Summary
Para induzir encefalomielite autoimune experimental, um modelo animal de esclerose múltipla, os ratos são imunizados com uma emulsão de água em óleo contendo um autoantígeno e adjuvante completo de Freund. Embora existam vários protocolos para a preparação dessas emulsões, um protocolo de homogeneização rápido, simples e padronizado para a preparação de emulsões é apresentado aqui.
Abstract
A encefalomielite autoimune experimental (EAE) compartilha características imunológicas e clínicas semelhantes com a esclerose múltipla (EM) e, portanto, é amplamente utilizada como modelo para identificar novos alvos de medicamentos para um melhor tratamento do paciente. A EM é caracterizada por vários cursos diferentes da doença: EM remitente-recorrente (EMRR), EM progressiva primária (EMPP), EM progressiva secundária (EMSP) e uma forma rara de EM progressiva-recidivante (EMPR). Embora os modelos animais não imitem com precisão todos esses fenótipos contrastantes de doenças humanas, existem modelos EAE que refletem algumas das diferentes manifestações clínicas da EM. Por exemplo, o EAE induzido por glicoproteína oligodendrócitos de mielina (MOG) em camundongos C57BL/6J imita PPMS humanos, enquanto o EAE induzido por proteína proteolipídica (PLP) de mielina em camundongos SJL/J se assemelha ao RRMS. Outros autoantígenos, como a proteína básica de mielina (MBP) e várias cepas diferentes de camundongos também são usados para estudar EAE. Para induzir a doença nesses modelos EAE de imunização de autoantígenos, uma emulsão de água em óleo é preparada e injetada por via subcutânea. A maioria dos modelos EAE também requer uma injeção de toxina pertussis para que a doença se desenvolva. Para uma indução consistente e reprodutível de EAE, é necessário um protocolo detalhado para preparar os reagentes para produzir emulsões de antígeno/adjuvante. O método descrito aqui aproveita um método padronizado para gerar emulsões de água em óleo. É simples e rápido e usa um homogeneizador de agitação em vez de seringas para preparar emulsões de qualidade controlada.
Introduction
Uma quebra da tolerância imunológica pode resultar na geração de distúrbios autoimunes, como a esclerose múltipla (EM). Estima-se que 2,8 milhões de pessoas vivam com EM em todo o mundo1. Embora a causa exata da SM ainda seja amplamente desconhecida, a desregulação das células T e B auto-reativas, bem como defeitos na função Treg, desempenham papéis importantes na patogênese da doença 2,3.
Modelos animais de doenças autoimunes são ferramentas essenciais para investigar possíveis modalidades terapêuticas. O modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE) tem sido usado por quase um século por pesquisadores interessados na EM4. Nos primeiros experimentos, a incidência da doença era relativamente baixa. A introdução do adjuvante de Freund completo (CFA), contendo Mycobacterium e toxina pertussis, possibilitou a indução consistente de EAE em camundongos4. Mais importante ainda, é necessário misturar CFA com um antígeno específico do sistema nervoso central (SNC) para gerar uma emulsão homogênea de água em óleo para induzir EAE. Os modelos de EAE mais comuns atualmente disponíveis são baseados na imunização ativa de camundongos com peptídeos encefalitogênicos. O fundo genético dos camundongos desempenha um papel importante na suscetibilidade à doença, com peptídeos glicoproteína oligodendrócitos de mielina (MOG35-55) e proteína proteolipídica de mielina (PLP139-151) usados para induzir EAE em camundongos C57BL/6J e SJL, respectivamente5. No entanto, outras cepas de camundongos e peptídeos derivados do SNC também podem ser usados.
A qualidade da emulsão CFA/peptídeo é um fator crítico que determina a penetrância da doença no modelo 6 de imunização ativaEAE. Uma emulsão homogênea de água em óleo deve ser preparada misturando os peptídeos encefalitogênicos dissolvidos em tampão aquoso com CFA, caso contrário, os animais não desenvolverão a doença. Numerosos protocolos foram publicados sobre a preparação de emulsões CFA/peptídicas. Exemplos incluem o uso de um vórtice7, sonicação8, seringas e um conector T de três vias9, ou uma seringa apenas5. No entanto, todos esses métodos são difíceis de padronizar e são frequentemente associados a protocolos longos e complicados.
Em comparação com todos os métodos acima, o método simples descrito aqui para a preparação da emulsão oferece as vantagens de não ter diferenças de pessoa para pessoa e ser relativamente rápido. A emulsão é gerada por um homogeneizador agitando os reagentes com uma velocidade, tempo e temperatura definidos, garantindo resultados rápidos e consistentes. Além de induzir a doença no modelo EAE, esse método também pode ser utilizado para estudar outros modelos de doenças autoimunes, como a artrite induzida por colágeno (CIA) e a artrite induzida por antígeno (AIA)6. Portanto, espera-se que esse método possa ser utilizado para induzir consistentemente a doença em outros modelos animais que dependem de emulsões de água em óleo com autoantígenos, como neurite autoimune experimental (EAN)10, tireoidite autoimune experimental (EAT)11, uveíte autoimune (EAU)12 e miastenia gravis (MG)13. Esse método também induz respostas imunes gerais, como hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) de forma consistente6 e, portanto, poderia ser usado para administrar vacinas contra câncer e malária (ver discussão).
Assim, um método rápido (tempo total de preparação ~ 30 min), simples (todos os reagentes podem ser preparados com antecedência e armazenados) e padronizado (a emulsão é realizada usando um homogeneizador de agitação) foi desenvolvido e é apresentado aqui. As emulsões CFA/antígeno preparadas usando este protocolo induzem consistentemente a doença em modelos animais autoimunes.
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Protocol
Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as práticas do Conselho Sueco de Pesquisa Animal e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal de Lund-Malmö, Suécia (número de permissão: M126-16).
Observação : um fluxo esquemático do método é descrito na Figura 1.
1. Preparação do material
NOTA: Preparar todos os reagentes assepticamente num exaustor estéril, alíquota e conservar à temperatura indicada. Os reagentes podem ser armazenados até 2 anos sem perder o seu efeito.
- Prepare CFA contendo 20 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis conforme descrito abaixo.
- Adicionar 100 mg de M. tuberculosis H37RA liofilizado (ver Tabela de Materiais) e cinco esferas de aço de 3,2 mm a um tubo de 7 ml (ver Tabela de Materiais). Agite o tubo em um homogeneizador (consulte Tabela de materiais) por 60 s na configuração de velocidade mais alta (5.000 rpm).
- Adicione 5 mL de adjuvante de Freund (IFA) incompleto ao tubo e agite novamente por 60 s na velocidade mais alta. Transfira a pasta de M. tuberculosis homogeneizada em IFA (agora denominada CFA) para um tubo fresco com uma pipeta, deixando as contas para trás, e armazene a 4 °C até o uso.
- Adicionar água ultrapura ao pó liofilizado do péptido MOG35-55 (ver Tabela de Materiais) para obter uma concentração final de péptido de 10 mg/ml. Esterilizar a solução passando-a através de um filtro de 0,2 μm. Preparar alíquotas de 60 μL e conservar a -20 °C até à utilização.
NOTA: O peptídeo MOG35-55 utilizado para este experimento é de pureza ImmunoGrade (~70%), é clivado em TFA, dissolve-se facilmente em água e contém uma amida C-terminal (-NH2) para aumentar a estabilidade in vivo 14. As alíquotas peptídicas nunca foram descongeladas e recongeladas mais de duas vezes, sendo armazenadas a -20 °C até o uso. - Preparar 100 mL de tampão toxina pertussis: Dissolva 2,9 g de NaCl em 80 mL de PBS livre de 1x Ca 2+/Mg2+ e adicione 100 μL de Triton X-100 a 10%. Ajustar o volume para 100 ml com PBS e esterilizar a solução passando-a através de um filtro de 0,2 μm. Preparar alíquotas de 10 ml e conservar a 4 °C até à utilização.
2. Preparação de emulsões CFA/peptídicas
- Calcule a quantidade de emulsão necessária para a imunização. Neste protocolo padrão, cada camundongo recebe 50 μg de peptídeo MOG35-55 e 300 μg de M. tuberculosis dispersos no adjuvante de Freund (CFA). A quantidade de cada reagente (peptídeo MOG35-55 , PBS, CFA e IFA) necessária para a preparação das emulsões pode ser calculada usando o Arquivo Suplementar 1. Um adicional de 20% de todos os reagentes, para compensar a pequena perda de emulsão, é incluído no cálculo.
NOTA: O kit de emulsão comercial (ver Tabela de Materiais) utilizado neste estudo compreende um tubo, uma tampa de rosca e um êmbolo numa bolsa esterilizada. Cada tubo do kit de emulsão contém um máximo de 9,6 mL, tornando possível preparar seringas de 8 x 1 mL suficientes para imunizar 40 camundongos (ou 80 camundongos se usarem 100 μL de emulsão por animal). - Coloque o tubo tampado por parafuso (do kit de emulsão comercial) e os reagentes a serem usados no gelo.
- Adicione os componentes da emulsão na seguinte ordem nos volumes calculados na etapa 2.1: PBS, depois o peptídeo, depois M. tuberculosis em CFA e, finalmente, IFA.
- Feche o tubo com a tampa firme, apertando-o e soltando-o várias vezes. Agite o tubo vigorosamente por 5-10 s à mão para pré-misturar os reagentes.
- Coloque o tubo no homogeneizador de agitação e prenda-o com a haste. Defina a velocidade para a configuração mais alta e o tempo para 60 s. Quando a corrida terminar, coloque o tubo no gelo por 3 min. Repita a execução mais uma ou duas vezes com as mesmas configurações.
- Centrifugar o tubo a 300 x g durante 1 min para remover o ar preso e compactar a emulsão.
- Remova a tampa do tubo, insira o êmbolo no tubo e empurre-o lentamente para baixo até atingir o topo da emulsão. Remova o fecho de encaixe na parte inferior do tubo torcendo-o.
- Remova o êmbolo de uma seringa de injeção (1 ml; ver Tabela de Materiais). Adicione uma agulha (de preferência 25-27 G) à seringa de injeção.
- Ligue a extremidade traseira da seringa de injeção à fechadura dedicada na parte inferior do tubo e bloqueie-a com uma torção curta.
- Transfira a emulsão do tubo para a seringa de injeção, empurrando o êmbolo suavemente. Pare quando a emulsão atingir a graduação de 0,15 ml da seringa de injeção.
- Separe a seringa de injeção do tubo e insira o êmbolo com cuidado, tomando cuidado para que nenhum ar entre na seringa. Empurre o êmbolo até que a emulsão saia da agulha.
NOTA: Neste ponto, parte da emulsão pode ser usada para controle de qualidade (consulte a etapa 3). - Repita os passos 2.8-2.11 para o resto da emulsão presente no tubo.
NOTA: Para minimizar o desperdício de emulsões caras de CFA/antígeno, seringas de 1 mL devem ser usadas. Podem ser utilizadas outras seringas que se ajustem à fechadura dedicada no fundo do tubo; no entanto, um volume maior de emulsão pode precisar ser preparado. A emulsão peptídica CFA/MOG35-55 pode ser armazenada a 4 °C por até 15 semanas sem perder sua capacidade indutora de EAE.
3. Controle de qualidade da emulsão
- Drop-test: Adicione uma pequena gota da emulsão em um tubo cônico estéril de 50 mL preenchido com 20 mL de água fria. Feche o tubo e agite-o com a mão por alguns segundos. O aparecimento de minúsculas gotículas distintas confirma a formação de uma emulsão de água em óleo.
- Examine a emulsão usando microscopia de contraste de fase.
- Para analisar o tamanho das partículas de água em óleo, adicione uma pequena gota (2-3 μL) da emulsão a uma lâmina de microscópio, espalhe-a com um deslizamento de tampa e, em seguida, empurre com força em um movimento circular para achatar a emulsão.
- Examine a emulsão manchada sob um microscópio de contraste de fase (consulte Tabela de materiais) com ampliação de 400x e concentre-se em um campo com uma monocamada da emulsão. Certifique-se de que pequenas partículas cinza/brancas uniformes estejam visíveis (Figura 2A).
- Analise o tamanho da partícula da emulsão usando difração a laser.
NOTA: A difração a laser mede as distribuições de tamanho de partícula usando um feixe de laser. Este é o melhor teste de controle de qualidade para emulsões. Um resultado representativo das distribuições de tamanho de partícula usando o método descrito aqui é mostrado na Figura 2B (para uma descrição detalhada, ver Topping et al.6). No entanto, o teste de gota e o exame microscópio são suficientes para validar se uma emulsão satisfatória foi formada.- Defina os índices de refração para os lasers vermelho e azul para o dispersante (ver Tabela de Materiais) para 1,456 e para a amostra para 1,33 no analisador de tamanho de partícula (ver Tabela de Materiais). Defina a absorvância do índice de refração para 0,02.
- Adicionar uma gota da seringa que contém a emulsão peptídica à unidade de dispersão que contém óleo mineral leve. Inicie a aquisição de dados instantaneamente após a dispersão da emulsão.
NOTA: Um modelo de uso geral foi aplicado, e partículas esféricas foram assumidas, para a estimativa da distribuição do tamanho das partículas.
4. Indução de EAE usando a emulsão peptídica MOG 35-55 em camundongos C57BL6/J
NOTA: Em todos os experimentos, cinco camundongos C57BL6/J fêmeas de 8-12 semanas de idade foram utilizados.
- Antes da imunização, anestesiar os ratos usando isoflurano vaporizado a 2,5% e confirmar usando uma pitada firme do dedo do pé.
- Injetar cada rato por via subcutânea utilizando seringas de 1 ml em dois locais diferentes, nos lados direito e esquerdo do flanco posterior com 200 μL de emulsão contendo 50 μg de péptido MOG35-55 numa proporção de 1:1 (v/v) de péptido/CFA.
- Pelo menos 1,5 h após a imunização com a emulsão, e depois novamente após 24 h, administrar um total de 80 ng de toxina Bordetella pertussis em 200 μL de tampão de toxina pertussis a cada rato, através de injeções intraperitoneais (100 μL à esquerda e 100 μL no local direito da barriga).
NOTA: A localização precisa da injeção intraperitoneal com toxina pertussis tem se mostrado essencial para a ativação de células T no linfonodo drenante15. - Opcional: Injete o peptídeo MOG35-55 novamente no dia 7 (como usado em alguns protocolos16) repetindo a etapa 4.2.
NOTA: Mais importante ainda, certifique-se de que as seringas e agulhas usadas para imunização contendo MOG / CFA ou toxina pertussis sejam adequadamente descartadas em sacos/recipientes de risco biológico. - Avaliar o escore clínico diariamente, utilizando uma escala de 0 a 6 conforme descrito anteriormente6.
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Representative Results
O protocolo rápido, simples e padronizado para a preparação de emulsões CFA/MOG está representado na Figura 1. Este método foi recentemente descrito em outro lugar6. As emulsões CFA/MOG também podem ser preparadas com outros métodos, como o método tradicional da seringa ou por vórtice. Esses métodos foram comparados aqui avaliando a qualidade das emulsões. Todos os métodos produziram emulsões de água em óleo; a homogeneidade e a qualidade dessas emulsões foram avaliadas pela adição de uma pequena gota em uma lâmina de vidro, seguida de observação sob um microscópio de contraste de fase. As emulsões produzidas pelo método de homogeneização por agitação exibiam partículas em forma de feijão cinza/branco, representando minúsculas gotículas de emulsões de água em óleo. Em contraste, as gotículas de emulsão produzidas pelo método da seringa eram maiores e mais brancas. No método do vórtice, foram observadas grandes partículas cinza/pretas, correspondendo a bolhas de ar presas na emulsão (Figura 2A).
Para testar a estabilidade a longo prazo de emulsões de água em óleo, as mudanças na distribuição do tamanho das partículas ao longo do tempo podem ser medidas usando um analisador de tamanho de partícula de difração a laser. As emulsões preparadas com o protocolo padronizado aqui descrito não apresentaram alteração no tamanho das partículas ao longo de um período de 6 semanas (Figura 2B). Portanto, a possibilidade de que emulsões contendo o peptídeo MOG35-55 possam ser armazenadas a 4 °C por um longo período de tempo e ainda induzir a doença foi testada. Emulsões contendo o peptídeo CFA/MOG35-55 foram preparadas com este método e utilizadas imediatamente ou armazenadas a 4 °C por 3 ou 15 semanas (Figura 3A). Os ratos foram injetados com 50 μg de peptídeo MOG35-55 e pontuados para sinais clínicos da doença, conforme descrito no protocolo. Notavelmente, as emulsões frescas, de 3 semanas de idade e de 15 semanas de idade induziram doença EAE semelhante em todos os animais testados ao longo do experimento (Figura 3A). Assim, esses resultados revelaram que emulsões contendo peptídeos MOG35-55 preparados usando o método de homogeneização de agitação podem ser armazenadas por pelo menos 15 semanas e ainda induzir EAE com escores de doença comparáveis aos obtidos com emulsões recém-preparadas.
Para simplificar e acelerar a configuração dos experimentos e evitar a diferença de reagentes lote a lote, todos os componentes necessários foram preparados, alíquotados, e armazenados na temperatura apropriada com antecedência. Em seguida, cinco experimentos foram realizados durante um período de 6 meses. Os camundongos C57BL6/J foram imunizados com as emulsões MOG/CFA preparadas no dia da imunização, utilizando kits de emulsão, e avaliados quanto aos sintomas clínicos. Os camundongos desenvolveram um padrão de doença semelhante em todos os experimentos (Figura 3B), revelando que o método de homogeneização aqui apresentado produziu emulsões que induziram EAE de maneira consistente e reprodutível.
O tempo total de preparação, desde a recuperação de todos os reagentes, adicioná-los e agitar o tubo três vezes, e carregar as seringas com a emulsão, pronto para a imunização, não leva mais de 30 min. Além disso, apenas 20% da emulsão extra deve ser preparada. Isso contrasta fortemente com outros protocolos, onde o tempo de preparação pode ser de até 1,5-2 h e 50%-100% de emulsão extra pode precisar ser preparado para garantir material suficiente para a imunização16.
Figura 1: Esquema do processo de preparação da emulsão utilizando um kit de emulsão comercial. Esta figura foi reutilizada de Topping et al6 com permissão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Caracterização de emulsões produzidas usando diferentes métodos. (A) Imagens representativas de três diferentes métodos de preparação: método de homogeneização padrão, método tradicional de seringa e método de vórtice. Uma pequena quantidade de emulsão foi colocada em uma lâmina de vidro e observada sob um microscópio de contraste de fase (400x). Barra de escala = 50 μm. Uma preparação representativa é mostrada de cada método a partir de experimentos >15. A média D [4, 3] (a média ponderada em volume) foi medida com um analisador de tamanho de partícula de 0,7 μm para o método de homogeneização de agitação, 1,4 μm para o método de seringa e 5,4 μm para o método de vórtice. (B) A estabilidade da emulsão ao longo do tempo foi medida usando o analisador de tamanho de partícula. Uma emulsão de CFA/PBS foi preparada com o homogeneizador de agitação e o kit de emulsão, e o tamanho de partícula determinado, utilizando difração a laser ao longo do tempo. Uma amostra foi analisada imediatamente e, em seguida, as emulsões foram armazenadas a 4 °C. Essas amostras foram analisadas 1, 2, 4 e 6 semanas após o preparo. A média ponderada do volume D [4, 3] para todas as amostras foi de 0,73 μm ± 0,03 μm (DP). Esta figura foi reutilizada de Topping et al6 com permissão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Indução de EAE em camundongos imunizados com uma preparação de peptídeo/CFA MOG35-55 usando um kit de emulsão comercial. A) Indução EAE da emulsão armazenada. Emulsões contendo CFA e 50 μg de peptídeo MOG35-55 /camundongo foram preparadas com o método de homogeneização e armazenadas a 4 °C por 3 ou 15 semanas. As emulsões recém-preparadas e armazenadas foram injetadas no mesmo dia em camundongos C57BL/6J (n = 5 por grupo). Os ratos receberam 80 ng de toxina pertussis no mesmo dia e 24 horas depois, e foram pontuados para sinais de doença usando escores clínicos de 0-6. (B) Indução consistente de EAE com as emulsões preparadas pelo método de homogeneização. Emulsões contendo CFA e 50 μg de peptídeo MOG35-55 /camundongo foram preparadas em diferentes momentos e injetadas em camundongos C57BL/6J (n = 5 por grupo). Os ratos receberam 80 ng de toxina pertussis no mesmo dia e 24 horas depois, e foram pontuados para sinais de doença. Esta figura foi reutilizada de Topping et al6 com permissão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo Suplementar 1: Cálculo da quantidade de cada reagente (peptídeo MOG35-55 , PBS, CFA e IFA) para preparação da emulsão. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Emulsões de água em óleo, como o antígeno/adjuvante de Freund, têm sido usadas por mais de meio século para induzir EAE17. Atualmente, não existe um método padronizado para preparar emulsões de antígenos que seja independente da influência humana. A mistura manual usando seringas é padrão para a maioria dos laboratórios, no entanto, este método é demorado, muitas vezes resulta em uma perda excessiva de material, e a qualidade difere dependendo do cientista que o prepara.
O método apresentado neste manuscrito utiliza uma máquina de homogeneização de agitação padrão para preparar as emulsões de antígeno/CFA. Além disso, todos os reagentes usados aqui podem ser aliquotados e armazenados por um longo período de tempo, tornando conveniente e rápido preparar emulsões. O tempo total para preparar emulsões para até 80 ratos é de aproximadamente 30 min. Isso contrasta fortemente com outros métodos publicados, que requerem 1-1,5 h para preparar emulsões MOG35-55 16,18. Outros métodos manuais, como o método de uma seringa, são frequentemente associados à introdução de bolhas de ar dentro das seringas5. O método aqui apresentado foi projetado para que a emulsão seja empurrada para dentro das seringas a partir de sua extremidade traseira, o que elimina a introdução de bolhas de ar e minimiza a perda de material.
Para garantir resultados consistentes e desperdício mínimo de emulsão, existem algumas etapas críticas no método de homogeneização de agitação que exigem atenção específica. O tubo e os reagentes devem ser colocados sobre gelo antes do início do experimento e após a etapa de homogeneização. O PBS e o antígeno devem ser adicionados ao tubo primeiro, seguidos pelo adjuvante (CFA/IFA), a fim de evitar altas concentrações locais de antígeno ao se misturar com o adjuvante do óleo. A tampa deve ser apertada firmemente abrindo-a e fechando-a algumas vezes para evitar vazamentos. Além disso, a seringa não deve ser preenchida com a emulsão completamente, apenas até a marca de 0,15 mL no tambor da seringa para evitar o desperdício da emulsão. O êmbolo deve ser inserido na seringa com muito cuidado, usando ambas as mãos. Depois de todas as seringas serem preenchidas com a emulsão, as seringas podem ser armazenadas à temperatura ambiente, se forem utilizadas no mesmo dia; caso contrário, devem ser armazenados a 4 °C até à sua utilização.
As emulsões de antígeno/CFA preparadas pelo método de homogeneização por agitação podem parecer menos firmes em comparação com aquelas preparadas com o método da seringa. Uma etapa de agitação adicional pode ser adicionada (consulte a etapa 2.5 no protocolo), o que pode engrossar a emulsão. No entanto, as emulsões que passam no "teste de queda" e no exame do microscópio de contraste de fase induzem EAE, independentemente do estado físico da emulsão.
O investimento inicial necessário em uma máquina de homogeneização de agitação é uma limitação. No entanto, as etapas de preparação descritas aqui garantem o mínimo de desperdício de emulsão e antígeno, que muitas vezes é caro para comprar ou leva muito tempo para ser preparado. Portanto, a longo prazo, este método é mais barato de usar, uma vez que economiza tempo e reagentes. O antígeno e o tampão usados no método de homogeneização por agitação podem afetar a qualidade da emulsão. O peptídeo MOG35-55 dissolvido em PBS sem Ca 2+/Mg 2+ gerou consistentemente emulsões com pequenas partículas uniformes de água em óleo (Figura 2A). No entanto, antígenos peptídicos dissolvidos em PBS com Ca 2+/Mg2+, ou peptídeos contendo muitos resíduos de aminoácidos carregados podem gerar emulsões menos viscosas. Se tais emulsões são menos propensas a induzir doenças em modelos animais não foi testado. Outra limitação deste método é que não mais de 8 mL de emulsão de antígeno/CFA podem ser preparados a partir de um tubo. Os tubos não devem ser carregados com mais de 9,6 mL no total (4,8 mL de PBS/antígeno e 4,8 mL de CFA/IFA), o que será suficiente para carregar oito seringas de 1 mL. Embora o tubo possa conter um volume maior, algum ar deve estar presente no tubo, caso contrário, emulsões perfeitas não serão geradas. Se mais emulsão for necessária, ela pode ser preparada usando tubos adicionais.
Em comparação com os métodos existentes, não há diferença de pessoa para pessoa ao preparar as emulsões com o método de homogeneização de agitação. O método mais comumente utilizado para preparar emulsões para experimentos de EAE utiliza seringas que são empurradas para frente e para trás à mão19. A força, o tempo e a temperatura não podem ser bem controlados e, portanto, é difícil padronizar um método baseado em seringa. Outros métodos para fazer emulsões de água em óleo aproveitam os sonicadores ultrassônicos de banho-maria. Emulsões preparadas com um método de sonicação são capazes de induzir EAE em camundongos BALB/cresistentes 8. O método descrito poderia ser padronizado e, portanto, útil. No entanto, o problema com o banho de água ultra-sônico e os sonicadores de sonda ultrassônicos é que é difícil transferir a emulsão nos tubos para seringas usadas para imunização sem introduzir bolhas de ar. Os tubos utilizados para o método aqui apresentado eliminam esse problema.
Um método de vórtice pode ser considerado um método padronizado com uma velocidade, tempo e temperatura definidos. No entanto, testar este método para preparar uma emulsão por vórtice da preparação MOG/CFA por 10 minutos não resultou em indução de doença em camundongos C57BL/6J (dados não mostrados). No entanto, o EAE pode ser induzido com uma mistura antígeno/CFA preparada por vórtice por 45 min18, o que seria um procedimento muito mais longo em comparação com o método apresentado neste manuscrito.
Outro adjuvante à base de óleo (ver Tabela de Materiais), aprovado pelo FDA para ser usado em seres humanos, que produz uma emulsão de água em óleo, mostrou-se um adjuvante promissor para vacinas contra câncer e malária20,21,22. Portanto, o protocolo padronizado aqui apresentado pode ser adaptado para uso na clínica. Experimentos preliminares revelaram que o método de homogeneização de agitação gera emulsões com este óleo aprovado pela FDA que são de melhor qualidade em comparação com o método de seringa manual (dados não mostrados).
Em conclusão, o método de homogeneização por agitação aqui apresentado fornece uma série de benefícios, como a geração mais rápida de emulsões de qualidade controlada, alta reprodutibilidade em vários modelos de doenças autoimunes e uma redução de reagentes caros necessários para preparar emulsões de antígeno/CFA. Como não há diferença de pessoa para pessoa gerando essas emulsões de água em óleo, ela oferece a possibilidade de padronizar esse método necessário para a pesquisa biomédica reprodutível e a descoberta de medicamentos na área de doenças autoimunes e desenvolvimento de vacinas terapêuticas.
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Disclosures
A BTB Emulsions AB apresentou um pedido de patente para a utilização de um dispositivo e método de preparação de emulsões para imunização e animais e seres humanos (número de pedido de patente europeia: EP3836884A1). BTB é o CEO e fundador da empresa, e um acionista da BTB Emulsions. A Bertin-Instruments está distribuindo os kits de emulsão usados nesta publicação em todo o mundo.
Acknowledgments
O autor gostaria de agradecer às unidades de alojamento de animais da Universidade de Lund, Camilla Björklöv e Agnieszka Czopek, por seu apoio, e Richard Williams, do Instituto Kennedy de Reumatologia, Universidade de Oxford, Reino Unido, pela crítica construtiva e apoio linguístico na produção deste manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
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