Summary

Void Spot-analyse i sanntid

Published: February 10, 2023
doi:

Summary

Denne artikkelen beskriver en ny metode for å studere atferd ved tømming av mus ved å innlemme videoovervåking i den konvensjonelle tomromspotanalysen. Denne tilnærmingen gir tidsmessig, romlig og volumetrisk informasjon om tomromshendelsene og detaljer om museadferd i dagens lyse og mørke faser.

Abstract

Normal tømmingsadferd er resultatet av den koordinerte funksjonen til blæren, urinrøret og urinrørsfinkterne under riktig kontroll av nervesystemet. For å studere frivillig tømmingsadferd i musemodeller har forskere utviklet VSA, en metode som måler antall og areal av urinflekker avsatt på et filterpapir som fôrer gulvet i et dyrs bur. Selv om den er teknisk enkel og billig, har denne analysen begrensninger når den brukes som en endepunktsanalyse, inkludert mangel på tidsmessig oppløsning av tømmingshendelser og vanskeligheter med å kvantifisere overlappende urinflekker. For å overvinne disse begrensningene utviklet vi en videoovervåket VSA, som vi kaller sanntids VSA (RT-VSA), og som lar oss bestemme tømmingsfrekvens, vurdere tømmervolum og tømmingsmønstre, og foreta målinger over 6 timers tidsvinduer i både mørke og lyse faser av dagen. Metoden beskrevet i denne rapporten kan brukes på et bredt spekter av musebaserte studier som undersøker de fysiologiske og nevroatferdsmessige aspektene ved frivillig vannlating i helse- og sykdomstilstander.

Introduction

Urinlagring og vannlating koordineres av en sentralkrets (sentralnervesystemet) som mottar informasjon om blærefyllingsstatus gjennom bekkenet og hypogastriske nerver. Urotelet, epitelet som strekker urinveiene fra nyrebekkenet til det proksimale urinrøret, danner en tett barriere mot metabolske avfallsprodukter og patogener som er tilstede i urinen. Det er en integrert del av et sensorisk nett, som sanser og kommuniserer blærens fyllingstilstand til underliggende vev og afferente nerver 1,2. Forstyrrelse av urotelbarrieren, eller endringer i uroteliale mekanotransduksjonsveier, kan føre til tømming av dysfunksjon sammen med nedre urinveissymptomer som frekvens, haster, nokturi og inkontinens 3,4,5,6,7. På samme måte er aldring, diabetes, nedre urinveisinfeksjoner, interstitiell cystitt og andre sykdomsprosesser som påvirker urinblæren, eller tilhørende kretsløp som styrer funksjonen, kjent for å forårsake blæredysfunksjon 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. En bedre forståelse av normal og unormal tømming atferd avhenger av utvikling av metoder som kan pålitelig diskriminere mellom ulike vannlating mønstre.

Tradisjonelt har musens frivillige tømmingsadferd blitt studert ved hjelp av void spot assay (VSA), utviklet av Desjardins og kolleger20, og bredt vedtatt på grunn av sin enkelhet, lave kostnader og ikke-invasiv tilnærming 8,21,22,23,24. Denne analysen utføres vanligvis som en endepunktsanalyse, der en mus tilbringer en definert tid i et bur foret med et filterpapir, som deretter analyseres ved å telle antallet og vurdere størrelsen på urinflekker når filterpapiret plasseres under ultrafiolett (UV) lys (urinflekkene fluorescerer under disse forholdene)20. Til tross for disse mange fordelene, presenterer den tradisjonelle VSA noen store begrensninger. Fordi mus ofte urinerer i de samme områdene, må etterforskerne begrense varigheten av analysen til en relativt kort periode (≤4 timer) 25. Selv når VSA utføres over kortere tidsperioder, er det nesten umulig å løse små tomromsflekker (SVS) som faller over store tomromsflekker eller, for å diskriminere SVS-er fra overføring av urin festet til haler eller poter. Det er også svært vanskelig å skille om SVS-er er en konsekvens av hyppige, men individuelle tømmingshendelser (en fenotype som ofte observeres som respons på cystitt 4,26), eller på grunn av dribling etter miksjon (en fenotype assosiert med blæreutløpsobstruksjon27). Videre begrenser ønsket om å fullføre analysen i arbeidstiden, kombinert med vanskeligheter med å få tilgang til boligfasiliteter når lysene er slått av, ofte disse analysene til lysperioden i 24 timers sirkadisk syklus. Dermed forhindrer disse tidsbegrensningene evaluering av musetømmingsadferd i løpet av deres aktive nattfase, og reduserer evnen til å analysere spesifikke gener eller behandlinger som styres av sirkadiske rytmer.

