Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تصور Mitophagy مع الأصباغ الفلورية للميتوكوندريا والليزوزوم

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64647
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1, 1, 1,2
1Institute for Regenerative Medicine, Shanghai East Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 3Department of Pharmacy, Shanghai East Hospital, Tongji University

Summary

Mitophagy هي الآلية الأساسية لمراقبة جودة الميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن تقييم الميتوفاجي في الجسم الحي يعوقه عدم وجود مقايسات كمية موثوقة. يظهر هنا بروتوكول لمراقبة الميتوفاجي في الخلايا الحية باستخدام صبغة الميتوكوندريا الخضراء الفلورية وصبغة الليزوزوم الأحمر الفلوري.

Abstract

الميتوكوندريا ، كونها مراكز القوة في الخلية ، تلعب أدوارا مهمة في الطاقة الحيوية ، وتوليد الجذور الحرة ، وتوازن الكالسيوم ، وموت الخلايا المبرمج. Mitophagy هي الآلية الأساسية لمراقبة جودة الميتوكوندريا ويتم دراستها بشكل عام باستخدام الملاحظة المجهرية ، ولكن من الصعب إجراء فحوصات الميتوفاجي في الجسم الحي . يعد تقييم الميتوفاجي عن طريق تصوير العضيات الحية طريقة بديلة وضرورية لأبحاث الميتوكوندريا. يصف هذا البروتوكول إجراءات استخدام صبغة الميتوكوندريا الخضراء الفلورية MitoTracker Green وصبغة الليزوزوم الأحمر الفلورية LysoTracker Red في الخلايا الحية ، بما في ذلك تحميل الأصباغ ، وتصور الميتوكوندريا والليزوزوم ، والنتائج المتوقعة. كما يتم توفير خطوات مفصلة لتقييم الميتوفاجي في الخلايا الحية ، بالإضافة إلى ملاحظات فنية حول إعدادات برنامج المجهر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة الباحثين على مراقبة الميتوفاجي باستخدام الفحص المجهري الفلوري للخلايا الحية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامه لتحديد الميتوكوندريا والليزوزومات وتقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا.

Introduction

الميتوكوندريا هي مراكز القوة لجميع الخلايا حقيقية النواة تقريبا 1,2. بالإضافة إلى إنتاج ATP من خلال الفسفرة التأكسدية ، تلعب الميتوكوندريا دورا حيويا في عمليات أخرى مثل الطاقة الحيوية ، وتوازن الكالسيوم ، وتوليد الجذور الحرة ، وموت الخلايا المبرمج ، والتوازن الخلوي3،4،5. نظرا لأن الميتوكوندريا تولد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) من مجمعات متعددة في سلسلة نقل الإلكترون ، يتم تحفيزها باستمرار عن طريق الإجهاد التأكسدي المحتمل ، والذي يمكن أن يؤدي في النهاية إلى تلف هيكلي واختلال وظيفي عندما ينهار نظام الدفاع المضاد للأكسدة 6,7. تم العثور على خلل الميتوكوندريا للمساهمة في العديد من الأمراض ، بما في ذلك الاضطرابات الأيضية ، والتنكس العصبي ، وأمراض القلب والأوعية الدموية8. لذلك ، من الأهمية بمكان الحفاظ على صحة سكان الميتوكوندريا ووظيفتها المناسبة. الميتوكوندريا هي عضيات بلاستيكية وديناميكية للغاية. يتم التحكم في مورفولوجيتها ووظيفتها من خلال آليات مراقبة جودة الميتوكوندريا ، بما في ذلك التعديلات اللاحقة للترجمة (PTM) لبروتينات الميتوكوندريا ، والتولد الحيوي للميتوكوندريا ، والاندماج ، والانشطار ، والميتوفاجي9،10. ينتج عن انشطار الميتوكوندريا بوساطة البروتين 1 المرتبط بالدينامين (DRP1) ، وهو GTPase من عائلة البروتينات الديناميكية الفائقة ، ميتوكوندريا صغيرة ومستديرة ويعزل الميتوكوندريا المختلة وظيفيا ، والتي يمكن تطهيرها وتحللها بواسطة الميتوفاجي11,12.

