Summary
For at inducere eksperimentel autoimmun encephalomyelitis, en dyremodel af multipel sklerose, immuniseres mus med en vand-i-olie-emulsion indeholdende et autoantigen og fuldender Freunds adjuvans. Mens der findes flere protokoller til fremstilling af disse emulsioner, præsenteres en hurtig, enkel og standardiseret homogeniseringsprotokol til emulsionsforberedelse her.
Abstract
Eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) deler lignende immunologiske og kliniske træk med multipel sklerose (MS) og bruges derfor i vid udstrækning som en model til at identificere nye lægemiddelmål for bedre patientbehandling. MS er kendetegnet ved flere forskellige sygdomsforløb: recidiverende-remitterende MS (RRMS), primær progressiv MS (PPMS), sekundær progressiv MS (SPMS) og en sjælden progressiv-recidiverende form for MS (PRMS). Selvom dyremodeller ikke nøjagtigt efterligner alle disse kontrasterende humane sygdomsfænotyper, er der EAE-modeller, der afspejler nogle af de forskellige kliniske manifestationer af MS. For eksempel efterligner myelin oligodendrocytglycoprotein (MOG) -induceret EAE i C57BL / 6J mus human PPMS, mens myelin proteolipidprotein (PLP) -induceret EAE i SJL / J mus ligner RRMS. Andre autoantigener, såsom myelin basisk protein (MBP), og en række forskellige musestammer bruges også til at studere EAE. For at fremkalde sygdom i disse autoantigenimmuniserings EAE-modeller fremstilles en vand-i-olie-emulsion og injiceres subkutant. De fleste EAE-modeller kræver også en injektion af kighostetoksin for at sygdommen kan udvikle sig. For konsekvent og reproducerbar EAE-induktion er en detaljeret protokol til fremstilling af reagenerne til fremstilling af antigen / adjuvansemulsioner nødvendig. Metoden beskrevet her udnytter en standardiseret metode til at generere vand-i-olie-emulsioner. Det er enkelt og hurtigt og bruger en rystehomogenisator i stedet for sprøjter til fremstilling af kvalitetskontrollerede emulsioner.
Introduction
En nedbrydning af immunologisk tolerance kan resultere i generering af autoimmune lidelser, såsom multipel sklerose (MS). Det anslås, at 2,8 millioner mennesker lever med MS på verdensplan1. Selvom den nøjagtige årsag til MS stadig er stort set ukendt, spiller dysregulering af autoreaktive T- og B-celler samt defekter i Treg-funktionen vigtige roller i patogenesen af sygdommen 2,3.
Dyremodeller af autoimmune sygdomme er vigtige værktøjer til at undersøge potentielle terapeutiske modaliteter. Den eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE) model er blevet brugt i næsten et århundrede af forskere interesseret i MS4. I tidlige forsøg var forekomsten af sygdommen relativt lav. Introduktionen af komplet Freunds adjuvans (CFA), der indeholder Mycobacterium og pertussistoksin, muliggjorde konsekvent induktion af EAE hos mus4. Vigtigst er det nødvendigt at blande CFA med et centralnervesystem (CNS) -specifikt antigen for at generere en homogen vand-i-olie-emulsion til inducering af EAE. De mest almindelige aktuelt tilgængelige EAE-modeller er baseret på aktiv immunisering af mus med encephalitogene peptider. Musenes genetiske baggrund spiller en vigtig rolle i sygdomsmodtagelighed, med myelin oligodendrocytglycoprotein (MOG35-55) og myelin proteolipidprotein (PLP139-151) peptider, der anvendes til at inducere EAE i henholdsvisC57BL / 6J og SJL mus. Imidlertid kan andre musestammer og CNS-afledte peptider også bruges.
Kvaliteten af CFA/peptidemulsionen er en kritisk faktor, der bestemmer sygdomspenetransen i den aktive immunisering EAE model6. En homogen vand-i-olie-emulsion skal fremstilles ved at blande de encephalitogene peptider opløst i vandig buffer med CFA, ellers vil dyr ikke udvikle sygdommen. Der er offentliggjort talrige protokoller om fremstilling af CFA/peptidemulsioner. Eksempler omfatter brugen af en hvirvel7, sonikering8, sprøjter og et trevejs T-stik9 eller en sprøjte kun5. Imidlertid er alle disse metoder vanskelige at standardisere og er ofte forbundet med lange og komplicerede protokoller.