For å overvinne noen av disse begrensningene har forskere utviklet alternative metoder for å vurdere tømmingsadferd i sanntid 26,28,29,30,31,32. Noen av disse tilnærmingene innebærer bruk av dyrt utstyr som metabolske bur26,28,29, eller bruk av termiske kameraer30; Men også disse har begrensninger. For eksempel, i metabolske bur, har urinen en tendens til å holde seg til ledningene i nettgulvet og til traktens vegger, og reduserer mengden urin som samles og måles. Dermed kan det være vanskelig å samle inn data om små hulrom nøyaktig. Videre gir metabolske bur ikke informasjon om den romlige fordelingen av tømmingshendelsene (dvs. vannlating i hjørnene vs. midten av kammeret). Gitt at langbølget infrarød stråling som brukes av termografiske kameraer ikke trenger gjennom faste stoffer, må tømmingsaktivitet vurdert ved videotermografi utføres i et åpent system, noe som kan være utfordrende med aktive mus, da de kan hoppe flere centimeter i luften. Et annet system er den automatiserte tomme flekken på papir (aVSOP) tilnærming33, som består av valset filterpapir som vinder opp med konstant hastighet under nettinggulvet i et musebur. Denne tilnærmingen forhindrer papirskader og overlapping av urinflekker som forekommer i den klassiske VSA, og implementeringen gjør det mulig for etterforskeren å utføre eksperimenter over flere dager. Det gir imidlertid ikke etterforskeren nøyaktig timing av tømmingshendelsene, og det er ingen evne til å undersøke atferd og hvordan den korrelerer med spotting. For å få denne informasjonen har forskere innlemmet videoovervåking til tømmingsanalyser, en tilnærming som tillater samtidig vurdering av museaktivitet og urineringshendelser31,32. En tilnærming består av å plassere en blålysdiode (LED) og et videokamera med et grønt fluorescensproteinfilter satt under forsøksburet for å visualisere tømmingshendelsene, og en infrarød LED og et videokamera over buret for å fange museposisjon32. Dette oppsettet har blitt brukt til å overvåke tømmingsadferd mens du utfører fiberfotometri; Imidlertid krevde det sterkt opplyste miljøet i dette systemet at etterforskerne behandlet musene sine med et vanndrivende middel for å stimulere tømming. I et annet eksperimentelt design ble vidvinkelkameraer plassert over og under eksperimentburet for å visualisere henholdsvis musemotoraktivitet og urineringshendelser. I dette tilfellet ble urinflekker avsatt på et filterpapir som fôrer burets gulv avslørt ved å belyse filterpapiret med UV-lys plassert under buret31. Dette oppsettet ble brukt i korte analyser, 4 min i varighet, i lysfasen av dagen for å studere hjernestammenevronene som er involvert i frivillig tømmingsadferd31. Egnetheten til dette systemet for bruk i mørkefasen eller i perioder >4 minutter ble ikke rapportert.

I denne artikkelen beskrives en metode som forbedrer den tradisjonelle VSA ved å tillate langsiktig videoovervåking av musetømmingsadferd. Denne kostnadseffektive tilnærmingen gir tidsmessig, romlig og volumetrisk informasjon om tømmingshendelser i lengre perioder i løpet av dagens lyse og mørke faser, sammen med detaljer relatert til museadferd 3,4,34. Detaljert informasjon for bygging av tømmerommene, implementering av en sanntids VSA (RT-VSA) og analyse av dataene er gitt. RT-VSA er verdifull for forskere som ønsker å forstå de fysiologiske mekanismene som styrer funksjonen til urinsystemet, å utvikle farmakologiske tilnærminger for å kontrollere mikturering, og å definere det molekylære grunnlaget for sykdomsprosesser som påvirker nedre urinveiene.

Protocol

Urotelial piezo1/2 dobbel knockoutmus (Pz1/2-KO, genotype: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE+/-) og kontroller (Pz1/2-C, genotype: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE-/-) ble generert internt fra foreldrestammer hentet fra Jax-laboratoriene (Piezo1 fl/fl-stamme # 029213; Piezo2 fl/fl stamme # 027720; Upk2CRE+/- stamme # 029281). Både kvinnelige (1,5-3 måneder gamle o…

Representative Results

Tømming av oppførsel av urotelial Piezo1/2 knockoutmus Under lagringsfasen av miksjonssyklusen antas urotelet å føle spenningen som utøves av urinen som akkumuleres i blæren og å transducere denne mekaniske stimulansen til cellulære responser som serosal ATP-frigjøring 1,3. Vi har tidligere vist at mekanisk aktiverte PIEZO1- og PIEZO2-kanaler uttrykkes i museurotelet 3,36<…

Discussion

Inkorporering av videoovervåking er en kostnadseffektiv modifikasjon som gir flere fordeler i forhold til den klassiske VSA. I klassisk VSA, som vanligvis brukes som endepunktsanalyse, er det vanskelig å skille overlappende tomromsflekker. Dette er ikke en triviell bekymring, da mus har en tendens til å urinere flere ganger i samme område når analysen forlenges i flere timer, vanligvis i hjørnene av buret. Dermed er den første fordelen med RT-VSA at etterforskeren lett kan identifisere individuelle flekker som har…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av en NIH-stipend R01DK119183 (til GA og MDC), en pilotprosjektpris gjennom P30DK079307 (til MGD), en American Urology Association Career Development Award og et Winters Foundation-stipend (til NM), og av Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores fra Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).

