Summary
प्रयोगात्मक ऑटोम्यून्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस को प्रेरित करने के लिए, मल्टीपल स्केलेरोसिस का एक पशु मॉडल, चूहों को एक ऑटोएंटीजन युक्त पानी-इन-ऑयल इमल्शन के साथ प्रतिरक्षित किया जाता है और फ्रायंड के सहायक को पूरा करता है। जबकि इन इमल्शन की तैयारी के लिए कई प्रोटोकॉल मौजूद हैं, इमल्शन तैयारी के लिए एक तेज़, सरल और मानकीकृत होमोजेनाइजेशन प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया गया है।
Abstract
प्रायोगिक ऑटोम्यून्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) के साथ समान प्रतिरक्षात्मक और नैदानिक विशेषताओं को साझा करता है, और इसलिए बेहतर रोगी उपचार के लिए नए दवा लक्ष्यों की पहचान करने के लिए एक मॉडल के रूप में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। एमएस को कई अलग-अलग रोग पाठ्यक्रमों की विशेषता है: रिलैप्सिंग-रेमिटिंग एमएस (आरआरएमएस), प्राथमिक प्रगतिशील एमएस (पीपीएमएस), माध्यमिक प्रगतिशील एमएस (एसपीएमएस), और एमएस (पीआरएमएस) का एक दुर्लभ प्रगतिशील-रिलैप्सिंग रूप। यद्यपि पशु मॉडल इन सभी विपरीत मानव रोग फेनोटाइप्स की सटीक नकल नहीं करते हैं, लेकिन ईएई मॉडल हैं जो एमएस के कुछ विभिन्न नैदानिक अभिव्यक्तियों को दर्शाते हैं। उदाहरण के लिए, सी 57बीएल / 6 जे चूहों में माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी) -प्रेरित ईएई मानव पीपीएमएस की नकल करता है, जबकि एसजेएल / जे चूहों में माइलिन प्रोटियोलिपिड प्रोटीन (पीएलपी) -प्रेरित ईएई आरआरएमएस जैसा दिखता है। अन्य ऑटोएंटीजन, जैसे माइलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी), और कई अलग-अलग माउस उपभेदों का उपयोग ईएई का अध्ययन करने के लिए भी किया जाता है। इन ऑटोएंटीजन-टीकाकरण ईएई मॉडल में बीमारी को प्रेरित करने के लिए, एक पानी-इन-ऑयल इमल्शन तैयार किया जाता है और चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया जाता है। अधिकांश ईएई मॉडल को बीमारी विकसित करने के लिए पर्टुसिस विष के इंजेक्शन की भी आवश्यकता होती है। सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ईएई प्रेरण के लिए, अभिकर्मकों को एंटीजन / सहायक इमल्शन का उत्पादन करने के लिए तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल आवश्यक है। यहां वर्णित विधि पानी-इन-ऑयल इमल्शन उत्पन्न करने के लिए एक मानकीकृत विधि का लाभ उठाती है। यह सरल और तेज़ है और गुणवत्ता-नियंत्रित इमल्शन तैयार करने के लिए सिरिंज के बजाय एक हिलाने वाले होमोजेनाइज़र का उपयोग करता है।
Introduction
इम्यूनोलॉजिकल सहिष्णुता के टूटने से ऑटोइम्यून विकारों की पीढ़ी हो सकती है, जैसे कि मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस)। यह अनुमान लगाया गया हैकि दुनिया भर में 2.8 मिलियन लोग एमएस के साथ रह रहे हैं। यद्यपि एमएस का सटीक कारण अभी भी काफी हद तक अज्ञात है, ऑटोरिएक्टिव टी और बी कोशिकाओं की विकृति, साथ ही ट्रेग फ़ंक्शन में दोष, रोगके रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं 2,3.