Sammenlignet med alle ovennævnte metoder giver den enkle metode, der er beskrevet her til emulsionspræparat, fordelene ved ikke at have nogen person-til-person-forskelle og være relativt hurtig. Emulsionen genereres af en homogenisator, der ryster reagenserne med en indstillet hastighed, tid og temperatur, hvilket sikrer hurtige og ensartede resultater. Ud over at fremkalde sygdom i EAE-modellen kan denne metode også bruges til at studere andre autoimmune sygdomsmodeller såsom kollageninduceret arthritis (CIA) og antigeninduceret arthritis (AIA)6. Derfor forventes det, at denne metode kan bruges til konsekvent at fremkalde sygdom i andre dyremodeller, der er afhængige af vand-i-olie-emulsioner med autoantigener, såsom eksperimentel autoimmun neuritis (EAN)10, eksperimentel autoimmun thyroiditis (EAT)11, autoimmun uveitis (EAU)12 og myasthenia gravis (MG)13. Denne metode inducerer også generelle immunresponser såsom forsinket overfølsomhed (DTH) konsekvent6 og kan derfor bruges til at levere kræft- og malariavacciner (se diskussion).
Således er der udviklet en hurtig (total forberedelsestid ~ 30 min), enkel (alle reagenser kan fremstilles på forhånd og opbevares) og standardiseret (emulsionen opnås ved hjælp af en rystehomogenisator) metode og præsenteres her. CFA/antigenemulsioner, der er fremstillet ved hjælp af denne protokol, inducerer konsekvent sygdom i autoimmune dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i henhold til praksis fra det svenske dyreforsøgsråd og blev godkendt af den dyreetiske komité, Lund-Malmø, Sverige (tilladelsesnummer: M126-16).
BEMÆRK: Et skematisk flow af metoden er beskrevet i figur 1.
1. Forberedelse af materiale
BEMÆRK: Forbered alle reagenser aseptisk i en steril hætte, og aliquot og opbevar ved den angivne temperatur. Reagenserne kan opbevares i op til 2 år uden at miste deres virkning.
- Der fremstilles CFA indeholdende 20 mg/ml Mycobacterium tuberculosis som beskrevet nedenfor.
- Tilsæt 100 mg frysetørret M. tuberkulose H37RA (se Materialetabel) og fem 3,2 mm stålperler til et 7 ml rør (se Materialetabel). Ryst røret i en homogenisator (se Materialetabel) i 60 sekunder ved den højeste hastighedsindstilling (5.000 o / min).
- Tilsæt 5 ml ufuldstændig Freunds adjuvans (IFA) til røret og ryst igen i 60 s ved højeste hastighed. Opslæmningen af homogeniseret M. tuberkulose i IFA (nu kaldet CFA) overføres til et frisk rør med en pipette, idet perlerne efterlades, og opbevares ved 4 °C indtil brug.
- Der tilsættes ultrarent vand til det frysetørrede pulver af MOG35-55 peptid (se materialetabel) for at opnå en endelig peptidkoncentration på 10 mg/ml. Steriliser opløsningen ved at føre den gennem et 0,2 μm filter. Der fremstilles 60 μL aliquoter, og de opbevares ved -20 °C indtil brug.
BEMÆRK: MOG35-55 peptid, der anvendes til dette forsøg, er af ImmunoGrade renhed (~ 70%), er TFA-spaltet, opløses let i vand og indeholder et C-terminalamid (-NH2) for at øge in vivo-stabilitet 14. Peptidaliquoter blev aldrig optøet og genfrosset mere end to gange og blev opbevaret ved -20 °C indtil brug. - Forbered 100 ml kighostetoksinbuffer: Opløs 2,9 g NaCl i 80 ml 1x Ca 2+/Mg 2+ fri PBS og tilsæt 100 μL 10% Triton X-100. Lydstyrken justeres til 100 ml med PBS, og opløsningen steriliseres ved at føre den gennem et 0,2 μm filter. Der fremstilles 10 ml alikvoter, og de opbevares ved 4 °C indtil brug.
2. Fremstilling af CFA/peptidemulsioner
- Beregn mængden af emulsion, der er nødvendig til immunisering. I denne standardprotokol modtager hver mus 50 μg MOG35-55 peptid og 300 μg M. tuberkulose spredt i Freunds adjuvans (CFA). Mængden af hvert reagens (MOG35-55 peptid, PBS, CFA og IFA), der kræves til fremstilling af emulsionerne, kan beregnes ved hjælp af supplerende fil 1. Yderligere 20% af alle reagenser for at kompensere for det lille tab af emulsion er inkluderet i beregningen.
BEMÆRK: Det kommercielle emulsionssæt (se Materialetabel), der anvendes i denne undersøgelse, består af et rør, skruelåg og et stempel i en steriliseret pose. Hvert rør i emulsionssættet rummer maksimalt 9,6 ml, hvilket gør det muligt at fremstille 8 x 1 ml sprøjter, der er tilstrækkelige til immunisering af 40 mus (eller 80 mus, hvis der anvendes 100 μL emulsion pr. dyr). - Placer skruelågsrøret (fra det kommercielle emulsionssæt) og reagenser, der skal bruges på is.
- Emulsionskomponenterne tilsættes i følgende rækkefølge i mængderne beregnet i trin 2.1: PBS, derefter peptidet , derefter M. tuberkulose i CFA og til sidst IFA.
- Luk røret med hætten fast ved at stramme og løsne det flere gange. Ryst røret kraftigt i 5-10 s i hånden for at blande reagenserne.
- Placer røret i rystehomogenisatoren og fastgør det med stangen. Indstil hastigheden til den højeste indstilling og tiden til 60 s. Når løbet er færdigt, skal du placere røret på is i 3 min. Gentag kørslen en eller to gange mere med de samme indstillinger.
- Centrifuge røret ved 300 x g i 1 minut for at fjerne fanget luft og komprimere emulsionen.
- Fjern hætten fra røret, indsæt stemplet i røret, og skub det langsomt ned, indtil det når toppen af emulsionen. Fjern snaplukningen i bunden af røret ved at dreje den.
- Fjern stemplet fra en injektionssprøjte (1 ml; se Materialetabel). Tilsæt en nål (helst 25-27 G) til injektionssprøjten.
- Fastgør bagenden af injektionssprøjten til den dedikerede lås i bunden af røret, og lås den med et kort vrid.
- Overfør emulsionen fra røret til injektionssprøjten ved at skubbe stemplet forsigtigt. Stop, når emulsionen når 0,15 ml graduering af injektionssprøjten.
- Adskil injektionssprøjten fra røret, og indsæt stemplet forsigtigt, idet du sørger for, at der ikke kommer luft ind i sprøjten. Skub stemplet, indtil emulsionen kommer ud af nålen.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan noget af emulsionen bruges til kvalitetskontrol (se trin 3). - Gentag trin 2.8-2.11 for resten af emulsionen i røret.
BEMÆRK: For at minimere spild af dyre CFA/antigenemulsioner bør der anvendes 1 ml sprøjter. Andre sprøjter, der passer til den dedikerede lås i bunden af røret, kan anvendes; det kan dog være nødvendigt at fremstille et større volumen emulsion. CFA/MOG35-55 peptidemulsionen kan opbevares ved 4 °C i op til 15 uger uden at miste sin EAE-inducerende kapacitet.
3. Kvalitetskontrol af emulsion
- Drop-test: Tilsæt en lille dråbe af emulsionen i et sterilt 50 ml konisk rør fyldt med 20 ml koldt vand. Luk røret og ryst det i hånden i et par sekunder. Udseendet af små forskellige dråber bekræfter dannelsen af en vand-i-olie-emulsion.
- Emulsionen undersøges ved hjælp af fasekontrastmikroskopi.
- For at analysere størrelsen af vand-i-olie-partiklerne tilsættes en lille dråbe (2-3 μL) af emulsionen til et mikroskopglas, smøres ud med en dækslipning og skubber derefter hårdt i en cirkulær bevægelse for at flade emulsionen ud.
- Undersøg den udtværede emulsion under et fasekontrastmikroskop (se Materialetabel) med 400x forstørrelse og fokuser på et felt med et monolag af emulsionen. Sørg for, at små ensartede grå/hvide partikler er synlige (figur 2A).
- Analyser emulsionspartikelstørrelsen ved hjælp af laserdiffraktion.
BEMÆRK: Laserdiffraktion måler partikelstørrelsesfordelinger ved hjælp af en laserstråle. Dette er den ultimative kvalitetskontroltest for emulsioner. Et repræsentativt resultat af partikelstørrelsesfordelinger ved hjælp af den metode, der er beskrevet her, er vist i figur 2B (for en detaljeret beskrivelse, se Topping et al.6). Ikke desto mindre er faldprøven og mikroskopundersøgelsen tilstrækkelig til at validere, om der er dannet en tilfredsstillende emulsion.- Brydningsindekserne for både røde og blå lasere for dispergeringsmidlet (se Materialetabel) indstilles til 1.456 og for prøven til 1,33 på partikelstørrelsesanalysatoren (se Materialetabel). Indstil absorbansen af brydningsindekset til 0, 02.
- Tilsæt en dråbe fra sprøjten indeholdende peptidemulsionen til dispersionsenheden, der indeholder let mineralolie. Start dataindsamlingen øjeblikkeligt efter spredning af emulsionen.
BEMÆRK: En generel model blev anvendt, og sfæriske partikler blev antaget, til estimering af partikelstørrelsesfordeling.
4. EAE-induktion ved hjælp af MOG 35-55 peptidemulsion i C57BL6 / J-mus
BEMÆRK: I alle forsøg blev der brugt fem 8-12 uger gamle C57BL6/J-hunmus.
- Før immunisering bedøves musene ved hjælp af 2,5% fordampet isofluran og bekræftes ved hjælp af en fast tåklemme.
- Hver mus injiceres subkutant ved hjælp af 1 ml sprøjter på to forskellige steder på højre og venstre side af bagflanken med 200 μL emulsion indeholdende 50 μg MOG35-55 peptid i et 1: 1 (v / v) forhold mellem peptid / CFA.
- Mindst 1,5 timer efter immuniseringen med emulsionen og derefter igen efter 24 timer administreres i alt 80 ng Bordetella pertussistoksin i 200 μL pertussistoksinbuffer til hver mus gennem intraperitoneale injektioner (100 μL til venstre og 100 μL på højre side af maven).
BEMÆRK: Præcis lokalisering af intraperitoneal injektion med kighostetoksin har vist sig at være afgørende for aktiveringen af T-celler i den drænende lymfeknude15. - Valgfrit: Injicer MOG35-55 peptid igen på dag 7 (som anvendt i nogle protokoller16) ved at gentage trin 4.2.
BEMÆRK: Vigtigst af alt skal du sørge for, at sprøjter og nåle, der anvendes til immunisering, der indeholder MOG / CFA eller pertussistoksin, bortskaffes tilstrækkeligt i biohazardposer / beholdere. - Evaluer den kliniske score dagligt ved hjælp af en skala fra 0-6 som tidligere beskrevet6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den hurtige, enkle og standardiserede protokol til fremstilling af CFA/MOG-emulsioner er afbildet i figur 1. Denne metode er for nylig blevet beskrevet andetsteds6. CFA/MOG-emulsionerne kan også fremstilles med andre metoder, såsom den traditionelle sprøjtemetode eller ved hvirveldannelse. Disse metoder blev sammenlignet her ved at vurdere kvaliteten af emulsionerne. Alle metoder producerede vand-i-olie-emulsioner; homogeniteten og kvaliteten af disse emulsioner blev vurderet ved at tilføje en lille dråbe på et glasglas efterfulgt af observation under et fasekontrastmikroskop. Emulsioner produceret ved rystehomogeniseringsmetoden viste grå / hvide bønneformede partikler, der repræsenterer små dråber vand-i-olie-emulsioner. I modsætning hertil var emulsionsdråberne produceret ved hjælp af sprøjtemetoden større og hvidere. I hvirvelmetoden blev der observeret store grå/sorte partikler svarende til luftbobler fanget i emulsionen (figur 2A).
For at teste den langsigtede stabilitet af vand-i-olie-emulsioner kan ændringerne i partikelstørrelsesfordelingen over tid måles ved hjælp af en laserdiffraktionspartikelstørrelsesanalysator. Emulsioner fremstillet med den standardiserede protokol, der er beskrevet her, viste ingen ændring i partikelstørrelse over en periode på 6 uger (figur 2B). Derfor blev muligheden for, at emulsioner indeholdende MOG35-55 peptid kan opbevares ved 4 ° C i længere tid og stadig fremkalde sygdom, testet. Emulsioner indeholdende CFA/MOG35-55 peptid blev fremstillet med denne metode og anvendt straks eller opbevaret ved 4 °C i 3 eller 15 uger (figur 3A). Mus blev injiceret med 50 μg MOG35-55 peptid og scoret for kliniske tegn på sygdom som beskrevet i protokollen. Bemærkelsesværdigt inducerede de friske, 3 uger gamle og 15 uger gamle emulsioner alle lignende EAE-sygdom hos alle dyr, der blev testet under hele eksperimentet (figur 3A). Disse resultater afslørede således, at emulsioner indeholdende MOG35-55 peptider fremstillet ved hjælp af rystehomogeniseringsmetoden kan opbevares i mindst 15 uger og stadig inducere EAE med sygdomsscorer, der kan sammenlignes med dem, der opnås med frisklavede emulsioner.
For at forenkle og fremskynde opsætningen af forsøgene og for at undgå meget forskel på reagenser blev alle nødvendige komponenter forberedt, aliciteret og opbevaret ved den passende temperatur på forhånd. Derefter blev der udført fem eksperimenter over en periode på 6 måneder. C57BL6/J-mus blev immuniseret med MOG/CFA-emulsioner fremstillet på dagen for immunisering ved hjælp af emulsionssæt og evalueret for kliniske symptomer. Mus udviklede et lignende sygdomsmønster i alle eksperimenter (figur 3B), hvilket afslørede, at homogeniseringsmetoden, der præsenteres her, producerede emulsioner, der inducerede EAE på en konsistent og reproducerbar måde.
Den samlede forberedelsestid, fra hentning af alle reagenser, tilsætning af dem og omrystning af røret tre gange og påfyldning af sprøjterne med emulsionen, klar til immunisering, tager ikke mere end 30 minutter. Derudover skal kun 20% af ekstra emulsion tilberedes. Dette står i skarp kontrast til andre protokoller, hvor forberedelsestiden kan være op til 1,5-2 timer, og 50%-100% ekstra emulsion skal muligvis forberedes for at sikre tilstrækkeligt materiale til immunisering16.
Figur 1: Skematisk over processen med emulsionsforberedelse ved hjælp af et kommercielt emulsionssæt. Denne figur er blevet genbrugt fra Topping et al6 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Karakterisering af emulsioner fremstillet ved anvendelse af forskellige metoder. (A) Repræsentative billeder fra tre forskellige fremstillingsmetoder: standard homogeniseringsmetode, traditionel sprøjtemetode og hvirvelmetode. En lille mængde emulsion blev anbragt på et glasglas og observeret under et fasekontrastmikroskop (400x). Skala bar = 50 μm. Et repræsentativt præparat er vist af hver metode fra >15 eksperimenter. Det gennemsnitlige D [4, 3] (det volumenvægtede gennemsnit) blev målt med en partikelstørrelsesanalysator til at være 0,7 μm for rystehomogeniseringsmetoden, 1,4 μm for sprøjtemetoden og 5,4 μm for hvirvelmetoden. (B) Emulsionens stabilitet over tid blev målt ved hjælp af partikelstørrelsesanalysatoren. En emulsion af CFA/PBS blev fremstillet med rystehomogenisatoren og emulsionssættet, og partikelstørrelsen blev bestemt ved hjælp af laserdiffraktion over tid. En prøve blev straks analyseret, og derefter blev emulsionerne opbevaret ved 4 °C. Disse prøver blev analyseret 1, 2, 4 og 6 uger efter forberedelsen. Det gennemsnitlige D[4, 3] volumenvægtede gennemsnit for alle prøver var 0,73 μm ± 0,03 μm (SD). Denne figur er blevet genbrugt fra Topping et al6 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: EAE-induktion hos mus immuniseret med et MOG35-55 peptid / CFA-præparat ved hjælp af et kommercielt emulsionssæt. (A) EAE-induktion af den lagrede emulsion. Emulsioner indeholdende CFA og 50 μg MOG35-55 peptid/mus blev fremstillet med homogeniseringsmetoden og opbevaret ved 4 °C i 3 eller 15 uger. De frisklavede og de opbevarede emulsioner blev samme dag injiceret i C57BL/6J-mus (n = 5 pr. gruppe). Musene modtog 80 ng kighostetoksin samme dag og 24 timer senere og blev scoret for tegn på sygdom ved hjælp af kliniske score fra 0-6. (B) Konsekvent induktion af EAE med de emulsioner, der er fremstillet under anvendelse af homogeniseringsmetoden. Emulsioner indeholdende CFA og 50 μg MOG35-55 peptid/mus blev fremstillet på forskellige tidspunkter og injiceret i C57BL/6J mus (n = 5 pr. gruppe). Musene fik 80 ng kighostetoksin samme dag og 24 timer senere og blev scoret for tegn på sygdom. Denne figur er blevet genbrugt fra Topping et al6 med tilladelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Beregning af mængden af hvert reagens (MOG35-55 peptid, PBS, CFA og IFA) til emulsionspræparat. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vand-i-olie-emulsioner, såsom antigen / Freunds adjuvans, er blevet brugt i mere end et halvt århundrede til at inducere EAE17. Der er i øjeblikket ingen standardiseret metode til fremstilling af antigenemulsioner, der er uafhængige af menneskelig indflydelse. Manuel blanding ved hjælp af sprøjter er standard for de fleste laboratorier, men denne metode er tidskrævende, resulterer ofte i et for stort tab af materiale, og kvaliteten varierer afhængigt af forskeren, der forbereder den.
Metoden, der præsenteres i dette manuskript, bruger en standard rystehomogeniseringsmaskine til at forberede antigen / CFA-emulsionerne. Derudover kan alle reagenser, der anvendes her, aliquoted og opbevares i lang tid, hvilket gør det praktisk og hurtigt at forberede emulsioner. Den samlede tid til fremstilling af emulsioner til op til 80 mus er ca. 30 min. Dette står i skarp kontrast til andre offentliggjorte metoder, som kræver 1-1,5 time til fremstilling af MOG35-55 emulsioner16,18. Andre manuelle metoder, såsom en sprøjtemetode, er ofte forbundet med indførelsen af luftbobler i sprøjterne5. Metoden, der præsenteres her, er designet således, at emulsionen skubbes ind i sprøjter fra deres bagende, hvilket eliminerer indførelsen af luftbobler og minimerer tabet af materiale.
For at sikre ensartede resultater og minimalt spild af emulsion er der nogle kritiske trin i rystehomogeniseringsmetoden, der kræver særlig opmærksomhed. Røret og reagenserne skal anbringes på is, inden forsøget påbegyndes, og efter homogeniseringstrinnet. PBS og antigen skal tilsættes til røret først efterfulgt af adjuvansen (CFA/IFA) for at undgå høje lokale koncentrationer af antigen ved blanding med olieadjuvansen. Låget skal strammes fast ved at åbne og lukke det et par gange for at undgå lækager. Derudover bør sprøjten ikke fyldes helt med emulsionen, kun indtil 0,15 ml mærket på sprøjtetønden for at undgå spild af emulsionen. Stemplet skal indsættes i sprøjten meget omhyggeligt ved hjælp af begge hænder. Når alle sprøjterne er fyldt med emulsionen, kan sprøjterne opbevares ved stuetemperatur, hvis de skal bruges samme dag; Ellers skal de opbevares ved 4 °C indtil brug.
Antigen/CFA-emulsioner fremstillet ved rystehomogeniseringsmetoden kan forekomme mindre faste sammenlignet med dem, der fremstilles med sprøjtemetoden. Der kan tilføjes et ekstra rystetrin (se trin 2.5 i protokollen), som kan fortykke emulsionen. Imidlertid inducerer emulsioner, der består "droptesten" og fasekontrastmikroskopundersøgelsen, EAE uanset emulsionens fysiske tilstand.
Den oprindelige investering, der kræves i en rystende homogeniseringsmaskine, er en begrænsning. De forberedelsestrin, der er beskrevet her, sikrer imidlertid minimalt spild af emulsion og antigenet, som ofte er dyrt at købe eller tager lang tid at forberede. Derfor er denne metode i det lange løb billigere at bruge, da den sparer tid og reagenser. Antigenet og bufferen, der anvendes i rystehomogeniseringsmetoden, kan påvirke emulsionens kvalitet. MOG35-55 peptid opløst i PBS uden Ca 2+/Mg 2+ genererede konsekvent emulsioner med små ensartede vand-i-olie-partikler (figur 2A). Imidlertid kan peptidantigener opløst i PBS med Ca2 + / Mg2+ eller peptider indeholdende mange ladede aminosyrerester generere emulsioner, der er mindre viskøse. Hvorvidt sådanne emulsioner er mindre tilbøjelige til at fremkalde sygdom i dyremodeller, er ikke blevet testet. En anden begrænsning ved denne metode er, at der ikke kan fremstilles mere end 8 ml antigen/CFA-emulsion fra et rør. Rørene må ikke fyldes med mere end 9,6 ml i alt (4,8 ml PBS/antigen og 4,8 ml CFA/IFA), hvilket vil være tilstrækkeligt til at fylde otte 1 ml sprøjter. Selvom røret kan holde et større volumen, skal der være noget luft til stede i røret, ellers genereres der ikke perfekte emulsioner. Hvis der er behov for mere emulsion, kan den fremstilles ved hjælp af yderligere rør.
Sammenlignet med eksisterende metoder er der ingen person-til-person-forskel, når emulsionerne fremstilles med rystehomogeniseringsmetoden. Den mest almindeligt anvendte metode til fremstilling af emulsioner til EAE-eksperimenter anvender sprøjter, der skubbes frem og tilbage i hånden19. Kraften, tiden og temperaturen kan ikke kontrolleres godt, og det er derfor svært at standardisere en sprøjtebaseret metode. Andre metoder til fremstilling af vand-i-olie-emulsioner drager fordel af ultralyd vandbad sonikatorer. Emulsioner fremstillet med en sonikeringsmetode er i stand til at inducere EAE i ellers resistente BALB / c-mus8. Den beskrevne metode kunne være standardiseret og derfor nyttig. Problemet med ultralyd vandbad og ultralydsonde sonikatorer er imidlertid, at det er vanskeligt at overføre emulsionen i rørene til sprøjter, der anvendes til immunisering uden at indføre luftbobler. Rørene, der bruges til den metode, der præsenteres her, eliminerer dette problem.
En hvirvelmetode kan betragtes som en standardiseret metode med en indstillet hastighed, tid og temperatur. Test af denne metode til fremstilling af en emulsion ved hvirveldannelse af MOG/CFA-præparatet i 10 minutter resulterede imidlertid i ingen sygdomsinduktion hos C57BL/6J-mus (data ikke vist). Ikke desto mindre kan EAE induceres med en antigen/CFA-blanding fremstillet ved hvirveldannelse i 45 minutter18, hvilket ville være en meget længere procedure sammenlignet med den metode, der præsenteres i dette manuskript.
En anden oliebaseret adjuvans (se Tabel over materialer), godkendt af FDA til brug på mennesker, der producerer en vand-i-olie-emulsion, har vist sig at være en lovende adjuvans for kræft- og malariavacciner20,21,22. Derfor kan den standardiserede protokol, der præsenteres her, tilpasses til brug i klinikken. Foreløbige eksperimenter har afsløret, at rystehomogeniseringsmetoden genererer emulsioner med denne FDA-godkendte olie, der er af bedre kvalitet sammenlignet med den manuelle sprøjtemetode (data ikke vist).
Afslutningsvis giver den rystende homogeniseringsmetode, der præsenteres her, en række fordele, såsom hurtigere generering af kvalitetskontrollerede emulsioner, høj reproducerbarhed i en række autoimmune sygdomsmodeller og en reduktion af dyre reagenser, der er nødvendige for at fremstille antigen / CFA-emulsioner. Da der ikke er nogen person-til-person-forskel, der genererer disse vand-i-olie-emulsioner, giver det mulighed for at standardisere denne metode, der er nødvendig for reproducerbar biomedicinsk forskning og lægemiddelopdagelse inden for autoimmune sygdomme og terapeutisk vaccineudvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BTB Emulsions AB har indsendt en patentansøgning om brug af en enhed og metode til fremstilling af emulsioner til immunisering og dyr og mennesker (europæisk patentansøgningsnummer: EP3836884A1). BTB er administrerende direktør og grundlægger af virksomheden og aktionær i BTB Emulsions. Bertin-Instruments distribuerer de emulsionssæt, der anvendes i denne publikation, over hele verden.
Acknowledgments
Forfatteren vil gerne anerkende dyrestaldene ved Lunds Universitet, Camilla Björklöv og Agnieszka Czopek for deres støtte og Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, UK, for konstruktiv kritik og sproglig støtte til udarbejdelsen af dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
- Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
- Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
- Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
- Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
- Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
- Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
- Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
- Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15 Unit 15.6 (2003).
- Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
- Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
- Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
- Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
- Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
- Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
- Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).