Mitophagy هي عملية خلوية تؤدي بشكل انتقائي إلى تحلل الميتوكوندريا عن طريق الالتهام الذاتي ، وعادة ما تحدث في الميتوكوندريا التالفة بعد الإصابة أو الشيخوخة أو الإجهاد. بعد ذلك ، يتم تسليم هذه الميتوكوندريا إلى الليزوزومات للتحلل10. وبالتالي ، فإن الميتوفاجي هي عملية تقويضية تساعد في الحفاظ على كمية ونوعية الميتوكوندريا في حالة صحية في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا. يلعب دورا حاسما في استعادة التوازن الخلوي في ظل الظروف الفسيولوجية والإجهاد الطبيعية13,14. تتميز الخلايا بآلية ميتوفاجي معقدة ، والتي تسببها إشارات مختلفة من الإجهاد الخلوي والتغيرات التنموية. تصنف المسارات التنظيمية Mitophagy على أنها تعتمد على يوبيكويتين أو تعتمد على المستقبلات15,16 ؛ يتم التوسط في الالتهام الذاتي المعتمد على ubiquitin بواسطة كيناز PINK1 وتجنيد يوبيكويتين ligase Parkin E3 إلى الميتوكوندريا 17,18 ، بينما يتضمن الالتهام الذاتي المعتمد على المستقبلات ربط مستقبلات الالتهام الذاتي بسلسلة ضوء البروتين المرتبطة بالأنابيب الدقيقة LC3 التي تتوسط الميتوفاجي استجابة لتلف الميتوكوندريا19.

المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) هو الطريقة الأكثر استخداما ، ولا يزال أحد أفضل الطرق ، لمراقبة واكتشاف الميتوفاجي20. السمات المورفولوجية للميتوفاجي هي البلعمة الذاتية أو التحلل الذاتي التي تشكلت عن طريق اندماج البلعمة الذاتية مع الليزوزومات ، والتي يمكن ملاحظتها من صور المجهر الإلكتروني21. ومع ذلك ، فإن ضعف المجهر الإلكتروني (EM) هو عدم القدرة على مراقبة العمليات الديناميكية للميتوفاجي ، مثل إزالة استقطاب الميتوكوندريا ، وانشطار الميتوكوندريا ، واندماج البلعمة الذاتية والليزوزومات ، في الخلية الحية20. وبالتالي ، فإن تقييم الميتوفاجي من خلال تصوير العضيات الحية هو طريقة بديلة جذابة لأبحاث الميتوكوندريا. تستخدم تقنية التصوير بالخلايا الحية الموصوفة هنا صبغتين فلوريتين لتلطيخ الميتوكوندريا والليزوزومات. عندما يحدث الميتوفاجي ، فإن الميتوكوندريا التالفة أو الزائدة التي تجتاحها البلعمة الذاتية تكون ملطخة باللون الأخضر بواسطة صبغة الميتوكوندريا ، بينما تلطخ الصبغة الحمراء الليزوزومات. يؤدي اندماج هذه البلعمة الذاتية والليزوزومات ، المشار إليها باسم التحلل الذاتي ، إلى تداخل التألق الأخضر والأحمر وظهوره كنقاط صفراء ، مما يشير إلى حدوث الميتوفاجي22. تحتوي صبغة الميتوكوندريا الخلوية (MitoTracker Green) على مجموعة كلوروميثيل كلوروميثيل معتدلة التفاعل مع الثيول لتسمية الميتوكوندريا23. لتسمية الميتوكوندريا ، يتم تحضين الخلايا ببساطة بالصبغة ، التي تنتشر بشكل سلبي عبر غشاء البلازما وتتراكم في الميتوكوندريا النشطة. يمكن لصبغة الميتوكوندريا هذه تلطيخ الخلايا الحية بسهولة ، وهي أقل فعالية في تلطيخ الخلايا الثابتة أو الميتة بالألدهيد. صبغة الليزوزوم (LysoTracker Red) هي مسبار حمضي فلوري يستخدم لوضع العلامات على العضيات الحمضية وتتبعها في الخلايا الحية. تظهر هذه الصبغة انتقائية عالية للعضيات الحمضية ويمكنها تسمية الخلايا الحية بشكل فعال بتركيزات نانومولية24.

