Summary
多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発するために、マウスを自己抗原および完全なフロイントアジュバントを含む油中水型エマルジョンで免疫する。これらのエマルジョンの調製にはいくつかのプロトコルがありますが、ここでは、エマルジョン調製のための迅速で単純で標準化された均質化プロトコルを示します。
Abstract
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症(MS)と同様の免疫学的および臨床的特徴を共有しているため、より良い患者治療のための新しい薬物標的を特定するためのモデルとして広く使用されています。MSは、再発寛解型MS(RRMS)、原発性進行型MS(PPMS)、二次進行型MS(SPMS)、およびまれな進行性再発型のMS(PRMS)など、いくつかの異なる疾患経過を特徴としています。動物モデルは、これらの対照的なヒト疾患表現型のすべてを正確に模倣するわけではありませんが、MSのさまざまな臨床症状のいくつかを反映するEAEモデルがあります。例えば、C57BL/6Jマウスのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)誘導性EAEはヒトPPMSを模倣し、SJL/Jマウスのミエリンプロテオリピドタンパク質(PLP)誘導EAEはRRMSに類似しています。ミエリン塩基性タンパク質(MBP)などの他の自己抗原、および多数の異なるマウス系統もEAEの研究に使用されます。これらの自己抗原免疫EAEモデルにおいて疾患を誘導するために、油中水型エマルジョンを調製し、皮下注射する。EAEモデルの大部分は、百日咳毒素の注射も必要とします 病気が発症するために。一貫性のある再現性のあるEAE誘導のためには、抗原/アジュバントエマルジョンを製造するための試薬を調製するための詳細なプロトコルが必要です。ここで説明する方法は、標準化された方法を利用して油中水型エマルジョンを生成します。シンプルで高速で、シリンジの代わりに振とうホモジナイザーを使用して品質管理されたエマルジョンを調製します。
Introduction
免疫寛容の崩壊は、多発性硬化症(MS)などの自己免疫疾患の発生につながる可能性があります。世界中で280万人がMSとともに生活していると推定されています1。MSの正確な原因はまだほとんど不明ですが、自己反応性T細胞とB細胞の調節不全、およびTreg機能の欠陥は、疾患の病因に重要な役割を果たしています2,3。
自己免疫疾患の動物モデルは、潜在的な治療法を調査するために不可欠なツールです。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルは、MS4に関心のある研究者によってほぼ1世紀にわたって使用されてきました。初期の実験では、この病気の発生率は比較的低かった。 マイコバクテリウム と百日咳毒素を含む完全フロイントアジュバント(CFA)の導入により、マウスにおけるEAEの一貫した誘導が可能になりました4。最も重要なことは、CFAを中枢神経系(CNS)特異的抗原と混合して、EAEを誘導するための均質な油中水型エマルジョンを生成する必要があることです。現在利用可能な最も一般的なEAEモデルは、脳原性ペプチドによるマウスの能動免疫に基づいています。マウスの遺伝的背景は疾患感受性に重要な役割を果たしており、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG35-55)およびミエリンプロテオリピドタンパク質(PLP139-151)ペプチドは、それぞれC57BL/6JおよびSJLマウスにおいてEAEを誘導するために用いられている5。しかしながら、他のマウス系統およびCNS由来ペプチドも使用することができる。
CFA/ペプチドエマルジョンの品質は、能動免疫EAEモデルにおける疾患浸透率を決定する重要な要素です6。均質な油中水型エマルジョンは、水性緩衝液に溶解した脳形成ペプチドをCFAと混合することによって調製されなければならず、そうでなければ動物は疾患を発症しないであろう。CFA/ペプチドエマルジョンの調製に関する多数のプロトコルが公開されています。例としては、渦7、超音波処理8、シリンジおよび三方Tコネクタ9、または1つのシリンジのみ5の使用が含まれる。ただし、これらの方法はすべて標準化が難しく、多くの場合、長く複雑なプロトコルに関連付けられています。
上記のすべての方法と比較して、エマルジョン調製のためにここで説明する簡単な方法は、人間の違いがなく、比較的高速であるという利点を提供します。エマルジョンは、設定された速度、時間、温度で試薬を振とうするホモジナイザーによって生成され、高速で一貫した結果を保証します。この方法は、EAEモデルで疾患を誘発するだけでなく、コラーゲン誘発関節炎(CIA)や抗原誘発関節炎(AIA)などの他の自己免疫疾患モデルの研究にも使用できます6。したがって、この方法は、実験的自己免疫性神経炎(EAN)10、実験的自己免疫性甲状腺炎(EAT)11、自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)12、重症筋無力症(MG)13など、自己抗原を含む油中水型エマルジョンに依存する他の動物モデルで疾患を一貫して誘発するために使用できることが期待されます。この方法はまた、遅延型過敏症(DTH)などの一般的な免疫応答を一貫して誘導するため6、癌やマラリアワクチンの送達に使用できる可能性があります(議論を参照)。