ऑटोइम्यून रोगों के पशु मॉडल संभावित चिकित्सीय तौर-तरीकों की जांच के लिए आवश्यक उपकरण हैं। प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) मॉडल का उपयोग एमएस4 में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं द्वारा लगभग एक सदी के लिए किया गया है। शुरुआती प्रयोगों में, बीमारी की घटना अपेक्षाकृत कम थी। माइकोबैक्टीरियम और पर्टुसिस टॉक्सिन युक्त पूर्ण फ्रायंड के सहायक (सीएफए) की शुरूआत ने चूहों में ईएई के लगातार प्रेरण को सक्षमकिया। सबसे महत्वपूर्ण बात, ईएई को प्रेरित करने के लिए एक समरूप पानी-इन-ऑयल इमल्शन उत्पन्न करने के लिए सीएफए को एक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) -विशिष्ट एंटीजन के साथ मिलाना आवश्यक है। वर्तमान में उपलब्ध सबसे आम ईएई मॉडल एन्सेफेलिटोजेनिक पेप्टाइड्स के साथ चूहों के सक्रिय टीकाकरण पर आधारित हैं। चूहों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि रोग संवेदनशीलता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, जिसमें माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी35-55) और माइलिन प्रोटिओलिपिड प्रोटीन (पीएलपी139-151) पेप्टाइड्स का उपयोग क्रमशः सी 57बीएल / 6 जे और एसजेएल चूहों में ईएई को प्रेरित करने के लिए कियाजाता है। हालांकि, अन्य माउस उपभेदों और सीएनएस-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स का भी उपयोग किया जा सकता है।
पेप्टाइड इमल्शन की गुणवत्ता एक महत्वपूर्ण कारक है जो सक्रिय टीकाकरण ईएई मॉडल 6 में रोग पेनेट्रेंस निर्धारित करताहै। सीएफए के साथ जलीय बफर में घुले एन्सेफेलिटोजेनिक पेप्टाइड्स को मिलाकर एक सजातीय पानी-इन-ऑयल इमल्शन तैयार किया जाना चाहिए, अन्यथा जानवरों में बीमारी विकसित नहीं होगी। पेप्टाइड इमल्शन की तैयारी पर कई प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गए हैं। उदाहरणों में एक भंवर7, सोनिकेशन8, सिरिंज और तीन-तरफा टी कनेक्टर9, या एक सिरिंज केवल5 का उपयोग शामिल है। हालांकि, इन सभी विधियों को मानकीकृत करना मुश्किल है और अक्सर लंबे और जटिल प्रोटोकॉल से जुड़े होते हैं।
उपरोक्त सभी विधियों की तुलना में, इमल्शन तैयारी के लिए यहां वर्णित सरल विधि कोई व्यक्ति-से-व्यक्ति अंतर नहीं होने और अपेक्षाकृत तेज होने के फायदे प्रदान करती है। इमल्शन एक होमोजेनाइज़र द्वारा उत्पन्न होता है जो अभिकर्मकों को एक निर्धारित गति, समय और तापमान के साथ हिलाता है, जिससे तेज और सुसंगत परिणाम सुनिश्चित होते हैं। ईएई मॉडल में रोग को प्रेरित करने के अलावा, इस विधि का उपयोग कोलेजन-प्रेरित गठिया (सीआईए) और एंटीजन प्रेरित गठिया (एआईए) 6 जैसे अन्य ऑटोइम्यून रोग मॉडल का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है। इसलिए, यह अनुमान लगाया गया है कि इस विधि का उपयोग अन्य पशु मॉडल में बीमारी को लगातार प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है जो ऑटोएंटीजन के साथ पानी-इन-ऑयल इमल्शन पर निर्भर करते हैं, जैसे कि प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून न्यूरिटिस (ईएएन)10, प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस (ईएटी)11, ऑटोइम्यून यूवाइटिस (ईएयू)12, और मायस्थेनिया ग्रेविस (एमजी)13। यह विधि सामान्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को भी प्रेरित करती है जैसे कि विलंबित-प्रकार अतिसंवेदनशीलता (डीटीएच) लगातार6, और इसलिए इसका उपयोग कैंसर और मलेरिया के टीके देने के लिए किया जा सकता है (चर्चा देखें)।
इस प्रकार, एक तेजी से (कुल तैयारी समय ~ 30 मिनट), सरल (सभी अभिकर्मकों को पहले से तैयार और संग्रहीत किया जा सकता है), और मानकीकृत (इमल्शन को एक हिलाने वाले होमोजेनाइज़र का उपयोग करके पूरा किया जाता है) विधि विकसित की गई है और यहां प्रस्तुत की गई है। एंटीजन इमल्शन इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार किए गए ऑटोइम्यून पशु मॉडल में लगातार बीमारी को प्रेरित करते हैं।
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Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं को स्वीडिश बोर्ड ऑफ एनिमल रिसर्च की प्रथाओं के अनुसार किया गया था और पशु नैतिकता समिति, लुंड-माल्मो, स्वीडन (परमिट संख्या: एम 126-16) द्वारा अनुमोदित किया गया था।