يتم هنا عرض إجراءات استخدام هذه الأصباغ الفلورية في الخلايا الحية ، بما في ذلك تحميل الأصباغ وتصور الميتوكوندريا والليزوزومات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة الباحثين على مراقبة الميتوفاجي باستخدام الفحص المجهري الفلوري للخلايا الحية. يمكن استخدامه أيضا لتحديد الميتوكوندريا والليزوزومات ، وتقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ثقافة الخلية والمرور

ملاحظة: يتم وصف البروتوكول باستخدام الخلايا الليفية الجنينية للفأر المستزرعة بشكل روتيني (MEFs) كمثال.

  1. خلايا MEF المستنبتة في أطباق زراعة الخلايا 10 سم مع 10 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM). احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ومراقبة الخلايا تحت المجهر عند تكبير 100x.
  2. أداء تمرير الخلايا الروتينية.
    1. عندما تصل الخلايا إلى 80٪ -90٪ التقاء (كل 3 أيام) ، اغسل الخلايا ب 2 مل من محلول ملحي مخزن فوسفات Dulbecco (DPBS). ثم أضف 2 مل من 0.05٪ تربسين-EDTA لمدة دقيقة واحدة لفصل الخلايا ، متبوعا ب 2 مل من DMEM لإيقاف عمل التربسين-EDTA. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 100 × جم لمدة 3 دقائق وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من DMEM.
    2. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي وشرائح غرفة عد الخلايا (انظر جدول المواد) ، ثم قم بتلقيح 1.5 × 106 خلايا في طبق زراعة خلايا جديد 10 سم يحتوي على 10 مل من DMEM.
  3. بالنسبة لفحص الميتوفاجي ، قم بإعداد تعليق خلوي كما في الخطوة 1.2.1. تمييع تعليق الخلية إلى 1 × 105 خلايا / مل في DMEM جديدة.
  4. أضف 2 مل من معلق الخلية المخفف إلى طبق متحد البؤر 20 مم (انظر جدول المواد) وهز طبق الاستزراع في "صليب". احتضان طبق زراعة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 24 ساعة.

2. تلطيخ الميتوكوندريا

  1. قم بإزالة حصص محلول المخزون من صبغة الميتوكوندريا الفلورية الخضراء وصبغة الليزوزوم الفلورية الحمراء (انظر جدول المواد) من الفريزر -20 درجة مئوية.
  2. تحضير حلول العمل للأصباغ عن طريق تخفيف حلول المخزون 1: 1000 في DMEM وتخلط جيدا. على سبيل المثال ، أضف 2 ميكرولتر لكل من صبغة الميتوكوندريا 1 mM وصبغة الليزوزوم إلى 2 مل من DMEM للحصول على تركيز عمل قدره 1 ميكرومتر لكلا الصبغتين.
  3. قم بإزالة الوسط من طبق الاستزراع متحد البؤر (الخطوة 1.4). أضف 1 مل من محلول التلوين (المحضر في الخطوة 2.2) لتغطية الخلايا. ضع طبق زراعة الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 20-30 دقيقة.