Materials

1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots –  cut to 10 inches 80/20 1010 Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots –  cut to 12 inches 80/20 1010 Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots –  cut to 40 inches 80/20 1010 Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches 80/20 1010 Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 32 inches 80/20 1010 Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut 80/20 3280 Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut 80/20 3287 Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole – 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support 80/20 14061 Amount: 6
10 Series 3 Hole – Straight Flat Plate 80/20 4118 Amount: 8
10 Series 5 Hole – "L" Flat Plate 80/20 4081 Amount: 8
10 Series 5 Hole – "T" Flat Plate 80/20 4080 Amount: 8
10 Series 5 Hole – Tee Flat Plate 80/20 4140 Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge – Right Hand Assembly 80/20 2064 Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole – Lite Transition Inside Corner Bracket 80/20 4509 Amount: 6
24”-long UV tube lights ADJ Products LLC T8-F20BLB24 Amount: 2
20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 1
82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 2
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)  Thermo Fisher Scientific 57144
Cosmos blotting paper (thick paper) Blick Art Materials 10422-1005
Excel Microsoft Corporation
GraphPad Prism GraphPad Software Version 9.4.0 graphing and statistics software
ImageJ FIJI NIH
Parafilm Merck transparent film
Quick Time Player 10.5 software  Apple multimedia player
Security spy Ben software video surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-20 80/20 3381 Amount: 80
UV transmitting acrylic Spartech Polycast Solacryl SUVT Amount: 2
38.5 cm x 26.5 cm 
Water gel: HydroGel ClearH2O   70-01-5022 (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam Logitech C930e Amount: 4

References

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621 (2020).
  2. de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. Neural control of the lower urinary tract. Comprehensive Physiology. 5 (1), 327 (2015).
  3. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), (2021).
  4. Montalbetti, N., et al. Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1 (2022).
  5. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070 (2015).
  6. Montalbetti, N., et al. Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents. eNeuro. 4 (3), (2017).
  7. Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction. Scientific Reports. 9 (1), 5509 (2019).
  8. Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160 (2020).
  9. Bartolone, S. N., et al. Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).
  10. de Rijk, M. M., et al. Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium. International Neurourology Journal. 26 (2), 111 (2022).
  11. Coyne, K. S., et al. The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL. Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230 (2013).
  12. Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. Diabetic bladder dysfunction: a review. Urology. 123, (2019).
  13. Irwin, D. E., et al. Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study. European Urology. 50 (6), 1314 (2006).
  14. Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review. The Journal of Urology. 177 (2), 450 (2007).
  15. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1 (2014).
  16. Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner’s lesion. International Journal of Urology. 21, 79 (2014).
  17. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89 (2014).
  18. Rosen, J. M., Klumpp, D. J. Mechanisms of pain from urinary tract infection. International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26 (2014).
  19. Birder, L., et al. Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms. Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128 (2010).
  20. Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns. Science. 182 (4115), 939 (1973).
  21. Sugino, Y., et al. Voided stain on paper method for analysis of mouse urination. Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548 (2008).
  22. Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).
  23. Rajandram, R., et al. Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).
  24. Ruetten, H., et al. A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31 (2021).
  25. Wegner, K. A., et al. Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).
  26. Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume. The Journal of Urology. 165 (2), 653 (2001).
  27. Dmochowski, R. R. Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology. 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).
  28. Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of high fat diet feeding for 20 weeks on lower urinary tract function in mice. Lower Urinary Tract Symptoms. 5 (2), 101 (2013).
  29. Wang, Z., et al. Void sorcerer: an open source, open access framework for mouse uroflowmetry. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (3), 170 (2019).
  30. Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. Micturition video thermography in awake, behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449 (2020).
  31. Keller, J. A., et al. Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter. Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).
  32. Hou, X. H., et al. Central control circuit for context-dependent micturition. Cell. 167 (1), 73 (2016).
  33. Negoro, H., et al. Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm. Nature Communication. 3, (2012).
  34. Montalbetti, N., Carattino, M. D. Acid-sensing ion channels modulate bladder nociception. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (5), (2021).
  35. Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).
  36. Dalghi, M. G., et al. Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303 (2019).
  37. Birder, L., Andersson, K. E. Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome. International Neurourology Journal. 22, (2018).
  38. Okinami, T., et al. Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis. PLoS One. 9 (8), (2014).
  39. Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages. Biotechniques. 63 (5), (2017).
  40. Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock. The Journal of Urology. 190 (3), (2013).

Play Video

Cite This Article
Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Wheeler, T. B., Apodaca, G., Carattino, M. D. Real-Time Void Spot Assay. J. Vis. Exp. (192), e64621, doi:10.3791/64621 (2023).

View Video