrer gulvet i et dyrs bur. Selv om den er teknisk enkel og billig, har denne analysen begrensninger når den brukes som en endepunktsanalyse, inkludert mangel på tidsmessig oppløsning av tømmingshendelser og vanskeligheter med å kvantifisere overlappende urinflekker. For å overvinne disse begrensningene utviklet vi en videoovervåket VSA, som vi kaller sanntids VSA (RT-VSA), og som lar oss bestemme tømmingsfrekvens, vurdere tømmervolum og tømmingsmønstre, og foreta målinger over 6 timers tidsvinduer i både mørke og lyse faser av dagen. Metoden beskrevet i denne rapporten kan brukes på et bredt spekter av musebaserte studier som undersøker de fysiologiske og nevroatferdsmessige aspektene ved frivillig vannlating i helse- og sykdomstilstander.
Urinlagring og vannlating koordineres av en sentralkrets (sentralnervesystemet) som mottar informasjon om blærefyllingsstatus gjennom bekkenet og hypogastriske nerver. Urotelet, epitelet som strekker urinveiene fra nyrebekkenet til det proksimale urinrøret, danner en tett barriere mot metabolske avfallsprodukter og patogener som er tilstede i urinen. Det er en integrert del av et sensorisk nett, som sanser og kommuniserer blærens fyllingstilstand til underliggende vev og afferente nerver 1,2. Forstyrrelse av urotelbarrieren, eller endringer i uroteliale mekanotransduksjonsveier, kan føre til tømming av dysfunksjon sammen med nedre urinveissymptomer som frekvens, haster, nokturi og inkontinens 3,4,5,6,7. På samme måte er aldring, diabetes, nedre urinveisinfeksjoner, interstitiell cystitt og andre sykdomsprosesser som påvirker urinblæren, eller tilhørende kretsløp som styrer funksjonen, kjent for å forårsake blæredysfunksjon 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. En bedre forståelse av normal og unormal tømming atferd avhenger av utvikling av metoder som kan pålitelig diskriminere mellom ulike vannlating mønstre.
Tradisjonelt har musens frivillige tømmingsadferd blitt studert ved hjelp av void spot assay (VSA), utviklet av Desjardins og kolleger20, og bredt vedtatt på grunn av sin enkelhet, lave kostnader og ikke-invasiv tilnærming 8,21,22,23,24. Denne analysen utføres vanligvis som en endepunktsanalyse, der en mus tilbringer en definert tid i et bur foret med et filterpapir, som deretter analyseres ved å telle antallet og vurdere størrelsen på urinflekker når filterpapiret plasseres under ultrafiolett (UV) lys (urinflekkene fluorescerer under disse forholdene)20. Til tross for disse mange fordelene, presenterer den tradisjonelle VSA noen store begrensninger. Fordi mus ofte urinerer i de samme områdene, må etterforskerne begrense varigheten av analysen til en relativt kort periode (≤4 timer) 25. Selv når VSA utføres over kortere tidsperioder, er det nesten umulig å løse små tomromsflekker (SVS) som faller over store tomromsflekker eller, for å diskriminere SVS-er fra overføring av urin festet til haler eller poter. Det er også svært vanskelig å skille om SVS-er er en konsekvens av hyppige, men individuelle tømmingshendelser (en fenotype som ofte observeres som respons på cystitt 4,26), eller på grunn av dribling etter miksjon (en fenotype assosiert med blæreutløpsobstruksjon27). Videre begrenser ønsket om å fullføre analysen i arbeidstiden, kombinert med vanskeligheter med å få tilgang til boligfasiliteter når lysene er slått av, ofte disse analysene til lysperioden i 24 timers sirkadisk syklus. Dermed forhindrer disse tidsbegrensningene evaluering av musetømmingsadferd i løpet av deres aktive nattfase, og reduserer evnen til å analysere spesifikke gener eller behandlinger som styres av sirkadiske rytmer.
For å overvinne noen av disse begrensningene har forskere utviklet alternative metoder for å vurdere tømmingsadferd i sanntid 26,28,29,30,31,32. Noen av disse tilnærmingene innebærer bruk av dyrt utstyr som metabolske bur26,28,29, eller bruk av termiske kameraer30; Men også disse har begrensninger. For eksempel, i metabolske bur, har urinen en tendens til å holde seg til ledningene i nettgulvet og til traktens vegger, og reduserer mengden urin som samles og måles. Dermed kan det være vanskelig å samle inn data om små hulrom nøyaktig. Videre gir metabolske bur ikke informasjon om den romlige fordelingen av tømmingshendelsene (dvs. vannlating i hjørnene vs. midten av kammeret). Gitt at langbølget infrarød stråling som brukes av termografiske kameraer ikke trenger gjennom faste stoffer, må tømmingsaktivitet vurdert ved videotermografi utføres i et åpent system, noe som kan være utfordrende med aktive mus, da de kan hoppe flere centimeter i luften. Et annet system er den automatiserte tomme flekken på papir (aVSOP) tilnærming33, som består av valset filterpapir som vinder opp med konstant hastighet under nettinggulvet i et musebur. Denne tilnærmingen forhindrer papirskader og overlapping av urinflekker som forekommer i den klassiske VSA, og implementeringen gjør det mulig for etterforskeren å utføre eksperimenter over flere dager. Det gir imidlertid ikke etterforskeren nøyaktig timing av tømmingshendelsene, og det er ingen evne til å undersøke atferd og hvordan den korrelerer med spotting. For å få denne informasjonen har forskere innlemmet videoovervåking til tømmingsanalyser, en tilnærming som tillater samtidig vurdering av museaktivitet og urineringshendelser31,32. En tilnærming består av å plassere en blålysdiode (LED) og et videokamera med et grønt fluorescensproteinfilter satt under forsøksburet for å visualisere tømmingshendelsene, og en infrarød LED og et videokamera over buret for å fange museposisjon32. Dette oppsettet har blitt brukt til å overvåke tømmingsadferd mens du utfører fiberfotometri; Imidlertid krevde det sterkt opplyste miljøet i dette systemet at etterforskerne behandlet musene sine med et vanndrivende middel for å stimulere tømming. I et annet eksperimentelt design ble vidvinkelkameraer plassert over og under eksperimentburet for å visualisere henholdsvis musemotoraktivitet og urineringshendelser. I dette tilfellet ble urinflekker avsatt på et filterpapir som fôrer burets gulv avslørt ved å belyse filterpapiret med UV-lys plassert under buret31. Dette oppsettet ble brukt i korte analyser, 4 min i varighet, i lysfasen av dagen for å studere hjernestammenevronene som er involvert i frivillig tømmingsadferd31. Egnetheten til dette systemet for bruk i mørkefasen eller i perioder >4 minutter ble ikke rapportert.
I denne artikkelen beskrives en metode som forbedrer den tradisjonelle VSA ved å tillate langsiktig videoovervåking av musetømmingsadferd. Denne kostnadseffektive tilnærmingen gir tidsmessig, romlig og volumetrisk informasjon om tømmingshendelser i lengre perioder i løpet av dagens lyse og mørke faser, sammen med detaljer relatert til museadferd 3,4,34. Detaljert informasjon for bygging av tømmerommene, implementering av en sanntids VSA (RT-VSA) og analyse av dataene er gitt. RT-VSA er verdifull for forskere som ønsker å forstå de fysiologiske mekanismene som styrer funksjonen til urinsystemet, å utvikle farmakologiske tilnærminger for å kontrollere mikturering, og å definere det molekylære grunnlaget for sykdomsprosesser som påvirker nedre urinveiene.
Inkorporering av videoovervåking er en kostnadseffektiv modifikasjon som gir flere fordeler i forhold til den klassiske VSA. I klassisk VSA, som vanligvis brukes som endepunktsanalyse, er det vanskelig å skille overlappende tomromsflekker. Dette er ikke en triviell bekymring, da mus har en tendens til å urinere flere ganger i samme område når analysen forlenges i flere timer, vanligvis i hjørnene av buret. Dermed er den første fordelen med RT-VSA at etterforskeren lett kan identifisere individuelle flekker som har…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en NIH-stipend R01DK119183 (til GA og MDC), en pilotprosjektpris gjennom P30DK079307 (til MGD), en American Urology Association Career Development Award og et Winters Foundation-stipend (til NM), og av Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores fra Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 10 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 20 |
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 12 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 6 |
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 40 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 4 |
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 12 |
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 32 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 5 |
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut | 80/20 | 3280 | Amount: 16 |
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut | 80/20 | 3287 | Amount: 18 |
10 & 25 Series 2 Hole – 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support | 80/20 | 14061 | Amount: 6 |
10 Series 3 Hole – Straight Flat Plate | 80/20 | 4118 | Amount: 8 |
10 Series 5 Hole – "L" Flat Plate | 80/20 | 4081 | Amount: 8 |
10 Series 5 Hole – "T" Flat Plate | 80/20 | 4080 | Amount: 8 |
10 Series 5 Hole – Tee Flat Plate | 80/20 | 4140 | Amount: 2 |
10 Series Standard Lift-Off Hinge – Right Hand Assembly | 80/20 | 2064 | Amount: 2 |
10 to 15 Series 2 Hole – Lite Transition Inside Corner Bracket | 80/20 | 4509 | Amount: 6 |
24”-long UV tube lights | ADJ Products LLC | T8-F20BLB24 | Amount: 2 20W bulb – 24” Wavelength: 365nm |
Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 1 82.5 cm x 26.5 cm |
|
Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 2 26.5 cm X 30.5 cm |
|
Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 2 82.5 cm x 30.5 cm |
|
AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 2 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm |
AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm |
AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm |
AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm |
AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm |
Chromatography paper (thin paper) | Thermo Fisher Scientific | 57144 | |
Cosmos blotting paper (thick paper) | Blick Art Materials | 10422-1005 | |
Excel | Microsoft Corporation | ||
GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 9.4.0 | graphing and statistics software |
ImageJ FIJI | NIH | ||
Parafilm | Merck | transparent film | |
Quick Time Player 10.5 software | Apple | multimedia player | |
Security spy | Ben software | video surveillance software system | |
Standard End Fastener, 1/4-20 | 80/20 | 3381 | Amount: 80 |
UV transmitting acrylic | Spartech | Polycast Solacryl SUVT | Amount: 2 38.5 cm x 26.5 cm |
Water gel: HydroGel | ClearH2O | 70-01-5022 | (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/) |
Webcam | Logitech | C930e | Amount: 4 |