3. التصوير البؤري

  1. قم بإعداد 1 لتر من محلول كريبس هينسليت (KH) (138.2 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 3.7 مللي مول KCl ، 0.25 مللي مول CaCl 2 ، 1.2 مللي متر KH 2 PO 4 ، 1.2 مللي مول MgSO4.7H2 O ، 15 ملي مول جلوكوز ، و 21.85 مللي مول HEPES ؛ الرقم الهيدروجيني النهائي7.4) وتخزينه في 4 درجات مئوية (لمدة تصل إلى شهر واحد).
  2. في يوم التصوير متحد البؤر ، قم بإزالة المخزن المؤقت KH من الثلاجة مسبقا وقم بتسخينه مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة (20 إلى 25 درجة مئوية).
  3. اضبط معلمات برنامج التصوير المجهري متحد البؤر (انظر جدول المواد): بالنسبة لصور الإثارة المزدوجة ، استخدم الإثارة المتسلسلة عند 488 نانومتر و 543 نانومتر ، واجمع الانبعاثات عند 505-545 نانومتر و >560 نانومتر ، على التوالي.
    ملاحظة: اضبط إعدادات التصوير على النحو التالي. وضع المسح الضوئي: الإطار. السرعة: 9; المتوسط: رقم ، 1 ؛ الكسب: 450 إلى 600 ؛ الثقب: 30 إلى 200 ؛ الليزر: <10٪. من الأفضل بدء تشغيل برنامج التصوير أولا ثم تشغيل الليزر 488 نانومتر بالكامل. يجب تشغيل الليزر 543 نانومتر وتثبيته لمدة 3-5 دقائق قبل الاستخدام (الشكل 1 أ).
  4. قم بإزالة وسط الاستزراع الذي يحتوي على الصبغة من الحاضنة (الخطوة 2.3) وأضف 1 مل من محلول KH إلى الطبق.
  5. للحث على الميتوفاجي ، عالج الخلايا بسيانيد الكربونيل -4- (ثلاثي فلورو ميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) عند 1 ميكرومتر (التركيز النهائي) في محلول KH لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وانتقل على الفور إلى تصوير الخلايا باستخدام المجهر متحد البؤر.
  6. ضع كمية مناسبة من الزيت على الجزء العلوي من عدسة الزيت 63x (انظر جدول المواد). ضع عينة الخلية في مرحلة العينة من المجهر متحد البؤر وحركها مباشرة فوق العدسة الشيئية.
  7. استخدم برنامج التصوير للعثور على العينة بالنقر فوق علامة التبويب تحديد الموقع في الزاوية العلوية اليسرى من واجهة البرنامج (الشكل 1 ب). اختر مجموعة فلاتر خضراء للتجربة.
  8. استخدم مقبض الضبط الخشن للتركيز البؤري بسرعة عن طريق تحريك العدسة الشيئية لأعلى ولأسفل. بعد أن تكون عينة الخلية مرئية بوضوح من خلال العدسة ، ابحث عن منطقة الخلايا المفردة وقم بتركيزها وانقلها إلى مركز مجال الرؤية.
  9. انقر فوق علامة التبويب الاستحواذ في الزاوية اليسرى العليا في واجهة البرنامج للحصول على الصور. حدد فقط قناة 488 نانومتر ودقة الإطار 1024 × 1024 للمعاينة.
  10. انقر فوق علامة التبويب Live في الزاوية اليسرى العليا لبدء الفحص المباشر. اضبط مجال الرؤية على الأكثر حدة واضبط طاقة الليزر عن طريق تحريك شريط التمرير إلى اليسار أو اليمين (الشكل 1 أ). حافظ على إعداد الكسب أقل من 600 لتجنب التعرض المفرط.
  11. اضبط قيمة الثقب على 156 ، واكتسب القيمة إلى 545 ، وقيمة الإزاحة الرقمية إلى 0.
  12. حدد أفضل مجال رؤية ، وتحقق من القناتين (488 نانومتر و 543 نانومتر) ، واختر دقة الإطار 1024 × 1024. انقر فوق Snap للحصول على صور 2D. احفظ الصور التي تم الحصول عليها.
    ملاحظة: صبغة الميتوكوندريا الخضراء لها ذروة إثارة عند 490 نانومتر وذروة انبعاث عند 516 نانومتر. يمكن إثارته باستخدام ليزر 488 نانومتر. صبغة الليزوزوم الحمراء لها ذروة إثارة عند 576 نانومتر وذروة انبعاث عند 590 نانومتر. يمكن إثارته باستخدام ليزر 543 نانومتر.

4. تحليل الصور

  1. افتح الصورة المحفوظة باستخدام ImageJ واستورد الصورة المدمجة فيها.
  2. احسب يدويا عدد النقاط الصفراء في كل خلية ، والتي تشير إلى أن الليزوزوم يبتلع الميتوكوندريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MitoTracker Green عبارة عن صبغة ميتوكوندريا خضراء فلورية قادرة على توطين الميتوكوندريا بدقة. يمكن للصبغة أن تلطخ الخلايا الحية بسهولة وتكون أقل فعالية في تلطيخ الخلايا الثابتة أو الميتة بالألدهيد (الشكل 2). صبغة الليزوزوم الأحمر الفلوري LysoTracker Red قادرة على وضع العلامات على العضيات الليزوزومية الحمضية وتتبعها ويمكنها فقط تلطيخ الخلايا الحية (الشكل 2). يسمح التصوير المجهري متحد البؤر بتصور الميتوكوندريا والليزوزومات الملطخة بالأصباغ المناسبة (الشكل 1 والشكل 2).