したがって、迅速(総調製時間~30分)、単純(すべての試薬を事前に調製して保存することができる)、および標準化された(エマルジョンは振とうホモジナイザーを使用して達成される)方法が開発され、ここに提示されています。このプロトコルを使用して調製されたCFA /抗原エマルジョンは、自己免疫動物モデルで一貫して疾患を誘発します。
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Protocol
すべての動物の手順は、スウェーデン動物研究委員会の慣行に従って実行され、スウェーデンのルンドマルメにある動物倫理委員会によって承認されました(許可番号:M126-16)。
注: この方法の概略フローを 図 1 に示します。
1.材料の準備
注:すべての試薬を滅菌フードで無菌的に調製し、指定された温度で分注して保管します。試薬は、効果を失うことなく最大2年間保存できます。
- 下記のように、20 mg/mLの結核菌 を含むCFAを調製します。
- 100 mgの凍結乾燥 結核菌 H37RA(材料 表を参照)と5つの3.2 mmスチールビーズを7 mLチューブ( 材料表を参照)に加えます。チューブをホモジナイザー( 材料表を参照)で最高速度設定(5,000 rpm)で60秒間振とうします。
- 5 mLの不完全なフロイントアジュバント(IFA)をチューブに加え、最高速度で60秒間再び振とうします。IFA(現在はCFAと名付けられています)で均質化された 結核菌 のスラリーを、ビーズを残してピペット付きの新しいチューブに移し、使用するまで4°Cで保存します。
- MOG35-55 ペプチドの凍結乾燥粉末( 材料表参照)に超純水を加え、最終ペプチド濃度10mg/mLを得た。溶液を0.2μmのフィルターに通して滅菌します。60 μLのアリコートを調製し、使用するまで-20°Cで保存します。
注:この実験に使用したMOG35-55 ペプチドは、ImmunoGrade純度(~70%)であり、TFA切断され、水に容易に溶解し、C末端アミド(-NH2)を含むため、 生体内 安定性が向上します14。ペプチドアリコートは、2回以上解凍および再凍結することはなく、使用するまで-20°Cで保存した。 - 100 mLの百日咳毒素バッファーを調製する:2.9 gのNaClを80 mLの1x Ca2+/Mg2+ 遊離PBSに溶解し、100 μLの10%Triton X-100を加えます。PBSで容量を100 mLに調整し、0.2 μmのフィルターに通して溶液を滅菌します。10 mLアリコートを準備し、使用するまで4°Cで保存します。
2. CFA/ペプチドエマルジョンの調製
- 予防接種に必要なエマルジョンの量を計算します。この標準プロトコルでは、各マウスは、フロイントアジュバント(CFA)に分散した50μgのMOG35-55 ペプチドおよび300μgの 結核菌 を投与されます。エマルジョンの調製に必要な各試薬(MOG35-55 ペプチド、PBS、CFA、およびIFA)の量は、 補足ファイル1を使用して計算できます。エマルジョンのわずかな損失を補うために、全試薬の追加の20%が計算に含まれます。
注:この研究で使用された市販のエマルジョンキット( 材料表を参照)は、滅菌ポーチ内のチューブ、スクリューキャップ、およびプランジャーで構成されています。エマルジョンキットの各チューブは最大9.6 mLを保持し、40匹のマウス(または1匹あたり100 μLのエマルジョンを使用する場合は80匹)の免疫に十分な8 x 1 mLシリンジを準備することができます。 - スクリューキャップ付きチューブ(市販のエマルジョンキットから)と使用する試薬を氷上に置きます。
- ステップ2.1で計算された容量に次の順序でエマルジョン成分を追加します:PBS、次にペプチド、次にCFAの 結核菌 、最後にIFAです。
- キャップを数回締めたり緩めたりして、キャップ付きのチューブをしっかりと閉じます。チューブを手で5〜10秒間激しく振って、試薬を事前に混合します。
- チューブを振とうホモジナイザーに入れ、ロッドで固定します。速度を最高設定に設定し、時間を60秒に設定します。実行が終了したら、チューブを氷の上に3分間置きます。同じ設定でさらに1〜2回実行を繰り返します。
- チューブを300 x g で1分間遠心分離して、閉じ込められた空気を取り除き、エマルジョンを圧縮します。
- チューブからキャップを外し、プランジャーをチューブに挿入し、エマルジョンの上部に達するまでゆっくりと押し下げます。チューブの下部にあるスナップオフクロージャーをねじって取り外します。
- 注射器からプランジャーを取り外します(1 mL; 材料の表を参照)。注射器に針(好ましくは25〜27G)を加える。
- 注射器の後端をチューブの下部にある専用ロックに取り付け、短いひねりでロックします。
- プランジャーを軽く押して、エマルジョンをチューブから注射シリンジに移します。エマルジョンが注射器の0.15mL目盛りに達したら停止します。.
- 注射器をチューブから分離し、空気が注射器に入らないように注意しながら、プランジャーを慎重に挿入します。エマルジョンが針から出てくるまでプランジャーを押します。
注:この時点で、エマルジョンの一部を品質管理に使用できます(ステップ3を参照)。 - チューブ内に存在する残りのエマルジョンについて、手順2.8〜2.11を繰り返します。
注:高価なCFA/抗原エマルジョンの無駄を最小限に抑えるために、1mLシリンジを使用する必要があります。チューブの底部にある専用ロックに適合する他のシリンジを使用してもよい。しかしながら、より大きな体積のエマルジョンを調製する必要があるかもしれない。CFA/MOG35-55 ペプチドエマルジョンは、EAE誘導能を失うことなく、4°Cで最大15週間保存できます。
3.エマルジョンの品質管理
- 落下試験:20mLの冷水で満たされた滅菌済みの50mLコニカルチューブに少量のエマルジョンを追加します。チューブを閉じて、手で数秒間振ってください。小さな明確な液滴の出現は、油中水型エマルジョンの形成を裏付けています。
- 位相差顕微鏡を用いてエマルションを調べる。
- 油中水粒子のサイズを分析するには、顕微鏡スライドにエマルジョンの小さな滴(2〜3 μL)を加え、カバースリップで塗りつけてから、円を描くように強く押してエマルジョンを平らにします。
- 塗抹されたエマルジョンを400倍の倍率の位相差顕微鏡( 材料表を参照)で調べ、エマルジョンの単層を有するフィールドに焦点を合わせる。小さな均一な灰色/白の粒子が見えることを確認します(図2A)。
- レーザー回折を用いてエマルジョン粒子径を分析します。
注:レーザー回折は、レーザービームを使用して粒度分布を測定します。これは、エマルジョンの究極の品質管理テストです。ここで記載した方法を用いた粒度分布の代表的な結果を 図2B に示す(詳細な説明については、Topping et al.6を参照されたい)。それにもかかわらず、落下試験および顕微鏡検査は、満足のいくエマルジョンが形成されたかどうかを検証するのに十分である。- 粒度分析計(材料表を参照)では、分散剤の赤色レーザーと青色レーザーの両方の屈折率を1.456に設定し、サンプルの屈折率を1.33に設定します(材料表を参照)。屈折率の吸光度を0.02に設定します。
- ペプチドエマルジョンを含むシリンジから軽質鉱物油を含む分散ユニットに1滴加えます。エマルジョンの分散後すぐにデータ収集を開始します。
注:粒度分布の推定には、汎用モデルを適用し、球状粒子を想定しました。
4. C57BL6/JマウスにおけるMOG 35-55 ペプチドエマルジョンを用いたEAE誘導
注:すべての実験において、5匹の8〜12週齢の雌C57BL6 / Jマウスが使用されました。
- 免疫の前に、2.5%気化したイソフルランを用いてマウスを麻酔し、しっかりとつま先ピンチを用いて確認する。
- 1 mLシリンジを使用して各マウスを後腹の右側と左側の2つの異なる部位に、50 μgのMOG35-55 ペプチドを1:1(v / v)比のペプチド/ CFAで含む200 μLのエマルジョンを皮下注射します。
- エマルジョンによる免疫の少なくとも1.5時間後、および24時間後に、腹腔内注射(左側に100 μL、右側に100 μL)を介して、各マウスに200 μLの百日咳毒素中の百日咳菌菌の合計80 ngを投与します。
注:百日咳毒素による腹腔内注射の正確な局在化は、排液リンパ節15におけるT細胞の活性化に不可欠であることが示されている。 - オプション:ステップ4.2を繰り返して、7日目(一部のプロトコル16で使用されているように)にMOG35-55ペプチドを再度注入します。
注意: 最も重要なことは、MOG / CFAまたは百日咳毒素を含む予防接種に使用される注射器と針がバイオハザードバッグ/容器に適切に廃棄されていることを確認することです。 - 前述のように0〜6のスケールを使用して、臨床スコアを毎日評価します6。
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Representative Results
CFA/MOGエマルジョンを調製するための迅速でシンプルで標準化されたプロトコルを 図1に示します。この方法は、最近、他の場所6に記載されている。CFA/MOGエマルジョンは、従来のシリンジ法やボルテックス法などの他の方法で調製することもできます。これらの方法は、エマルジョンの品質を評価することによってここで比較されました。すべての方法で油中水型エマルジョンが生成されました。これらのエマルジョンの均質性と品質は、スライドガラス上に小さな滴を加え、続いて位相差顕微鏡で観察することによって評価されました。振とう均質化法で製造されたエマルジョンは、油中水型エマルジョンの小さな液滴を表す灰色/白豆形の粒子を示しました。対照的に、シリンジ法を使用して生成されたエマルジョン液滴は、より大きく、より白色であった。ボルテックス法では、エマルションに閉じ込められた気泡に対応する大きな灰色/黒色の粒子が観察されました(図2A)。
油中水型エマルジョンの長期安定性をテストするために、レーザー回折式粒度分析計を使用して経時的な粒度分布の変化を測定できます。ここで説明した標準化されたプロトコルで調製されたエマルジョンは、6週間の期間にわたって粒子サイズの変化を示さなかった(図2B)。したがって、MOG35-55 ペプチドを含むエマルジョンが4°Cで長期間保存され、それでも疾患を誘発する可能性が試験された。CFA/MOG35-55 ペプチドを含むエマルジョンをこの方法で調製し、直ちに使用するか、4°Cで3週間または15週間保存しました(図3A)。マウスに50μgのMOG35-55 ペプチドを注射し、プロトコルに記載されている疾患の臨床徴候についてスコアを付けた。驚くべきことに、新鮮な、3週齢、および15週齢のエマルジョンは、実験を通して試験した全ての動物において、同様のEAE疾患を誘発した(図3A)。したがって、これらの結果は、振とうホモジナイズ法を用いて調製されたMOG35-55 ペプチドを含むエマルジョンは、少なくとも15週間保存することができ、それでも新たに調製されたエマルジョンで達成されたものと同等の疾患スコアでEAEを誘導することが明らかになった。
実験のセットアップを簡素化および迅速化し、試薬のロット間差を回避するために、必要なすべての成分を事前に準備し、分注し、適切な温度で保存しました。その後、6ヶ月間にわたって5回の実験を行った。C57BL6/Jマウスに、免疫当日に調製したMOG/CFA乳剤をエマルジョンキットを用いて免疫し、臨床症状を評価した。マウスはすべての実験で同様の疾患パターンを発症し(図3B)、ここに提示されたホモジナイズ法が一貫した再現性のある方法でEAEを誘導するエマルジョンを生成したことが明らかになりました。
すべての試薬を取り出し、それらを追加し、チューブを3回振とうし、注射器にエマルジョンをロードして免疫の準備ができるまでの合計準備時間は、30分以内で完了します。さらに、余分なエマルジョンの20%しか調製する必要がありません。これは、準備時間が最大1.5〜2時間であり、免疫化に十分な材料を確保するために50%〜100%の余分なエマルジョンを調製する必要がある他のプロトコルとはまったく対照的です16。
図1:市販のエマルジョンキットを用いたエマルジョン調製のプロセスの概略図。この図は、Topping et al6から許可を得て再利用されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:異なる方法を用いて製造されたエマルジョンの特性評価 。 (A)標準的な均質化法、従来のシリンジ法、ボルテックス法の3つの異なる調製法の代表的な画像。少量のエマルジョンをスライドガラス上に置き、位相差顕微鏡(400倍)で観察した。スケールバー= 50μm。>15実験からの各方法の代表的な調製物が示されている。平均D[4,3](体積加重平均)を粒度分析計で測定したところ、振とう均質化法では0.7μm、シリンジ法では1.4μm、ボルテックス法では5.4μmであった。(b)エマルションの経時安定性は、粒度分析装置を用いて測定した。CFA/PBSのエマルジョンを振とうホモジナイザーとエマルジョンキットで調製し、レーザー回折を用いて粒子径を決定しました。1つのサンプルを直ちに分析し、次いでエマルジョンを4°Cで保存した。 これらのサンプルは、調製後1、2、4、および6週間で分析されました。すべてのサンプルの平均D [4, 3]体積加重平均は0.73 μm±0.03 μm(SD)でした。この図は、Topping et al6 から許可を得て再利用されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:市販のエマルジョンキットを使用してMOG35-55 ペプチド/ CFA製剤で免疫されたマウスにおけるEAE誘導。 (a)保存されたエマルションのEAE誘導。CFAおよび50 μgのMOG35-55 ペプチド/マウスを含むエマルジョンをホモジナイズ法で調製し、4°Cで3週間または15週間保存しました。新たに調製したエマルジョンと保存したエマルジョンを同日にC57BL/6Jマウスに注射した(n=5/群)。マウスは、同じ日と24時間後に80 ngの百日咳毒素を受け取り、0〜6の臨床スコアを使用して疾患の兆候についてスコアリングされました。(B)均質化法を用いて調製されたエマルションとのEAEの一貫した誘導。CFAおよび50μgのMOG35-55 ペプチド/マウスを含むエマルジョンを異なる時点で調製し、C57BL/6Jマウスに注射した(グループあたりn = 5)。マウスは、同じ日と24時間後に80 ngの百日咳毒素を投与され、病気の兆候についてスコアが付けられました。この図は、Topping et al6 から許可を得て再利用されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:エマルジョン調製のための各試薬(MOG35-55ペプチド、PBS、CFA、およびIFA)の量の計算。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
抗原/フロイントアジュバントなどの油中水型エマルジョンは、EAE17を誘導するために半世紀以上にわたって使用されてきました。現在、ヒトの影響に依存しない抗原乳剤を調製するための標準化された方法はありません。シリンジを使用した手動混合はほとんどの研究室で標準的ですが、この方法は時間がかかり、多くの場合、材料の過度の損失をもたらし、品質は準備する科学者によって異なります。
この原稿で提示された方法は、標準的な振とうホモジナイズマシンを使用して抗原/ CFAエマルジョンを調製します。さらに、ここで使用されるすべての試薬は、分注して長期間保存できるため、エマルジョンの調製が便利で迅速になります。最大80匹のマウスのエマルジョンを調製するための合計時間は約30分です。これは、MOG35〜55エマルジョンを調製するために1〜1.5時間を必要とする他の公表された方法とはまったく対照的である16,18。1つのシリンジ法などの他の手動方法は、シリンジ5内の気泡の導入に関連することが多い。ここで提示する方法は、エマルジョンがそれらの後端からシリンジに押し込まれるように設計されており、気泡の導入を排除し、材料の損失を最小限に抑える。
一貫した結果とエマルジョンの無駄を最小限に抑えるために、振とう均質化法には特に注意が必要ないくつかの重要なステップがあります。チューブと試薬は、実験を開始する前とホモジナイズステップの後に氷上に置く必要があります。オイルアジュバントと混合するときに抗原の局所濃度が高くならないように、最初にPBSと抗原をチューブに追加し、次にアジュバント(CFA / IFA)を追加する必要があります。漏れを防ぐために、蓋を数回開閉してしっかりと締める必要があります。さらに、シリンジはエマルジョンを完全に充填するのではなく、エマルジョンを無駄にしないようにシリンジバレルの0.15 mLマークまで充填する必要があります。プランジャーは、両手を使用してシリンジに非常に慎重に挿入する必要があります。すべてのシリンジにエマルジョンを充填した後、シリンジを同じ日に使用する場合は室温で保存できます。それ以外の場合は、使用するまで4°Cで保管する必要があります。
振とうホモジナイズ法で調製された抗原/CFAエマルジョンは、シリンジ法で調製されたものと比較して硬く見えない場合があります。追加の振とうステップを追加することができ(プロトコルのステップ2.5を参照)、エマルジョンを増粘させる可能性があります。しかし、「落下試験」や位相差顕微鏡検査に合格したエマルションは、エマルションの物理的状態に関係なくEAEを誘導します。
振とう均質化機に必要な初期投資は制限です。しかしながら、ここで説明する調製ステップは、エマルジョンおよび抗原の無駄を最小限に抑え、これはしばしば購入に費用がかかるか、または調製に長い時間がかかる。したがって、長期的には、この方法は時間と試薬を節約するため、使用する方が安価です。振とうホモジナイズ法で使用される抗原および緩衝液は、エマルジョンの品質に影響を与える可能性があります。CA2+/Mg 2+を含まないPBSに溶解したMOG35-55ペプチドは、小さく均一な油中水粒子を有するエマルジョンを一貫して生成した(図2A)。ただし、Ca2+/Mg2+を含むPBSに溶解したペプチド抗原、または多くの荷電アミノ酸残基を含むペプチドは、粘性の低いエマルジョンを生成する可能性があります。そのようなエマルジョンが動物モデルにおいて疾患を誘発する可能性が低いかどうかは試験されていない。この方法の別の制限は、1本のチューブから8mL以下の抗原/CFAエマルジョンを調製できることです。チューブには、合計9.6 mL(4.8 mLのPBS /抗原と4.8 mLのCFA / IFA)を超えてロードしないでください。チューブはより大きな体積を保持できますが、チューブ内にいくらかの空気が存在していなければならず、そうでなければ完全なエマルジョンは生成されません。より多くのエマルジョンが必要な場合は、追加のチューブを使用して調製できます。
既存の方法と比較して、振とう均質化法でエマルションを調製する場合、人差はありません。EAE実験用のエマルジョンを調製するために最も一般的に使用される方法は、手で前後に押し出される注射器を利用する19。力、時間、温度を十分に制御できないため、シリンジベースの方法を標準化することは困難です。油中水型エマルジョンを作るための他の方法は、超音波水浴超音波処理器を利用する。超音波処理法で調製されたエマルジョンは、そうでなければ耐性BALB / cマウス8でEAEを誘導することができます。記載された方法は標準化することができ、したがって有用である。しかしながら、超音波水浴および超音波プローブ超音波処理器の問題は、気泡を導入せずに免疫に使用される注射器にチューブ内のエマルジョンを移すことが困難であることである。ここで紹介する方法に使用されるチューブは、この問題を排除します。
ボルテックス法は、速度、時間、温度が設定された標準化された方法と見なすことができます。しかし、この方法をテストして、MOG / CFA調製物を10分間ボルテックスすることによってエマルジョンを調製したところ、C57BL / 6Jマウスでは疾患誘発は見られませんでした(データ示さず)。それにもかかわらず、EAEは、45分間ボルテックスによって調製された抗原/CFA混合物で誘導することができ18、これはこの原稿で提示された方法と比較してはるかに長い手順になります。
ヒトに使用することがFDAによって承認された別の油性アジュバント(材料表を参照)は、油中水型エマルジョンを生成し、癌およびマラリアワクチンの有望なアジュバントであることが示されている20、21、22。したがって、ここで提示された標準化されたプロトコルは、診療所での使用に適合させることができる。予備実験により、振とう均質化法は、手動シリンジ法と比較してより高品質のこのFDA承認オイルを含むエマルジョンを生成することが明らかになりました(データは示されていません)。
結論として、ここで紹介した振とうホモジナイズ法は、品質管理されたエマルジョンの迅速な生成、多くの自己免疫疾患モデルでの高い再現性、抗原/CFAエマルジョンの調製に必要な高価な試薬の削減など、多くの利点を提供します。これらの油中水型エマルジョンの生成には人差がないため、自己免疫疾患や治療用ワクチン開発の分野で再現性のある生物医学研究や創薬に必要なこの方法を標準化する可能性を提供します。
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Disclosures
BTB Emulsions ABは、動物およびヒトの免疫化ならびにエマルジョンを調製するための装置および方法の使用に関する特許出願を提出した(欧州特許出願番号:EP3836884A1)。BTBは同社のCEO兼創設者であり、BTBエマルジョンの株主です。ベルタン・インスツルメンツは、この出版物で使用されているエマルジョンキットを世界中に配布しています。
Acknowledgments
著者は、ルンド大学の動物飼育ユニットであるカミラ・ビョルクレフとアグニエシュカ・チョペックの支援、および英国オックスフォード大学ケネディリウマチ研究所のリチャード・ウィリアムズがこの原稿の作成について建設的な批判と言語的支援を行ったことに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
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