Summary
Om experimentele auto-immune encefalomyelitis, een diermodel van multiple sclerose, te induceren, worden muizen geïmmuniseerd met een water-in-olie-emulsie die een autoantigeen bevat en het adjuvans van Freund compleet maakt. Hoewel er verschillende protocollen bestaan voor de bereiding van deze emulsies, wordt hier een snel, eenvoudig en gestandaardiseerd homogenisatieprotocol voor emulsievoorbereiding gepresenteerd.
Abstract
Experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) deelt vergelijkbare immunologische en klinische kenmerken met multiple sclerose (MS) en wordt daarom veel gebruikt als model om nieuwe medicijndoelen te identificeren voor een betere behandeling van patiënten. MS wordt gekenmerkt door verschillende ziekteverloop: relapsing-remitting MS (RRMS), primaire progressieve MS (PPMS), secundair progressieve MS (SPMS) en een zeldzame progressief-recidiverende vorm van MS (PRMS). Hoewel diermodellen niet al deze contrasterende fenotypen van menselijke ziekten nauwkeurig nabootsen, zijn er EAE-modellen die enkele van de verschillende klinische manifestaties van MS weerspiegelen. Bijvoorbeeld, myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) -geïnduceerde EAE in C57BL / 6J-muizen bootst menselijke PPMS na, terwijl myeline proteolipide-eiwit (PLP) -geïnduceerde EAE in SJL / J-muizen lijkt op RRMS. Andere autoantigenen, zoals myeline basiseiwit (MBP), en een aantal verschillende muizenstammen worden ook gebruikt om EAE te bestuderen. Om ziekte te induceren in deze auto-antigeen-immunisatie EAE-modellen, wordt een water-in-olie-emulsie voorbereid en subcutaan geïnjecteerd. De meeste EAE-modellen vereisen ook een injectie van kinkhoesttoxine om de ziekte te ontwikkelen. Voor consistente en reproduceerbare EAE-inductie is een gedetailleerd protocol nodig om de reagentia voor te bereiden op de productie van antigeen/adjuvante emulsies. De hier beschreven methode maakt gebruik van een gestandaardiseerde methode om water-in-olie-emulsies te genereren. Het is eenvoudig en snel en gebruikt een schuddende homogenisator in plaats van spuiten om kwaliteitsgecontroleerde emulsies te bereiden.
Introduction
Een afbraak van immunologische tolerantie kan leiden tot het ontstaan van auto-immuunziekten, zoals multiple sclerose (MS). Naar schatting leven wereldwijd 2,8 miljoen mensen met MS1. Hoewel de exacte oorzaak van MS nog grotendeels onbekend is, spelen ontregeling van autoreactieve T- en B-cellen, evenals defecten in de Treg-functie, een belangrijke rol in de pathogenese van de ziekte 2,3.
Diermodellen van auto-immuunziekten zijn essentiële hulpmiddelen om potentiële therapeutische modaliteiten te onderzoeken. Het experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) model wordt al bijna een eeuw gebruikt door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in MS4. In vroege experimenten was de incidentie van de ziekte relatief laag. De introductie van complete Freund's adjuvans (CFA), dat Mycobacterium en kinkhoesttoxine bevat, maakte de consistente inductie van EAE bij muizen4 mogelijk. Het belangrijkste is dat het noodzakelijk is om CFA te mengen met een centraal zenuwstelsel (CZS) -specifiek antigeen om een homogene water-in-olie-emulsie te genereren voor het induceren van EAE. De meest voorkomende momenteel beschikbare EAE-modellen zijn gebaseerd op de actieve immunisatie van muizen met encefanietgene peptiden. De genetische achtergrond van de muizen speelt een belangrijke rol bij ziektegevoeligheid, met myeline oligodendrocytenglycoproteïne (MOG35-55) en myeline proteolipide-eiwit (PLP139-151) peptiden die worden gebruikt om EAE te induceren in respectievelijk C57BL / 6J- en SJL-muizen, respectievelijk5. Andere muizenstammen en van het CZS afgeleide peptiden kunnen echter ook worden gebruikt.