Mitophagy هي عملية خلوية تقويضية تؤدي بشكل انتقائي إلى تحلل الميتوكوندريا عن طريق الالتهام الذاتي ، والذي يحدث عادة في الميتوكوندريا التالفة بعد الإصابة أو الشيخوخة أو الإجهاد20. في وقت لاحق ، يتم تسليم هذه الميتوكوندريا إلى الليزوزومات للتحلل. يساعد Mitophagy في الحفاظ على كمية ونوعية الميتوكوندريا في حالة صحية في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا. في خلايا الثدييات السليمة ، يحدث الميتوفاجي بشكل غير منتظم ، وبالتالي هناك حاجة إلى محفزات أخرى للحث على هذه العملية25. سيانيد الكربونيل -4 (ثلاثي فلورو ميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) ، وهو غير مقسم للميتوكوندريا ، هو أيونوفور غير محدد يسبب فقدانا شديدا لإمكانات غشاء الميتوكوندريا في غضون دقائق ، وتغيير درجة الحموضة داخل الخلايا ، والميتوفاجي اللاحق26,27. في هذه الدراسة ، تم استخدام FCCP لتحفيز الميتوفاجي في خلايا MEF للتصوير متحد البؤر. عندما تجتاح الميتوكوندريا ذات اللون الأخضر التالفة الجسيمات الحالة ذات اللون الأحمر ، يتداخل التألق الأخضر والأحمر للكشف عن الميتوكوندريا والليزوزومات الصفراء الموضعية (الشكل 3). تتوافق النقاط الصفراء في الشكل 3D والشكل 4B مع هذه الميتوكوندريا الليزوزومات الموضعية ، والتي تمثل الميتوفاجي المستمر ، وبالتالي يمكن حسابها لتقييم مدى الميتوفاجي (الشكل 4).