नोट: विधि का एक योजनाबद्ध प्रवाह चित्रा 1 में वर्णित है।
1. सामग्री तैयारी
नोट: सभी अभिकर्मकों को बाँझ हुड में सड़न से तैयार करें, और संकेतित तापमान पर एलिकोट और स्टोर करें। अभिकर्मकों को उनके प्रभाव को खोए बिना 2 साल तक संग्रहीत किया जा सकता है।
- 20 मिलीग्राम / एमएल माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस युक्त सीएफए तैयार करें जैसा कि नीचे वर्णित है।
- तपेदिक एच 37 आरए (सामग्री की तालिका देखें) और 7 एमएल ट्यूब में पांच 3.2 मिमी स्टील मोती जोड़ें (सामग्री की तालिका देखें)। उच्चतम गति सेटिंग (5,000 आरपीएम) पर 60 सेकंड के लिए एक होमोजेनाइज़र (सामग्री की तालिका देखें) में ट्यूब को हिलाएं।
- ट्यूब में अपूर्ण फ्रायंड के सहायक (आईएफए) के 5 एमएल जोड़ें और उच्चतम गति पर 60 सेकंड के लिए फिर से हिलाएं। आईएफए (अब सीएफए नाम दिया गया है) में होमोजेनाइज्ड एम. ट्यूबरकुलोसिस के घोल को पिपेट के साथ एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें, मोतियों को पीछे छोड़ दें, और उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- 10 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम पेप्टाइड एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एमओजी35-55 पेप्टाइड ( सामग्री की तालिका देखें) के फ्रीज-सूखे पाउडर में अल्ट्राप्योर पानी जोड़ें। घोल को 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से पारित करके निष्फल करें। 60 μL एलिकोट तैयार करें और उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: इस प्रयोग के लिए उपयोग किया जाने वाला एमओजी35-55 पेप्टाइड इम्यूनोग्रेड शुद्धता (~ 70%) का है, टीएफए-क्लीवर है, पानी में आसानी से घुल जाता है, और इसमें विवो स्थिरता14 में वृद्धि के लिए सी-टर्मिनल एमाइड (-एनएच2) होता है। पेप्टाइड एलिकोट को कभी भी पिघलाया नहीं गया और दो बार से अधिक फिर से जमे हुए, और उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया। - 100 एमएल पर्टुसिस टॉक्सिन बफर तैयार करें: 1x Ca 2+/Mg 2+ मुक्त PBS के 80 mL में2.9 ग्राम NaCl को घोलें और 10% ट्राइटन X-100 का 100 μL जोड़ें। पीबीएस के साथ वॉल्यूम को 100 एमएल में समायोजित करें और इसे 0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से पारित करके समाधान को निष्फल करें। 10 एमएल एलिकोट तैयार करें और उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
2. सीएफए/पेप्टाइड इमल्शन की तैयारी
- टीकाकरण के लिए आवश्यक इमल्शन की मात्रा की गणना करें। इस मानक प्रोटोकॉल में, प्रत्येक माउस को फ्रंड के सहायक (सीएफए) में फैले एमओजी35-55 पेप्टाइड का 50 μg और एम. ट्यूबरकुलोसिस का 300 μg प्राप्त होता है। इमल्शन तैयार करने के लिए आवश्यक प्रत्येक अभिकर्मक (एमओजी35-55 पेप्टाइड, पीबीएस, सीएफए और आईएफए) की मात्रा की गणना पूरक फ़ाइल 1 का उपयोग करके की जा सकती है। इमल्शन के छोटे नुकसान की भरपाई के लिए सभी अभिकर्मकों का एक अतिरिक्त 20% गणना में शामिल है।
नोट: इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली वाणिज्यिक इमल्शन किट ( सामग्री की तालिका देखें) में एक नसबंदी थैली में एक ट्यूब, स्क्रू कैप और एक प्लंजर शामिल है। इमल्शन किट की प्रत्येक ट्यूब में अधिकतम 9.6 एमएल होता है, जिससे 40 चूहों (या 80 चूहों यदि प्रति जानवर 100 आरएल इमल्शन का उपयोग करते हैं) को प्रतिरक्षित करने के लिए पर्याप्त 8 x 1 एमएल सिरिंज तैयार करना संभव हो जाता है। - स्क्रू कैप्ड ट्यूब (वाणिज्यिक इमल्शन किट से) और बर्फ पर उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों को रखें।
- चरण 2.1 में गणना की गई मात्राओं में निम्नलिखित क्रम में इमल्शन घटक जोड़ें: पीबीएस, फिर पेप्टाइड, फिर सीएफए में एम तपेदिक , और अंत में आईएफए।
- टोपी के साथ ट्यूब को कई बार कसकर और ढीला करके मजबूती से बंद करें। अभिकर्मकों को पूर्व-मिश्रण करने के लिए हाथ से 5-10 सेकंड के लिए ट्यूब को जोर से हिलाएं।
- ट्यूब को हिलाने वाले होमोजेनाइज़र में रखें और इसे रॉड के साथ सुरक्षित करें। गति को उच्चतम सेटिंग और समय को 60 सेकंड पर सेट करें। एक बार रन समाप्त हो जाने के बाद, ट्यूब को 3 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। एक ही सेटिंग्स के साथ रन को एक या दो बार दोहराएं।