De kwaliteit van de CFA/peptide-emulsie is een kritische factor die de penetrantie van de ziekte bepaalt in het actieve immunisatie EAE-model6. Een homogene water-in-olie-emulsie moet worden bereid door de encefanietgene peptiden opgelost in waterige buffer te mengen met CFA, anders zullen dieren de ziekte niet ontwikkelen. Er zijn tal van protocollen gepubliceerd over de bereiding van CFA/peptide-emulsies. Voorbeelden zijn het gebruik van een vortex7, ultrasoonapparaat8, spuiten en een drieweg T-connector9, of slechts één spuit5. Al deze methoden zijn echter moeilijk te standaardiseren en worden vaak geassocieerd met langdurige en gecompliceerde protocollen.
In vergelijking met alle bovenstaande methoden biedt de eenvoudige methode die hier wordt beschreven voor emulsiebereiding de voordelen van het hebben van geen verschillen van persoon tot persoon en relatief snel zijn. De emulsie wordt gegenereerd door een homogenisator die de reagentia schudt met een ingestelde snelheid, tijd en temperatuur, wat zorgt voor snelle en consistente resultaten. Naast het induceren van ziekte in het EAE-model, kan deze methode ook worden gebruikt om andere auto-immuunziektemodellen te bestuderen, zoals collageen-geïnduceerde artritis (CIA) en antigeen geïnduceerde artritis (AIA)6. Daarom wordt verwacht dat deze methode kan worden gebruikt om consequent ziekte te induceren in andere diermodellen die afhankelijk zijn van water-in-olie-emulsies met autoantigenen, zoals experimentele auto-immuunneuritis (EAN) 10, experimentele auto-immune thyroiditis (EAT) 11, auto-immuun uveïtis (EAU) 12 en myasthenia gravis (MG) 13. Deze methode induceert ook algemene immuunresponsen zoals vertraagde overgevoeligheid (DTH) consistent6, en kan daarom worden gebruikt voor het leveren van kanker- en malariavaccins (zie discussie).
Zo is een snelle (totale bereidingstijd ~ 30 min), eenvoudige (alle reagentia kunnen van tevoren worden bereid en opgeslagen) en gestandaardiseerde (de emulsie wordt bereikt met behulp van een schudhomogenisator) methode ontwikkeld en hier gepresenteerd. De CFA/antigeen emulsies bereid met behulp van dit protocol induceren consequent ziekte in auto-immuun diermodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de praktijken van de Zweedse Raad voor Dieronderzoek en werden goedgekeurd door de Commissie Voor Dierenethiek, Lund-Malmö, Zweden (Vergunningsnummer: M126-16).
OPMERKING: Een schematische stroom van de methode wordt beschreven in figuur 1.
1. Materiaalvoorbereiding
OPMERKING: Bereid alle reagentia aseptisch in een steriele kap en bewaar ze bij de aangegeven temperatuur. De reagentia kunnen tot 2 jaar worden bewaard zonder hun effect te verliezen.
- Bereid CFA met 20 mg/ml Mycobacterium tuberculosis zoals hieronder beschreven.
- Voeg 100 mg gevriesdroogde M. tuberculosis H37RA (zie materiaaltabel) en vijf stalen kralen van 3,2 mm toe aan een buis van 7 ml (zie materiaaltabel). Schud de buis in een homogenisator (zie Materiaaltabel) gedurende 60 s bij de hoogste snelheidsinstelling (5.000 tpm).
- Voeg 5 ml onvolledig Freund's adjuvans (IFA) toe aan de buis en schud opnieuw gedurende 60 s op de hoogste snelheid. Breng de drijfmest van gehomogeniseerde M. tuberculosis in IFA (nu CFA genoemd) over in een verse buis met een pipet, laat de kralen achter en bewaar bij 4 °C tot gebruik.
- Voeg ultrapuur water toe aan het gevriesdroogde poeder van MOG35-55 peptide (zie materiaaltabel) om een uiteindelijke peptideconcentratie van 10 mg / ml te verkrijgen. Steriliseer de oplossing door deze door een filter van 0,2 μm te laten lopen. Bereid 60 μL aliquots en bewaar bij -20 °C tot gebruik.
OPMERKING: Het MOG35-55-peptide dat voor dit experiment wordt gebruikt, is van ImmunoGrade-zuiverheid (~ 70%), is TFA-gesplitst, lost gemakkelijk op in water en bevat een C-terminal amide (-NH2) om de in vivo stabiliteit te verhogen14. Peptide-aliquots werden nooit meer dan twee keer ontdooid en opnieuw ingevroren en werden bewaard bij -20 °C tot gebruik. - Bereid 100 ml kinkhoesttoxinebuffer: Los 2,9 g NaCl op in 80 ml 1x Ca2+/Mg2+ vrije PBS en voeg 100 μL 10% Triton X-100 toe. Stel het volume in op 100 ml met PBS en steriliseer de oplossing door deze door een filter van 0,2 μm te laten lopen. Bereid 10 ml aliquots en bewaar bij 4 °C tot gebruik.
2. Bereiding van CFA/peptide-emulsies
- Bereken de hoeveelheid emulsie die nodig is voor immunisatie. In dit standaardprotocol ontvangt elke muis 50 μg MOG35-55 peptide en 300 μg M. tuberculosis gedispergeerd in Freund's adjuvans (CFA). De hoeveelheid van elk reagens (MOG35-55 peptide, PBS, CFA en IFA) die nodig is voor het bereiden van de emulsies kan worden berekend met behulp van Supplemental File 1. Een extra 20% van alle reagentia, om het kleine verlies van emulsie te compenseren, wordt in de berekening opgenomen.
OPMERKING: De commerciële emulsiekit (zie materiaaltabel) die in deze studie wordt gebruikt, bestaat uit een buis, schroefdop en een zuiger in een gesteriliseerd zakje. Elke buis van de emulsiekit bevat maximaal 9,6 ml, waardoor het mogelijk is om 8 x 1 ml spuiten te bereiden die voldoende zijn voor het immuniseren van 40 muizen (of 80 muizen als 100 μL emulsie per dier wordt gebruikt). - Plaats de buis met schroefdeksel (uit de commerciële emulsiekit) en reagentia voor gebruik op ijs.
- Voeg de emulsiecomponenten in de volgende volgorde toe in de volumes berekend in stap 2.1: PBS, vervolgens het peptide, vervolgens M. tuberculosis in CFA en ten slotte IFA.
- Sluit de buis met de dop stevig af door deze meerdere keren aan te spannen en los te maken. Schud de tube krachtig gedurende 5-10 s met de hand om de reagentia vooraf te mengen.
- Plaats de buis in de schudhomogenisator en zet deze vast met de staaf. Stel de snelheid in op de hoogste stand en de tijd op 60 s. Zodra de run is voltooid, plaatst u de buis gedurende 3 minuten op ijs. Herhaal de run nog een of twee keer met dezelfde instellingen.
- Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 1 minuut om opgesloten lucht te verwijderen en de emulsie te verdichten.
- Verwijder de dop van de buis, steek de zuiger in de buis en duw deze langzaam naar beneden totdat deze de bovenkant van de emulsie bereikt. Verwijder de kliksluiting aan de onderkant van de buis door deze te draaien.
- Verwijder de zuiger uit een injectiespuit (1 ml; zie materiaaltabel). Voeg een naald (bij voorkeur 25-27 G) toe aan de injectiespuit.
- Bevestig de achterkant van de injectiespuit aan het speciale slot aan de onderkant van de buis en vergrendel deze met een korte draai.
- Breng de emulsie van de buis over naar de injectiespuit door de zuiger voorzichtig in te drukken. Stop wanneer de emulsie de schaalverdeling van 0,15 ml van de injectiespuit bereikt.
- Scheid de injectiespuit van de buis en plaats de zuiger voorzichtig, waarbij u ervoor zorgt dat er geen lucht in de spuit komt. Druk op de zuiger totdat de emulsie uit de naald komt.
OPMERKING: Op dit punt kan een deel van de emulsie worden gebruikt voor kwaliteitscontrole (zie stap 3). - Herhaal stap 2.8-2.11 voor de rest van de emulsie die in de buis aanwezig is.
OPMERKING: Om de verspilling van dure CFA / antigeenemulsies te minimaliseren, moeten spuiten van 1 ml worden gebruikt. Andere spuiten die passen op het speciale slot aan de onderkant van de buis mogen worden gebruikt; het kan echter nodig zijn om een groter volume emulsie te bereiden. De CFA/MOG35-55 peptide-emulsie kan tot 15 weken bij 4 °C worden bewaard zonder zijn EAE-inducerende capaciteit te verliezen.
3. Kwaliteitscontrole van emulsie
- Druppeltest: Voeg een kleine druppel van de emulsie toe aan een steriele conische buis van 50 ml gevuld met 20 ml koud water. Sluit de buis en schud deze een paar seconden met de hand. Het verschijnen van kleine duidelijke druppeltjes bevestigt de vorming van een water-in-olie-emulsie.
- Onderzoek de emulsie met behulp van fasecontrastmicroscopie.
- Om de grootte van de water-in-oliedeeltjes te analyseren, voegt u een kleine druppel (2-3 μL) van de emulsie toe aan een microscoopglaasje, smeert u deze uit met een afdekslip en duwt u vervolgens hard in een cirkelvormige beweging om de emulsie af te vlakken.
- Onderzoek de uitgesmeerde emulsie onder een fasecontrastmicroscoop (zie Materiaaltabel) met 400x vergroting en focus op een veld met een monolaag van de emulsie. Zorg ervoor dat kleine uniforme grijze/witte deeltjes zichtbaar zijn (figuur 2A).
- Analyseer de deeltjesgrootte van de emulsie met behulp van laserdiffractie.
OPMERKING: Laserdiffractie meet deeltjesgrootteverdelingen met behulp van een laserstraal. Dit is de ultieme kwaliteitscontroletest voor emulsies. Een representatief resultaat van deeltjesgrootteverdelingen met behulp van de hier beschreven methode is weergegeven in figuur 2B (voor een gedetailleerde beschrijving, zie Topping et al.6). Niettemin zijn de valtest en het microscooponderzoek voldoende om te valideren of er een bevredigende emulsie is gevormd.- Stel de brekingsindices voor zowel rode als blauwe lasers voor het dispergeermiddel (zie Materiaaltabel) in op 1,456 en voor het monster op 1,33 op de deeltjesgrootteanalysator (zie Materiaaltabel). Stel de absorptie van de brekingsindex in op 0,02.
- Voeg één druppel van de spuit met de peptide-emulsie toe aan de dispersie-eenheid die lichte minerale olie bevat. Start de data-acquisitie onmiddellijk na dispersie van de emulsie.
OPMERKING: Er werd een algemeen model toegepast en er werd uitgegaan van bolvormige deeltjes voor de schatting van de deeltjesgrootteverdeling.
4. EAE-inductie met behulp van de MOG 35-55 peptide-emulsie in C57BL6 / J-muizen
OPMERKING: In alle experimenten werden vijf 8-12 weken oude vrouwelijke C57BL6 / J-muizen gebruikt.
- Verdoof de muizen voorafgaand aan de immunisatie met 2,5% verdampte isofluraan en bevestig met een stevige teenknijper.
- Injecteer elke muis subcutaan met spuiten van 1 ml op twee verschillende plaatsen, aan de rechter- en linkerkant van de achterflank met 200 μL emulsie met 50 μg MOG35-55 peptide in een 1:1 (v/v) verhouding van peptide/CFA.
- Ten minste 1,5 uur na de immunisatie met de emulsie, en dan nogmaals na 24 uur, dien in totaal 80 ng Bordetella kinkhoesttoxine in 200 μL kinkhoesttoxinebuffer toe aan elke muis, via intraperitoneale injecties (100 μL aan de linkerkant en 100 μL op de rechterplaats van de buik).
OPMERKING: Nauwkeurige lokalisatie van intraperitoneale injectie met kinkhoesttoxine is essentieel gebleken voor de activering van T-cellen in de drainerende lymfeklier15. - Optioneel: Injecteer MOG35-55 peptide opnieuw op dag 7 (zoals gebruikt in sommige protocollen16) door stap 4.2 te herhalen.
OPMERKING: Zorg er vooral voor dat de spuiten en naalden die worden gebruikt voor immunisatie die MOG / CFA- of kinkhoesttoxine bevatten, voldoende worden weggegooid in biohazard-zakken / containers. - Evalueer de klinische score dagelijks, met behulp van een schaal van 0-6 zoals eerder beschreven6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het snelle, eenvoudige en gestandaardiseerde protocol voor de bereiding van CFA/MOG-emulsies is weergegeven in figuur 1. Deze methode is onlangs elders beschreven6. De CFA/MOG emulsies kunnen ook worden bereid met andere methoden, zoals de traditionele spuitmethode of door vortexing. Deze methoden werden hier vergeleken door de kwaliteit van de emulsies te beoordelen. Alle methoden produceerden water-in-olie-emulsies; de homogeniteit en kwaliteit van deze emulsies werden beoordeeld door een kleine druppel op een glasplaat toe te voegen, gevolgd door observatie onder een fasecontrastmicroscoop. Emulsies geproduceerd door de schudhomogenisatiemethode vertoonden grijs / witte boonvormige deeltjes, die kleine druppeltjes water-in-olie-emulsies vertegenwoordigen. Daarentegen waren de emulsedruppels die met de spuitmethode werden geproduceerd groter en witter. Bij de vortexmethode werden grote grijs/zwarte deeltjes waargenomen, die overeenkomen met luchtbellen die in de emulsie gevangen zitten (figuur 2A).
Om de stabiliteit op lange termijn van water-in-olie-emulsies te testen, kunnen de veranderingen in de deeltjesgrootteverdeling in de loop van de tijd worden gemeten met behulp van een laserdiffractiedeeltjesgrootteanalysator. Emulsies bereid met het hier beschreven gestandaardiseerde protocol vertoonden geen verandering in deeltjesgrootte over een periode van 6 weken (figuur 2B). Daarom werd de mogelijkheid getest dat emulsies die het MOG35-55-peptide bevatten, gedurende een langere periode bij 4 °C kunnen worden bewaard en toch ziekte kunnen induceren. Emulsies die het CFA/MOG35-55-peptide bevatten, werden met deze methode bereid en onmiddellijk gebruikt of gedurende 3 of 15 weken bij 4 °C bewaard (figuur 3A). Muizen werden geïnjecteerd met 50 μg MOG35-55 peptide en scoorden op klinische ziekteverschijnselen zoals beschreven in het protocol. Opmerkelijk is dat de verse, 3 weken oude en 15 weken oude emulsies allemaal een vergelijkbare EAE-ziekte veroorzaakten bij alle dieren die tijdens het experiment werden getest (figuur 3A). Deze resultaten toonden dus aan dat emulsies die MOG35-55-peptiden bevatten die zijn bereid met behulp van de schudhomogenisatiemethode, minstens 15 weken kunnen worden bewaard en nog steeds EAE induceren met ziektescores die vergelijkbaar zijn met die bereikt met vers bereide emulsies.
Om de opzet van de experimenten te vereenvoudigen en te versnellen en om veel verschil in reagentia te voorkomen, werden alle benodigde componenten van tevoren bereid, gealiquoteerd en opgeslagen bij de juiste temperatuur. Vervolgens werden vijf experimenten uitgevoerd over een periode van 6 maanden. C57BL6 / J-muizen werden geïmmuniseerd met de MOG / CFA-emulsies bereid op de dag van immunisatie, met behulp van emulsiekits, en geëvalueerd op klinische symptomen. Muizen ontwikkelden een vergelijkbaar ziektepatroon in alle experimenten (figuur 3B), waaruit bleek dat de hier gepresenteerde homogenisatiemethode emulsies produceerde die EAE op een consistente en reproduceerbare manier induceerden.
De totale bereidingstijd, van het ophalen van alle reagentia, het toevoegen ervan en het drie keer schudden van de buis, en het laden van de spuiten met de emulsie, klaar voor immunisatie, duurt niet meer dan 30 minuten. Bovendien hoeft slechts 20% van de extra emulsie te worden voorbereid. Dit staat in schril contrast met andere protocollen, waar de voorbereidingstijd tot 1,5-2 uur kan zijn en 50% -100% extra emulsie mogelijk moet worden voorbereid om voldoende materiaal voor immunisatie te garanderen16.
Figuur 1: Schema van het proces van emulsievoorbereiding met behulp van een commerciële emulsiekit. Dit cijfer is met toestemming hergebruikt uit Topping et al6 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Karakterisering van emulsies geproduceerd met behulp van verschillende methoden. (A) Representatieve beelden van drie verschillende bereidingsmethoden: standaard homogenisatiemethode, traditionele spuitmethode en vortexmethode. Een kleine hoeveelheid emulsie werd op een glazen dia geplaatst en waargenomen onder een fasecontrastmicroscoop (400x). Schaalbalk = 50 μm. Van elke methode wordt een representatieve voorbereiding getoond uit >15 experimenten. De gemiddelde D [4, 3] (het volumegewogen gemiddelde) werd gemeten met een deeltjesgrootteanalysator van 0,7 μm voor de schudhomogenisatiemethode, 1,4 μm voor de spuitmethode en 5,4 μm voor de vortexmethode. (B) De stabiliteit van de emulsie in de loop van de tijd werd gemeten met behulp van de deeltjesgrootteanalysator. Een emulsie van CFA / PBS werd bereid met de schudhomogenisator en de emulsiekit, en de deeltjesgrootte bepaald, met behulp van laserdiffractie in de loop van de tijd. Eén monster werd onmiddellijk geanalyseerd en vervolgens werden de emulsies bewaard bij 4 °C. Deze monsters werden 1, 2, 4 en 6 weken na bereiding geanalyseerd. Het gemiddelde volumegewogen gemiddelde D [4, 3] voor alle monsters was 0,73 μm ± 0,03 μm (SD). Dit cijfer is met toestemming hergebruikt uit Topping et al6 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: EAE-inductie bij muizen geïmmuniseerd met een MOG35-55 peptide / CFA-preparaat met behulp van een commerciële emulsiekit. (A) EAE-inductie van de opgeslagen emulsie. Emulsies die CFA en 50 μg MOG35-55 peptide/muis bevatten, werden bereid met de homogenisatiemethode en gedurende 3 of 15 weken bewaard bij 4 °C. De vers bereide en opgeslagen emulsies werden op dezelfde dag geïnjecteerd in C57BL/6J muizen (n = 5 per groep). De muizen kregen 80 ng kinkhoesttoxine op dezelfde dag en 24 uur later, en werden gescoord voor tekenen van ziekte met behulp van klinische scores van 0-6. (B) Consistente inductie van EAE met de emulsies bereid met behulp van de homogenisatiemethode. Emulsies die CFA en 50 μg MOG35-55 peptide/muis bevatten, werden op verschillende tijdstippen bereid en geïnjecteerd in C57BL/6J-muizen (n = 5 per groep). De muizen kregen 80 ng kinkhoesttoxine op dezelfde dag en 24 uur later en werden gescoord op tekenen van ziekte. Dit cijfer is met toestemming hergebruikt uit Topping et al6 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Berekening van de hoeveelheid van elk reagens (MOG35-55 peptide, PBS, CFA en IFA) voor emulsiepreparaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Water-in-olie-emulsies, zoals antigeen /Freund's adjuvans, worden al meer dan een halve eeuw gebruikt om EAE17 te induceren. Er is momenteel geen gestandaardiseerde methode om antigeenemulsies te bereiden die onafhankelijk is van menselijke invloed. Handmatig mengen met spuiten is standaard voor de meeste laboratoria, maar deze methode is tijdrovend, resulteert vaak in een overmatig verlies van materiaal en de kwaliteit verschilt afhankelijk van de wetenschapper die het bereidt.
De methode die in dit manuscript wordt gepresenteerd, maakt gebruik van een standaard schudhomogenisatiemachine om de antigeen / CFA-emulsies te bereiden. Bovendien kunnen alle reagentia die hier worden gebruikt, worden gealiquoteerd en gedurende een lange periode worden bewaard, waardoor het gemakkelijk en snel is om emulsies te bereiden. De totale tijd voor het bereiden van emulsies voor maximaal 80 muizen is ongeveer 30 minuten. Dit staat in schril contrast met andere gepubliceerde methoden, die 1-1,5 uur nodig hebben voor het bereiden van MOG35-55 emulsies16,18. Andere handmatige methoden, zoals de methode met één spuit, worden vaak geassocieerd met het inbrengen van luchtbellen in de spuiten5. De hier gepresenteerde methode is zo ontworpen dat de emulsie vanaf hun achterkant in spuiten wordt geduwd, waardoor de introductie van luchtbellen wordt geëlimineerd en het verlies van materiaal wordt geminimaliseerd.
Om consistente resultaten en minimale verspilling van emulsie te garanderen, zijn er enkele kritieke stappen in de schudhomogenisatiemethode die specifieke aandacht vereisen. De buis en de reagentia moeten op ijs worden geplaatst voordat het experiment wordt gestart en na de homogenisatiestap. Het PBS en antigeen moeten eerst aan de buis worden toegevoegd, gevolgd door het adjuvans (CFA/IFA), om hoge lokale concentraties antigeen te voorkomen bij het mengen met het olieadjuvans. Het deksel moet stevig worden vastgedraaid door het een paar keer te openen en te sluiten om lekken te voorkomen. Bovendien mag de spuit niet volledig met de emulsie worden gevuld, alleen tot de markering van 0,15 ml op de spuitloop om verspilling van de emulsie te voorkomen. De zuiger moet zeer voorzichtig in de spuit worden ingebracht, met beide handen. Nadat alle spuiten zijn gevuld met de emulsie, kunnen de spuiten bij kamertemperatuur worden bewaard als ze dezelfde dag moeten worden gebruikt; anders moeten ze tot gebruik bij 4 °C worden bewaard.
Antigeen/CFA-emulsies bereid volgens de schudhomogenisatiemethode kunnen minder stevig lijken in vergelijking met die bereid met de spuitmethode. Er kan een extra schudstap worden toegevoegd (zie stap 2.5 in het protocol), die de emulsie kan verdikken. Emulsies die de "valtest" en het fasecontrastmicroscooponderzoek doorstaan, induceren echter EAE, ongeacht de fysieke toestand van de emulsie.
De initiële investering die nodig is in een schudende homogenisatiemachine is een beperking. De hier beschreven voorbereidingsstappen zorgen echter voor minimale verspilling van emulsie en het antigeen, dat vaak duur is om te kopen of lang duurt om te bereiden. Daarom is deze methode op de lange termijn goedkoper in gebruik, omdat het tijd en reagentia bespaart. Het antigeen en de buffer die worden gebruikt in de schudhomogenisatiemethode kunnen de kwaliteit van de emulsie beïnvloeden. Het MOG35-55 peptide opgelost in PBS zonder Ca2+/Mg2+ genereerde consequent emulsies met kleine uniforme water-in-olie deeltjes (figuur 2A). Peptide-antigenen opgelost in PBS met Ca2 +/ Mg2 +, of peptiden die veel geladen aminozuurresiduen bevatten, kunnen echter emulsies genereren die minder stroperig zijn. Of dergelijke emulsies minder snel ziekte veroorzaken in diermodellen is niet getest. Een andere beperking van deze methode is dat niet meer dan 8 ml antigeen/CFA-emulsie uit één buis kan worden bereid. De buizen mogen niet worden geladen met meer dan 9,6 ml in totaal (4,8 ml PBS / antigeen en 4,8 ml CFA / IFA), wat voldoende is om acht spuiten van 1 ml te laden. Hoewel de buis een groter volume kan bevatten, moet er wat lucht in de buis aanwezig zijn, anders worden er geen perfecte emulsies gegenereerd. Als er meer emulsie nodig is, kan deze worden bereid met behulp van extra buizen.
In vergelijking met bestaande methoden is er geen verschil van persoon tot persoon bij het voorbereiden van de emulsies met de schudhomogenisatiemethode. De meest gebruikte methode om emulsies voor EAE-experimenten te bereiden, maakt gebruik van spuiten die met de hand heen en weer worden geduwd19. De kracht, tijd en temperatuur kunnen niet goed worden gecontroleerd en het is daarom moeilijk om een op spuiten gebaseerde methode te standaardiseren. Andere methoden voor het maken van water-in-olie-emulsies maken gebruik van ultrasone waterbad sonicators. Emulsies bereid met een ultrasoonapparaatmethode kunnen EAE induceren bij anders resistente BALB / c-muizen8. De beschreven methode kan gestandaardiseerd en daarom nuttig zijn. Het probleem met ultrasone waterbad- en ultrasone sonde-sonicators is echter dat het moeilijk is om de emulsie in de buizen over te brengen naar spuiten die worden gebruikt voor immunisatie zonder luchtbellen te introduceren. De buizen die worden gebruikt voor de hier gepresenteerde methode elimineren dit probleem.
Een vortexmethode kan worden beschouwd als een gestandaardiseerde methode met een ingestelde snelheid, tijd en temperatuur. Het testen van deze methode om een emulsie te bereiden door het MOG / CFA-preparaat gedurende 10 minuten te vortexen, resulteerde echter niet in ziekte-inductie bij C57BL / 6J-muizen (gegevens niet getoond). Niettemin kan EAE worden geïnduceerd met een antigeen / CFA-mengsel bereid door vortexing gedurende 45 min18, wat een veel langere procedure zou zijn in vergelijking met de methode die in dit manuscript wordt gepresenteerd.
Een ander op olie gebaseerd adjuvans (zie tabel met materialen), goedgekeurd door de FDA om op mensen te worden gebruikt, dat een water-in-olie-emulsie produceert, is een veelbelovend adjuvans gebleken voor kanker- en malariavaccins 20,21,22. Daarom kan het hier gepresenteerde gestandaardiseerde protocol worden aangepast voor gebruik in de kliniek. Voorlopige experimenten hebben aangetoond dat de schudhomogenisatiemethode emulsies genereert met deze door de FDA goedgekeurde olie die van betere kwaliteit zijn in vergelijking met de handmatige spuitmethode (gegevens niet getoond).
Kortom, de hier gepresenteerde schudhomogenisatiemethode biedt een aantal voordelen, zoals de snellere generatie van kwaliteitsgecontroleerde emulsies, hoge reproduceerbaarheid in een aantal auto-immuunziektemodellen en een vermindering van dure reagentia die nodig zijn om antigeen / CFA-emulsies te bereiden. Aangezien er geen persoonlijk verschil is bij het genereren van deze water-in-olie-emulsies, biedt het de mogelijkheid om deze methode te standaardiseren die nodig is voor reproduceerbaar biomedisch onderzoek en medicijnontdekking op het gebied van auto-immuunziekten en therapeutische vaccinontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BTB Emulsions AB heeft een octrooiaanvraag ingediend voor het gebruik van een apparaat en methode voor het bereiden van emulsies voor immunisatie en dieren en mensen (Europees octrooiaanvraagnummer: EP3836884A1). BTB is de CEO en oprichter van het bedrijf en aandeelhouder van BTB Emulsions. Bertin-Instruments distribueert de emulsiekits die in deze publicatie worden gebruikt wereldwijd.
Acknowledgments
De auteur wil graag de dierenverblijven van de Universiteit van Lund, Camilla Björklöv en Agnieszka Czopek, bedanken voor hun steun, en Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, VK, voor constructieve kritiek en taalkundige ondersteuning bij het produceren van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
- Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
- Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
- Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
- Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
- Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
- Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
- Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
- Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15 Unit 15.6 (2003).
- Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
- Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
- Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
- Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
- Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
- Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
- Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).