Figure 1
الشكل 1: معلمات التصوير لبرنامج التصوير المجهري متحد البؤر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: رسم تخطيطي للتصوير متحد البؤر للخلايا الحية. يتم تلطيخ الخلايا الحية بشكل مشترك مع صبغة الميتوكوندريا الخضراء الفلورية وصبغة الليزوزومات الحمراء ، ثم يتم تصوير الخلايا الحية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. تم إجراء معالجة الصور وتحليل البيانات باستخدام برنامج التصوير المرتبط بالمجهر أو Image J. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: التصوير متحد البؤر للخلايا الحية . (أ) الصور التمثيلية للخلايا الملطخة بصبغة الميتوكوندريا الخضراء الفلورية توضح الميتوكوندريا. ب: صور تمثيلية لخلايا ملطخة بصبغة الليزوزوم الفلورية الحمراء التي توضح الليزوزوم. (ج) صورة مدمجة لكلا الأصباغ الفلورية. (د) منطقة موسعة تظهر الميتوفاجي. يشير السهم الأبيض إلى الميتوكوندريا الخضراء التي تجتاحها الجسيمات الحالة الحمراء. اختصار: Ex = الطول الموجي للإثارة. صبغة الميتوكوندريا الخضراء الفلورية متحمسة عند 488 نانومتر مع انبعاث تم جمعه عند 505-545 نانومتر. يتم إثارة صبغة الليزوزوم الفلورية الحمراء عند 543 نانومتر مع انبعاث تم جمعه عند >560 نانومتر. قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: الميتوفاجي الناجم عن تحفيز FCCP . (أ) صور تمثيلية لخلايا ملطخة بالاشتراك مع صبغة الميتوكوندريا الخضراء الفلورية وصبغة الليزوزوم الأحمر الفلوري. (ب) صور تمثيلية للخلايا المعالجة ب 1 ميكرومتر FCCP لمدة 10 دقائق. يشير السهم الأبيض إلى الميتوكوندريا الخضراء التي تجتاحها الجسيمات الحالة الحمراء. (ج) البيانات الكمية للميتوفاجي المشار إليها بتراكب الميتوكوندريا الليزوزومية. البيانات هي متوسط ± SEM ، n = 8 خلايا. *p < 0.05 مقابل التحكم. قضبان المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر البروتوكول الموصوف هنا طريقة لتقييم ومراقبة العملية الديناميكية للميتوفاجي في الخلايا الحية ، بما في ذلك البلعمة الذاتية ، والليزوزومات ، والانشطار الميتوكوندريا ، من خلال التلوين المشترك مع الميتوكوندريا الخلوية والأصباغ الليزوزومية. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتحديد الميتوكوندريا وتقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا. يجب حماية كل من الأصباغ المستخدمة في هذه الدراسة من الضوء ، ويجب تجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة ، ويجب تخزين الأصباغ في حصص تستخدم مرة واحدة قدر الإمكان. يوصى بإعداد محاليل عمل للأصباغ لتجنب إضافتها مباشرة إلى وسط زراعة الخلايا ، مما قد يؤدي إلى تركيزات محلية عالية وخلط غير كاف للأصباغ. لتجنب تلطيخ الهياكل الخلوية الأخرى ، يجب تلطيخ خلايا MEF لمدة 30 دقيقة قبل التصوير باستخدام المجهر متحد البؤر. يوصى بإجراء عملية التلوين مباشرة قبل التصوير. في خلايا MEF ، يتم توطين كل من أصباغ الميتوكوندريا والليزوزوم عند 1 ميكرومتر بشكل جيد في الميتوكوندريا والليزوزومات ، على التوالي ، مع تركيزات صبغة أعلى تؤدي إلى السمية الخلوية وكذلك تلطيخ غير محدد للهياكل الخلوية الأخرى. هذا التركيز هو أيضا الأمثل لتلطيخ الميتوكوندريا والليزوزومات في خلايا H9C2. بالنسبة لخطوط الخلايا الأخرى ، يجب تحسين تركيز الصبغة ووقت التلوين الذي يسمح للصبغة بالتوطين جيدا للعضيات. للحصول على صور واضحة للميتوكوندريا والليزوزومات ، يجب تعديل معلمات مجموعة الصور (انظر الملاحظة في الخطوة 3.3) بضمير حي. يعد التقاء الخلايا بنسبة 50٪ -60٪ أمرا بالغ الأهمية للحصول على صور الخلايا الحية الفردية ، وبالتالي يجب حساب الخلايا قبل البذر. إذا لم يكن المختبر يحتوي على أطباق متحدة البؤر ، فيمكن استخدام أغطية دائرية كبديل. في بعض الدراسات على الحيوانات ، وخاصة في الفحوصات السريرية ، من الصعب اكتشاف الميتوفاجي في عينات الأنسجة الحية الحيوانية بسبب عدم وجود تجارب كمية موثوقة ومريحة لدراسة الميتوفاجي. ومع ذلك ، يمكن تقييم الميتوفاجي في الخلايا المعزولة من الأنسجة الحيوانية باستخدام البروتوكول الموضح هنا. أحد قيود هذه الطريقة هو أنه على الرغم من أن كلا الصبغتين يمكنهما تلطيخ الخلايا الحية بسهولة ، إلا أنهما أقل فعالية في تلطيخ الخلايا الميتة أو الثابتة بالألدهيد.