- फंसी हुई हवा को हटाने और इमल्शन को कॉम्पैक्ट करने के लिए 1 मिनट के लिए ट्यूब को 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- ट्यूब से टोपी निकालें, ट्यूब में प्लंजर डालें, और इसे धीरे-धीरे नीचे धकेलें जब तक कि यह इमल्शन के शीर्ष तक न पहुंच जाए। ट्यूब के निचले भाग में स्नैप ऑफ बंद करके इसे हटा दें।
- इंजेक्शन सिरिंज से प्लंजर निकालें (1 एमएल; सामग्री की तालिका देखें)। इंजेक्शन सिरिंज में एक सुई (अधिमानतः 25-27 ग्राम) जोड़ें।
- इंजेक्शन सिरिंज के पिछले छोर को ट्यूब के निचले हिस्से में समर्पित लॉक से जोड़ें और इसे एक छोटे मोड़ के साथ लॉक करें।
- प्लंजर को धीरे से धक्का देकर ट्यूब से इंजेक्शन सिरिंज में इमल्शन स्थानांतरित करें। जब इमल्शन इंजेक्शन सिरिंज के 0.15 एमएल स्नातक स्तर तक पहुंच जाता है तो बंद हो जाएं।
- ट्यूब से इंजेक्शन सिरिंज को अलग करें और प्लंजर को सावधानी से डालें, इस बात का ध्यान रखते हुए कि कोई हवा सिरिंज में प्रवेश न करे। प्लंजर को तब तक धक्का दें जब तक कि सुई से इमल्शन बाहर न आ जाए।
नोट: इस बिंदु पर, कुछ इमल्शन का उपयोग गुणवत्ता नियंत्रण के लिए किया जा सकता है (चरण 3 देखें)। - ट्यूब में मौजूद शेष इमल्शन के लिए चरण 2.8-2.11 दोहराएं।
एंटीजन इमल्शन की बर्बादी को कम करने के लिए, 1 एमएल सिरिंज का उपयोग किया जाना चाहिए। अन्य सिरिंज जो ट्यूब के तल पर समर्पित लॉक को फिट करते हैं, का उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, इमल्शन की एक बड़ी मात्रा तैयार करने की आवश्यकता हो सकती है। सीएफए / एमओजी35-55 पेप्टाइड इमल्शन को इसकी ईएई-उत्प्रेरण क्षमता को खोए बिना 15 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
3. इमल्शन का गुणवत्ता नियंत्रण
- ड्रॉप-टेस्ट: 20 एमएल ठंडे पानी से भरे बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इमल्शन की एक छोटी बूंद जोड़ें। ट्यूब को बंद करें और इसे कुछ सेकंड के लिए हाथ से हिलाएं। छोटी अलग बूंदों की उपस्थिति पानी-इन-ऑयल इमल्शन के गठन की पुष्टि करती है।
- चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इमल्शन की जांच करें।
- पानी में तेल के कणों के आकार का विश्लेषण करने के लिए, एक माइक्रोस्कोप स्लाइड में इमल्शन की एक छोटी बूंद (2-3 μL) जोड़ें, इसे कवर स्लिप के साथ बाहर निकालें, और फिर इमल्शन को समतल करने के लिए एक गोलाकार गति में जोर से धक्का दें।
- 400x आवर्धन के साथ एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) के तहत स्मीयर इमल्शन की जांच करें और इमल्शन के मोनोलेयर वाले क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करें। सुनिश्चित करें कि छोटे समान ग्रे / सफेद कण दिखाई दे रहे हैं (चित्रा 2 ए)।
- लेजर विवर्तन का उपयोग करके इमल्शन कण आकार का विश्लेषण करें।
नोट: लेजर विवर्तन एक लेजर बीम का उपयोग करके कण आकार वितरण को मापता है। यह इमल्शन के लिए अंतिम गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण है। यहां वर्णित विधि का उपयोग करके कण आकार वितरण का एक प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 बी में दिखाया गया है (विस्तृत विवरण के लिए, टॉपिंग एट अल.6 देखें)। फिर भी, ड्रॉप टेस्ट और माइक्रोस्कोप परीक्षा यह सत्यापित करने के लिए पर्याप्त हैं कि क्या एक संतोषजनक इमल्शन का गठन किया गया है।- कण आकार विश्लेषक पर फैलाव के लिए लाल और नीले लेजर दोनों के लिए अपवर्तक सूचकांक सेट करें ( सामग्री की तालिका देखें) और नमूने के लिए 1.33 पर ( सामग्री की तालिका देखें)। अपवर्तक अनुक्रमणिका का अवशोषण 0.02 पर सेट करें.
- हल्के खनिज तेल युक्त फैलाव इकाई में पेप्टाइड इमल्शन युक्त सिरिंज से एक बूंद जोड़ें। इमल्शन के फैलाव के तुरंत बाद डेटा अधिग्रहण शुरू करें।
नोट: कण आकार वितरण के अनुमान के लिए एक सामान्य-उद्देश्य मॉडल लागू किया गया था, और गोलाकार कणों को माना गया था।
4. सी 57बीएल6/जे चूहों में एमओजी 35-55 पेप्टाइड इमल्शन का उपयोग करके ईएई प्रेरण
नोट: सभी प्रयोगों में, पांच 8-12 सप्ताह की मादा C57BL6 / J चूहों का उपयोग किया गया था।
- टीकाकरण से पहले, 2.5% वाष्पीकृत आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें और एक दृढ़ पैर की अंगुली चुटकी का उपयोग करके पुष्टि करें।
- प्रत्येक माउस को 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके दो अलग-अलग साइटों में इंजेक्ट करें, पिछले फ्लैंक के दाईं और बाईं ओर 200 μL इमल्शन के साथ जिसमें 50 μg MOG35-55 पेप्टाइड होता है, पेप्टाइड / CFA के 1: 1 (v / v) अनुपात में।
- इमल्शन के साथ टीकाकरण के कम से कम 1.5 घंटे बाद, और फिर 24 घंटे के बाद, इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन (बाईं ओर 100 μL और पेट की दाईं साइट पर 100 μL) के माध्यम से प्रत्येक माउस को 200 μL पर्टुसिस टॉक्सिन बफर में बोर्डेटेला पर्टुसिस टॉक्सिन के कुल 80 एनजी का प्रशासन करें।
नोट: पर्टुसिस विष के साथ इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन का सटीक स्थानीयकरण लिम्फ नोड15 में टी कोशिकाओं के सक्रियण के लिए आवश्यक दिखाया गया है। - वैकल्पिक: चरण 4.2 को दोहराकर दिन 7 पर फिर से एमओजी35-55 पेप्टाइड इंजेक्ट करें (जैसा कि कुछ प्रोटोकॉल16 में उपयोग किया जाता है)।
नोट: सबसे महत्वपूर्ण बात, सुनिश्चित करें कि एमओजी / सीएफए या पर्टुसिस टॉक्सिन युक्त टीकाकरण के लिए उपयोग की जाने वाली सिरिंज और सुइयों को बायोहाजार्ड बैग / कंटेनरों में पर्याप्त रूप से निपटाया जाता है। - 0-6 से पैमाने का उपयोग करके दैनिक नैदानिक स्कोर का मूल्यांकन करें जैसा कि पहले वर्णित6 है।
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Representative Results
एमओजी इमल्शन की तैयारी के लिए तेजी से, सरल और मानकीकृत प्रोटोकॉल चित्रा 1 में दर्शाया गया है। इस विधि को हाल ही में कहीं और वर्णित किया गयाहै 6. सीएफए / एमओजी इमल्शन को अन्य तरीकों से भी तैयार किया जा सकता है, जैसे कि पारंपरिक सिरिंज विधि या भंवर द्वारा। इमल्शन की गुणवत्ता का आकलन करके इन विधियों की तुलना यहां की गई थी। सभी विधियों ने पानी-इन-तेल इमल्शन का उत्पादन किया; इन इमल्शनों की एकरूपता और गुणवत्ता का मूल्यांकन ग्लास-स्लाइड पर एक छोटी सी बूंद जोड़कर किया गया था, जिसके बाद एक चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन किया गया था। हिलने वाली होमोजेनाइजेशन विधि द्वारा उत्पादित इमल्शन ने भूरे / सफेद बीन के आकार के कणों को प्रदर्शित किया, जो पानी-इन-ऑयल इमल्शन की छोटी बूंदों का प्रतिनिधित्व करते थे। इसके विपरीत, सिरिंज विधि का उपयोग करके उत्पादित इमल्शन की बूंदें बड़ी और सफेद थीं। भंवर विधि में, बड़े भूरे / काले कण देखे गए, जो इमल्शन में फंसे हवा के बुलबुले के अनुरूप थे (चित्रा 2 ए)।
पानी-इन-तेल इमल्शन की दीर्घकालिक स्थिरता का परीक्षण करने के लिए, समय के साथ कण आकार वितरण में परिवर्तन को लेजर विवर्तन कण आकार विश्लेषक का उपयोग करके मापा जा सकता है। यहां वर्णित मानकीकृत प्रोटोकॉल के साथ तैयार इमल्शन ने 6 सप्ताह की अवधि में कण आकार में कोई बदलाव नहीं दिखाया (चित्रा 2 बी)। इसलिए, संभावना है कि एमओजी35-55 पेप्टाइड युक्त इमल्शन को विस्तारित अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और अभी भी बीमारी को प्रेरित करता है। एमओजी35-55 पेप्टाइड युक्त इमल्शन इस विधि के साथ तैयार किए गए थे और तुरंत उपयोग किए गए थे या 3 या 15 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए गए थे (चित्रा 3 ए)। चूहों को एमओजी35-55 पेप्टाइड के 50 μg के साथ इंजेक्ट किया गया था और प्रोटोकॉल में वर्णित बीमारी के नैदानिक संकेतों के लिए स्कोर किया गया था। उल्लेखनीय रूप से, ताजा, 3 सप्ताह के और 15 सप्ताह के इमल्शन सभी ने प्रयोग के दौरान परीक्षण किए गए सभी जानवरों में समान ईएई रोग को प्रेरित किया (चित्रा 3 ए)। इस प्रकार, इन परिणामों से पता चला है कि हिलने वाली होमोजेनाइजेशन विधि का उपयोग करके तैयार एमओजी35-55 पेप्टाइड्स युक्त इमल्शन को कम से कम 15 सप्ताह तक संग्रहीत किया जा सकता है और फिर भी ताजा तैयार इमल्शन के साथ प्राप्त किए गए रोग स्कोर के साथ ईएई को प्रेरित किया जा सकता है।
प्रयोगों के सेटअप को सरल बनाने और गति देने के लिए और अभिकर्मकों के बहुत-से-बहुत अंतर से बचने के लिए, सभी आवश्यक घटकों को तैयार किया गया था, एलिकोट किया गया था, और पहले से ही उचित तापमान पर संग्रहीत किया गया था। फिर, 6 महीने की अवधि में पांच प्रयोग किए गए। सी 57बीएल 6 / जे चूहों को इमल्शन किट का उपयोग करके टीकाकरण के दिन तैयार एमओजी / सीएफए इमल्शन के साथ प्रतिरक्षित किया गया था, और नैदानिक लक्षणों के लिए मूल्यांकन किया गया था। चूहों ने सभी प्रयोगों (चित्रा 3 बी) में एक समान रोग पैटर्न विकसित किया, जिससे पता चला कि यहां प्रस्तुत होमोजेनाइजेशन विधि ने इमल्शन का उत्पादन किया जो ईएई को सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से प्रेरित करता है।
सभी अभिकर्मकों को पुनः प्राप्त करने, उन्हें जोड़ने और ट्यूब को तीन बार हिलाने, और टीकाकरण के लिए तैयार इमल्शन के साथ सिरिंज लोड करने से कुल तैयारी का समय 30 मिनट से अधिक नहीं लगता है। इसके अलावा, अतिरिक्त इमल्शन का केवल 20% तैयार किया जाना है। यह अन्य प्रोटोकॉल के विपरीत है, जहां तैयारी का समय 1.5-2 घंटे तक हो सकता है और टीकाकरण के लिए पर्याप्त सामग्री सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त इमल्शन का 50% -100% तैयार करने की आवश्यकता हो सकती है।
चित्रा 1: एक वाणिज्यिक इमल्शन किट का उपयोग करके इमल्शन तैयारी की प्रक्रिया का योजनाबद्ध। इस आंकड़े को अनुमति के साथ टॉपिंग एट अल6 से पुन: उपयोग किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: विभिन्न विधियों का उपयोग करके उत्पादित इमल्शन का लक्षण वर्णन। (A) तीन अलग-अलग तैयारी विधियों से प्रतिनिधि छवियां: मानक समरूपीकरण विधि, पारंपरिक सिरिंज विधि और भंवर विधि। इमल्शन की एक छोटी मात्रा को ग्लास स्लाइड पर रखा गया था और एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप (400x) के तहत देखा गया था। स्केल बार = 50 μm. >15 प्रयोगों से प्रत्येक विधि की एक प्रतिनिधि तैयारी दिखाई गई है। औसत डी [4, 3] (आयतन भारित माध्य) को एक कण आकार विश्लेषक के साथ हिलाने वाली समरूपीकरण विधि के लिए 0.7 μm, सिरिंज विधि के लिए 1.4 μm और भंवर विधि के लिए 5.4 μm मापा गया था। (बी) कण आकार विश्लेषक का उपयोग करके समय के साथ इमल्शन की स्थिरता को मापा गया था। सीएफए /पीबीएस का एक इमल्शन हिलिंग होमोजेनाइज़र और इमल्शन किट के साथ तैयार किया गया था, और समय के साथ लेजर विवर्तन का उपयोग करके कण आकार निर्धारित किया गया था। एक नमूने का तुरंत विश्लेषण किया गया और फिर इमल्शन को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया। तैयारी के 1, 2, 4 और 6 सप्ताह बाद इन नमूनों का विश्लेषण किया गया था। सभी नमूनों के लिए औसत डी [4, 3] मात्रा भारित औसत 0.73 μm ± 0.03 μm (SD) था। इस आंकड़े को अनुमति के साथ टॉपिंग एट अल6 से पुन: उपयोग किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: वाणिज्यिक इमल्शन किट का उपयोग करके एमओजी35-55 पेप्टाइड / सीएफए तैयारी के साथ प्रतिरक्षित चूहों में ईएई प्रेरण। (ए) संग्रहीत इमल्शन का ईएई प्रेरण। माउस के सीएफए और 50 μg MOG35-55 पेप्टाइड / माउस युक्त इमल्शन को होमोजेनाइजेशन विधि के साथ तैयार किया गया था और 3 या 15 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। ताजा तैयार और संग्रहीत इमल्शन को उसी दिन C57BL / 6J चूहों (n = 5 प्रति समूह) में इंजेक्ट किया गया था। चूहों को उसी दिन और 24 घंटे बाद 80 एनजी पर्टुसिस टॉक्सिन प्राप्त हुआ, और 0-6 से नैदानिक स्कोर का उपयोग करके बीमारी के संकेतों के लिए स्कोर किया गया। (बी) होमोजेनाइजेशन विधि का उपयोग करके तैयार इमल्शन के साथ ईएई का लगातार प्रेरण। सीएफए युक्त इमल्शन और एमओजी35-55 पेप्टाइड / माउस के 50 μg को अलग-अलग समय बिंदुओं पर तैयार किया गया था और C57BL / 6J चूहों (n = 5 प्रति समूह) में इंजेक्ट किया गया था। चूहों को उसी दिन और 24 घंटे बाद 80 एनजी पर्टुसिस टॉक्सिन प्राप्त हुआ, और बीमारी के संकेतों के लिए स्कोर किया गया। इस आंकड़े को अनुमति के साथ टॉपिंग एट अल6 से पुन: उपयोग किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक फ़ाइल 1: इमल्शन तैयारी के लिए प्रत्येक अभिकर्मक (एमओजी35-55 पेप्टाइड, पीबीएस, सीएफए और आईएफए) की मात्रा की गणना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
पानी में तेल इमल्शन, जैसे एंटीजन / फ्रायंड के सहायक, ईएई17 को प्रेरित करने के लिए आधी सदी से अधिक समय से उपयोग किया गया है। वर्तमान में एंटीजन इमल्शन तैयार करने के लिए कोई मानकीकृत विधि नहीं है जो मानव प्रभाव से स्वतंत्र है। सिरिंज का उपयोग करके मैनुअल मिश्रण अधिकांश प्रयोगशालाओं के लिए मानक है, हालांकि यह विधि समय लेने वाली है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर सामग्री का अत्यधिक नुकसान होता है, और इसे तैयार करने वाले वैज्ञानिक के आधार पर गुणवत्ता भिन्न होती है।
इस पांडुलिपि में प्रस्तुत विधि एंटीजन / सीएफए इमल्शन तैयार करने के लिए एक मानक हिलाने वाली होमोजेनाइजेशन मशीन का उपयोग करती है। इसके अलावा, यहां उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मकों को लंबे समय तक एलिकोट और संग्रहीत किया जा सकता है, जिससे इमल्शन तैयार करना सुविधाजनक और तेज़ हो जाता है। 80 चूहों के लिए इमल्शन तैयार करने का कुल समय लगभग 30 मिनट है। यह अन्य प्रकाशित विधियों के विपरीत है, जिन्हें एमओजी 35-55 इमल्शन 16,18 तैयार करने के लिए1-1.5 घंटे की आवश्यकता होती है। अन्य मैनुअल विधियां, जैसे कि एक सिरिंज विधि, अक्सर सिरिंज5 के भीतर हवा के बुलबुले की शुरूआत से जुड़ी होती हैं। यहां प्रस्तुत विधि को डिजाइन किया गया है ताकि इमल्शन को उनके पीछे के छोर से सिरिंज में धकेल दिया जाए, जो हवा के बुलबुले की शुरूआत को समाप्त करता है और सामग्री के नुकसान को कम करता है।
लगातार परिणाम और इमल्शन की न्यूनतम बर्बादी सुनिश्चित करने के लिए, हिलाने वाली होमोजेनाइजेशन विधि में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिनके लिए विशिष्ट ध्यान देने की आवश्यकता होती है। प्रयोग शुरू करने से पहले और होमोजेनाइजेशन चरण के बाद ट्यूब और अभिकर्मकों को बर्फ पर रखा जाना चाहिए। पीबीएस और एंटीजन को पहले ट्यूब में जोड़ा जाना चाहिए, उसके बाद सहायक (सीएफए / आईएफए), ताकि तेल सहायक के साथ मिश्रण करते समय एंटीजन की उच्च स्थानीय सांद्रता से बचा जा सके। लीक से बचने के लिए ढक्कन को कुछ बार खोलकर और बंद करके मजबूती से कसा जाना चाहिए। इसके अलावा, इमल्शन को बर्बाद करने से बचने के लिए सिरिंज को पूरी तरह से इमल्शन से नहीं भरा जाना चाहिए, केवल सिरिंज-बैरल पर 0.15 एमएल निशान तक। प्लंजर को दोनों हाथों का उपयोग करके सिरिंज में बहुत सावधानी से डाला जाना चाहिए। सभी सिरिंज इमल्शन से भर जाने के बाद, सिरिंज को कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है यदि उन्हें उसी दिन उपयोग किया जाना है; अन्यथा, उन्हें उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।
हिलाने वाली होमोजेनाइजेशन विधि द्वारा तैयार एंटीजन / सीएफए इमल्शन सिरिंज विधि के साथ तैयार किए गए लोगों की तुलना में कम दृढ़ दिखाई दे सकते हैं। एक अतिरिक्त झटका चरण जोड़ा जा सकता है (प्रोटोकॉल में चरण 2.5 देखें), जो इमल्शन को मोटा कर सकता है। हालांकि, इमल्शन जो "ड्रॉप टेस्ट" और चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप परीक्षा पास करते हैं, इमल्शन की भौतिक स्थिति की परवाह किए बिना ईएई को प्रेरित करते हैं।
एक हिलने वाली होमोजेनाइजेशन मशीन में आवश्यक प्रारंभिक निवेश एक सीमा है। हालांकि, यहां वर्णित तैयारी के कदम इमल्शन और एंटीजन की न्यूनतम बर्बादी सुनिश्चित करते हैं, जो अक्सर खरीदने के लिए महंगा होता है या तैयार करने में लंबा समय लगता है। इसलिए, लंबे समय में, यह विधि उपयोग करने के लिए सस्ता है क्योंकि यह समय और अभिकर्मकों को बचाता है। हिलाने वाली होमोजेनाइजेशन विधि में उपयोग किए जाने वाले एंटीजन और बफर इमल्शन की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं। एमओजी35-55 पेप्टाइड सीए2 + / एमजी 2 + के बिना पीबीएस में घुल जाताहै, जो लगातार छोटे समान पानी-इन-ऑयल कणों के साथ इमल्शन उत्पन्न करता है (चित्रा 2 ए)। हालांकि, सीए 2 +/ एमजी 2 + के साथ पीबीएस में घुलने वाले पेप्टाइड एंटीजन, या कई चार्ज किए गए अमीनो एसिड अवशेषों वाले पेप्टाइड्स इमल्शन उत्पन्न कर सकते हैं जो कम चिपचिपे होते हैं। क्या ऐसे इमल्शन पशु मॉडल में बीमारी को प्रेरित करने की संभावना कम हैं, इसका परीक्षण नहीं किया गया है। इस विधि की एक और सीमा यह है कि एक ट्यूब से 8 एमएल से अधिक एंटीजन / सीएफए इमल्शन तैयार नहीं किया जा सकता है। ट्यूबों को कुल मिलाकर 9.6 एमएल (पीबीएस / एंटीजन के 4.8 एमएल और सीएफए / आईएफए के 4.8 एमएल) से अधिक लोड नहीं किया जाना चाहिए, जो आठ 1 एमएल सिरिंज लोड करने के लिए पर्याप्त होगा। यद्यपि ट्यूब अधिक मात्रा धारण कर सकती है, ट्यूब में कुछ हवा मौजूद होनी चाहिए, अन्यथा सही इमल्शन उत्पन्न नहीं होगा। यदि अधिक इमल्शन की आवश्यकता है, तो इसे अतिरिक्त ट्यूबों का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है।
मौजूदा तरीकों की तुलना में, हिलाने वाले होमोजेनाइजेशन विधि के साथ इमल्शन तैयार करते समय कोई व्यक्ति-से-व्यक्ति अंतर नहीं होता है। ईएई प्रयोगों के लिए इमल्शन तैयार करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधि सिरिंज का उपयोग करती है जिन्हें हाथ से आगे और पीछे धकेल दिया जाताहै। बल, समय और तापमान को अच्छी तरह से नियंत्रित नहीं किया जा सकता है, और इसलिए सिरिंज-आधारित विधि को मानकीकृत करना मुश्किल है। पानी में तेल इमल्शन बनाने के अन्य तरीके अल्ट्रासोनिक वॉटर-बाथ सोनिक का लाभ उठाते हैं। सोनिकेशन विधि के साथ तैयार इमल्शन अन्यथा प्रतिरोधी बीएएलबी /सी चूहों में ईएई को प्रेरित करने में सक्षम हैं। वर्णित विधि मानकीकृत हो सकती है और इसलिए उपयोगी हो सकती है। हालांकि, अल्ट्रासोनिक वॉटर-बाथ और अल्ट्रासोनिक प्रोब सोनिक के साथ समस्या यह है कि हवा के बुलबुले पेश किए बिना टीकाकरण के लिए उपयोग की जाने वाली सिरिंज में ट्यूबों में इमल्शन को स्थानांतरित करना मुश्किल है। यहां प्रस्तुत विधि के लिए उपयोग किए जाने वाले ट्यूब इस समस्या को समाप्त करते हैं।
एक भंवर विधि को एक निर्धारित गति, समय और तापमान के साथ एक मानकीकृत विधि माना जा सकता है। हालांकि, 10 मिनट के लिए एमओजी / सीएफए तैयारी को भंवर करके इमल्शन तैयार करने के लिए इस विधि का परीक्षण करने के परिणामस्वरूप सी 57बीएल / 6 जे चूहों में कोई रोग प्रेरण नहीं हुआ (डेटा नहीं दिखाया गया)। फिर भी, ईएई को 45 मिनट18 के लिए भंवर द्वारा तैयार एंटीजन / सीएफए मिश्रण के साथ प्रेरित किया जा सकता है, जो इस पांडुलिपि में प्रस्तुत विधि की तुलना में बहुत लंबी प्रक्रिया होगी।
एक और तेल आधारित सहायक (सामग्री की तालिका देखें), जिसे एफडीए द्वारा मनुष्यों पर उपयोग करने के लिए अनुमोदित किया गया है, जो पानी में तेल इमल्शन का उत्पादन करता है, को कैंसर और मलेरिया केटीकों 20,21,22 के लिए एक आशाजनक सहायक के रूप में दिखाया गया है। इसलिए, यहां प्रस्तुत मानकीकृत प्रोटोकॉल को क्लिनिक में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रारंभिक प्रयोगों से पता चला है कि हिलाने वाली होमोजेनाइजेशन विधि इस एफडीए-अनुमोदित तेल के साथ इमल्शन उत्पन्न करती है जो मैनुअल सिरिंज विधि (डेटा नहीं दिखाया गया) की तुलना में बेहतर गुणवत्ता के हैं।
अंत में, यहां प्रस्तुत हिलाने वाली होमोजेनाइजेशन विधि कई लाभ प्रदान करती है, जैसे कि गुणवत्ता-नियंत्रित इमल्शन की तेजी से पीढ़ी, कई ऑटोइम्यून रोग मॉडल में उच्च प्रजनन क्षमता, और एंटीजन / सीएफए इमल्शन तैयार करने के लिए आवश्यक महंगे अभिकर्मकों की कमी। चूंकि इन पानी-इन-तेल इमल्शन को उत्पन्न करने वाले व्यक्ति-से-व्यक्ति अंतर नहीं है, इसलिए यह ऑटोइम्यून बीमारियों और चिकित्सीय टीका विकास के क्षेत्र में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य जैव चिकित्सा अनुसंधान और दवा की खोज के लिए आवश्यक इस विधि को मानकीकृत करने की संभावना प्रदान करता है।
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Disclosures
बीटीबी इमल्शन एबी ने टीकाकरण और जानवरों और मनुष्यों के लिए इमल्शन तैयार करने के लिए एक उपकरण और विधि के उपयोग के लिए एक पेटेंट आवेदन प्रस्तुत किया है (यूरोपीय पेटेंट आवेदन संख्या: EP3836884A1)। बीटीबी कंपनी के सीईओ और संस्थापक हैं, और बीटीबी इमल्शन में शेयरधारक हैं। बर्टिन-इंस्ट्रूमेंट्स दुनिया भर में इस प्रकाशन में उपयोग किए जाने वाले इमल्शन किट वितरित कर रहा है।
Acknowledgments
लेखक लुंड विश्वविद्यालय में पशु आवास इकाइयों, कैमिला ब्योर्कलोव और एग्निएस्का क्ज़ोपेक को उनके समर्थन के लिए और रिचर्ड विलियम्स, कैनेडी इंस्टीट्यूट ऑफ रुमेटोलॉजी, ऑक्सफोर्ड विश्वविद्यालय, यूके में रचनात्मक आलोचना और इस पांडुलिपि के निर्माण के लिए भाषाई समर्थन के लिए स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
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