بالإضافة إلى الأصباغ المستخدمة في هذه الدراسة ، تتوفر حاليا متتبعات الميتوكوندريا والليزوزومات الأخرى ، مثل MitoMM1 / 2 و LysoKK ، على التوالي ، للباحثين لتقييم الميتوفاجي28,29. في حين أن MitoMM1 / 2 يمكن أن يلطخ الميتوكوندريا في الخلايا أو الأنسجة الثابتة بارافورمالدهيد ، فإنه لا يمكنه تقييم الميتوفاجي مباشرة ويتطلب تلطيخا مزدوجا بجسم مضاد معين ، مثل مضاد LC3B ، للكشف عن الميتوفاجي. نظرا لأن LysoKK يمكنه فقط تلطيخ الخلايا الحية ، فإن الجمع بين هذه الأصباغ يمكنه أيضا اكتشاف الالتهام الذاتي للميتوكوندريا فقط في الخلايا الحية28,29. ومع ذلك ، فإن MitoMM1 / 2 سهل الاستخدام ويسمح باستخدام مرشح TRITC (لأنه لا يظهر الإثارة عند استخدام الليزر الأزرق ولا ينتج انبعاثا أخضر). يمكن ل LysoKK تلطيخ العضيات في غضون 5 دقائق ، مما يسهل المراقبة والتقييم السريع للعديد من المحفزات28,29.

يحدث Mitophagy في الخلايا عبر آلية معقدة ، والتي تسببها إشارات الإجهاد الخلوي المختلفة والتغيرات التنموية. FCCP ، وهو غير مفصول قوي للفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا ، هو أيونوفور26 غير محدد تم استخدامه للحث على الميتوفاجي في هذه الدراسة. يتداخل FCCP (1 ميكرومتر) مع تدرج البروتون عن طريق نقل البروتونات عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلي ، وهي عملية تسبب تغييرا في درجة الحموضة داخل الخلايا. وبالتالي ، يمكن أن يتسبب FCCP في فقدان شديد لإمكانات غشاء الميتوكوندريا في غضون دقائق ثم يحفز الالتهام الذاتي للميتوكوندريا عن طريق تجنيد Parkin وسلسلة ضوء البروتين المرتبطة بالأنابيب الدقيقة 3 (LC3) إلى الميتوكوندريا26،27،30. تصنف المسارات التنظيمية Mitophagy على أنها تعتمد على ubiquitin (بوساطة PINK1-parkin) أو تعتمد على المستقبلات (بوساطة LC3 ومستقبلات أخرى)15,16. تمت دراسة Mitophagy باستخدام أجسام مضادة محددة ترتبط بالجزيئات الرئيسية في مسار الالتهام الذاتي المعتمد على المستقبلات ، مثل LC3B ، متبوعا بالتلوين المشترك مع صبغة الليزوزوم الفلورية الحمراء31,32. على الرغم من صعوبة التمييز بين هذين المسارين باستخدام الأصباغ المستخدمة في هذا البروتوكول ، إلا أنهما يقدمان طريقة بسيطة لتقييم مدى الميتوفاجي في الخلايا الحية وتقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2017YFA0105601 ، 2018YFA0107102) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81970333،31901044،) ، وبرنامج أستاذ التعيين الخاص في مؤسسات شنغهاي للتعليم العالي (GZ2020008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated cell counter Countstar IC1000
Cell counting chamber slides Countstar 12-0005-50
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Corning 10-013-CV
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Corning 21-031-CVC
Glass bottom cell culture dish (confocal dish) NEST 801002
Image J (Rasband, NIH) NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit(KHB) buffer Self-prepared
LysoTracker Red Invitrogen 1818430 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye
MitoTracker Green Invitrogen 1842298 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye
Mouse Embryonic Fibroblasts Self-prepared
Objective (63x oil lens) ZEISS ZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25% Gibico Cat# 25200056
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope ZEISS ZEISS LSM 880
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) ZEISS ZEN 2.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
  2. Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
  3. Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
  4. Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).
  5. Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
  6. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  7. Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
  8. Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
  9. Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).
  10. Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
  11. Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
  12. Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).
  13. Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).
  14. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
  15. Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
  16. Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
  17. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  18. Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
  19. Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
  20. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
  21. Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
  22. Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
  23. Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
  24. Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
  25. Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
  26. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
  27. Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
  28. Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
  29. Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
  30. Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
  31. Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
  32. Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).

Tags

علم الأحياء، العدد 189،
تصور Mitophagy مع الأصباغ الفلورية للميتوكوندريا والليزوزوم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, B., Li, A., Qin, Y., Chen, L.,… More

Liu, B., Li, A., Qin, Y., Chen, L., Gao, M., Gong, G. Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome. J. Vis. Exp. (189), e64647, doi:10.3791/64647 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter