Summary
线粒体自噬是线粒体质量控制的主要机制。然而， 由于 缺乏可靠的定量测定，体内线粒体自噬的评估受到阻碍。这里介绍的是使用细胞通透性绿色荧光线粒体染料和红色荧光溶酶体染料观察活细胞中线粒体自噬的方案。
Abstract
线粒体是细胞的动力源，在生物能量学、自由基生成、钙稳态和细胞凋亡中起着重要作用。线粒体自噬是线粒体质量控制的主要机制，通常使用显微镜观察进行研究，但 体内 线粒体自噬测定难以进行。通过对活细胞器进行成像来评估线粒体自噬是线粒体研究的另一种必要方法。该协议描述了在活细胞中使用细胞通透性绿色荧光线粒体染料MitoTracker Green和红色荧光溶酶体染料LysoTracker Red的程序，包括染料的负载，线粒体和溶酶体的可视化，以及预期结果。还提供了评估活细胞线粒体自噬的详细步骤，以及有关显微镜软件设置的技术说明。这种方法可以帮助研究人员使用活细胞荧光显微镜观察线粒体自噬。此外，它还可用于量化线粒体和溶酶体并评估线粒体形态。
Introduction
线粒体是几乎所有真核细胞的动力源1，2。除了通过氧化磷酸化产生ATP外，线粒体在其他过程中起着至关重要的作用，例如生物能量学，钙稳态，自由基生成，细胞凋亡和细胞稳态3，4，5。当线粒体从电子传递链中的多个复合物产生活性氧（ROS）时，它们不断受到潜在氧化应激的刺激，当抗氧化防御系统崩溃时，最终会导致结构损伤和功能障碍6，7。已发现线粒体功能障碍会导致许多疾病，包括代谢紊乱、神经变性和心血管疾病8。因此，维持健康的线粒体种群及其正常功能至关重要。线粒体是高度可塑性和动态的细胞器;它们的形态和功能受线粒体质量控制机制控制，包括线粒体蛋白的翻译后修饰（PTM）、线粒体生物发生、融合、裂变和线粒体自噬9，10。由动态蛋白相关蛋白 1 （DRP1）（动态蛋白超家族的 GTP 酶）介导的线粒体裂变导致小而圆的线粒体并分离功能失调的线粒体，线粒体可以被线粒体自噬清除和降解11，12。
线粒体自噬是一种通过自噬选择性降解线粒体的细胞过程，通常发生在损伤、衰老或应激后的受损线粒体中。随后，这些线粒体被递送到溶酶体进行降解10。因此，线粒体自噬是一种分解代谢过程，有助于在多种细胞类型中保持线粒体的数量和质量处于健康状态。它在正常生理和应激条件下恢复细胞稳态中起着至关重要的作用13，14。细胞的特征在于复杂的线粒体自噬机制，其由细胞应激和发育变化的不同信号诱导。线粒体自噬调节途径分为泛素依赖性或受体依赖性15，16;泛素依赖性自噬由激酶 PINK1 和泛素连接酶 Parkin E3 募集到线粒体介导 17，18，而受体依赖性自噬涉及自噬受体与微管相关蛋白轻链 LC3 的结合，后者介导线粒体自噬以响应线粒体损伤19。
透射电子显微镜（TEM）是观察和检测线粒体自噬最常用的方法，也是最佳方法之一20。线粒体自噬的形态特征是自噬体或自噬体与溶酶体融合形成的自噬体或自溶酶体，这可以从电子显微镜图像中观察到21。然而，电子显微镜（EM）的弱点是无法监测线粒体自噬的动态过程，例如线粒体去极化，线粒体裂变以及自噬体和溶酶体的融合，在活细胞20中。因此，通过成像活细胞器评估线粒体自噬是线粒体研究的一种有吸引力的替代方法。这里描述的活细胞成像技术使用两种荧光染料对线粒体和溶酶体进行染色。当线粒体自噬发生时，被自噬体吞噬的受损或多余的线粒体被线粒体染料染成绿色，而红色染料会染色溶酶体。这些自噬体和溶酶体的融合，称为自溶酶体，导致绿色和红色荧光重叠并表现为黄点，从而表明线粒体自噬的发生22。细胞通透的线粒体染料（MitoTracker Green）含有轻度硫醇反应性氯甲基部分，用于标记线粒体23。为了标记线粒体，只需将细胞与染料一起孵育，染料被动扩散到质膜上并积聚在活性线粒体中。这种线粒体染料很容易染色活细胞，并且在染色醛固定或死细胞方面效果较差。溶酶体染料（LysoTracker Red）是一种荧光嗜酸探针，用于标记和跟踪活细胞中的酸性细胞器。该染料对酸性细胞器表现出高选择性，并且可以有效地标记纳摩尔浓度的活细胞24。
本文介绍了在活细胞中使用这些荧光染料的程序，包括装载染料以及线粒体和溶酶体的可视化。这种方法可以帮助研究人员使用活细胞荧光显微镜观察线粒体自噬。它还可用于量化线粒体和溶酶体，并评估线粒体形态。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 细胞培养和传代
注意：该方案以常规培养的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）为例进行描述。
- 在 10 cm 细胞培养皿中用 10 mL Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 培养 MEF 细胞。在37°C和5%CO2 下孵育，并在显微镜下以100倍放大倍率监测细胞。
- 进行常规细胞传代。
- 当细胞达到80%-90%汇合度（每3天）时，用2mL的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）洗涤细胞。然后加入 2 mL 的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 1 分钟以解离细胞，然后加入 2 mL DMEM 以停止胰蛋白酶-EDTA 的作用。将细胞悬液以 100 x g 离心 3 分钟，并将细胞沉淀重悬于 1 mL DMEM 中。
- 使用自动细胞计数器和细胞计数室载玻片对细胞进行计数（参见 材料表），然后将1.5 x 106 个细胞接种到含有10 mL DMEM的新10 cm细胞培养皿中。
- 对于线粒体自噬测定，如步骤1.2.1中制备细胞悬液。在新鲜DMEM中将细胞悬液稀释至1 x 105 个细胞/ mL。
- 将 2 mL 稀释的细胞悬液加入 20 mm 共聚焦培养皿中（参见 材料表），并以“交叉”方式摇动培养皿。将细胞培养皿在37°C，5%CO2 培养箱中孵育24小时。
2. 线粒体染色
- 从-20°C冰箱中取出绿色荧光线粒体染料和红色荧光溶酶体染料的储备溶液等分试样（参见 材料表）。
- 通过在DMEM中以1：1，000稀释储备溶液来制备染料的工作溶液并充分混合。例如，将 1 mM 线粒体染料和溶酶体染料各 2 μL 加入 2 mL DMEM 中，以获得两种染料的工作浓度为 1 μM。
- 从共聚焦培养皿中取出培养基（步骤1.4）。加入 1 mL 染色溶液（在步骤 2.2 中制备）以覆盖细胞。将细胞培养皿置于37°C，5%CO2 的培养箱中20-30分钟。
3. 共聚焦成像
- 准备 1 L 克雷布斯-亨塞莱特 （KH） 缓冲液（138.2 mM NaCl、3.7 mM KCl、0.25 mM CaCl 2、1.2 mM KH 2 PO 4、1.2 mM MgSO4.7H 2O、15 mM 葡萄糖和 21.85mM HEPES;最终 pH 7.4），并在4 °C 下储存（长达 1 个月）。
- 在共聚焦成像当天，提前从冰箱中取出KH缓冲液并将其预热至室温（20至25°C）。
- 设置共聚焦显微镜成像软件的参数（见 材料表）： 对于双激发图像，分别在488 nm和543 nm处使用顺序激发，并分别在505-545 nm和>560 nm处收集发射。
注：按如下方式设置映像设置。扫描模式：帧;速度：9;平均： 数字， 1;增益：450 至 600;针孔：30至200;激光：<10%。最好先启动成像软件，然后完全打开488nm激光器。543 nm激光器在使用前需要打开并稳定3-5分钟（图1A）。 - 从培养箱中取出含有染料的培养基（步骤2.3），并向培养皿中加入1mL KH缓冲液。
- 为了诱导线粒体自噬，在室温下用羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）在KH缓冲液中以1μM（终浓度）处理细胞10分钟，并立即使用共聚焦显微镜对细胞进行成像。
- 在63x油性镜头的顶部涂抹适量的油（参见 材料表）。将细胞样品放在共聚焦显微镜的样品台上，并将其直接移动到物镜上方。
- 使用成像软件通过单击软件界面左上角的 定位 选项卡来查找样品（图1B）。为实验选择绿色过滤器集。
- 使用粗调旋钮通过上下移动物镜来快速对焦。通过目镜清晰可见细胞样本后，搜索并聚焦单个细胞的区域，并将其移动到视野的中心。
- 单击软件界面左上角的 采集 选项卡以获取图像。仅选择 488 nm 通道和帧分辨率 1024 x 1024 进行预览。
- 单击左上角的 实时 选项卡以开始实时扫描。将视场调整到最清晰，并通过向左或向右移动滑块来调整激光功率（图1A）。将增益设置保持在 600 以下以避免过度曝光。
- 将针孔值调整为 156，将增益值调整为 545，将数字偏移值调整为 0。
- 选择最佳视场，检查两个通道（488 nm 和 543 nm），然后选择帧分辨率 1024 x 1024。单击 捕捉 以获取 2D 图像。保存采集的图像。
注意：绿色线粒体染料在490nm处具有激发峰，在516nm处具有发射峰;它可以使用 488 nm 激光激发。红色溶酶体染料在576 nm处具有激发峰，在590 nm处具有发射峰;它可以使用 543 nm 激光激发。
4. 图像分析
- 使用 ImageJ 打开保存的图像，然后将合并的图像导入其中。
- 手动计算每个细胞中的黄点数量，这表明溶酶体正在吞噬线粒体。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MitoTracker Green是一种绿色荧光线粒体染色剂，能够准确地定位为线粒体。该染料很容易染色活细胞，并且在染色醛固定细胞或死细胞方面效果较差（图2）。红色荧光溶酶体染料LysoTracker Red能够标记和跟踪酸性溶酶体细胞器，并且只能对活细胞进行染色（图2）。共聚焦显微镜成像允许可视化用适当染料染色的线粒体和溶酶体（图1 和 图2）。
线粒体自噬是一种分解代谢细胞过程，通过自噬选择性地降解线粒体，自噬通常发生在损伤、衰老或应激后的受损线粒体中20.随后，这些线粒体被递送到溶酶体进行降解。线粒体自噬有助于在多种细胞类型中将线粒体的数量和质量维持在健康状态。在健康的哺乳动物细胞中，线粒体自噬很少发生，因此需要其他刺激来诱导这一过程25。羰基氰化物-4（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）是一种线粒体解偶联剂，是一种非特异性离子载体，可在几分钟内导致线粒体膜电位严重丧失，细胞内pH改变，随后线粒体自噬26，27。在这项研究中，FCCP用于触发MEF细胞中的线粒体自噬以进行共聚焦成像。当受损的绿色染色线粒体被红色染色的溶酶体吞噬时，绿色和红色荧光重叠以显示黄色共定位的线粒体溶酶体（图3）。图 3D 和 图4B 中的黄点对应于这些共定位的线粒体溶酶体，代表正在进行的线粒体自噬，因此可以计数以评估线粒体自噬的程度（图4）。
图 1：共聚焦显微镜成像软件的成像参数。 请点击此处查看此图的大图。
图2：活细胞共聚焦成像的示意图。 将活细胞与绿色荧光线粒体染料和红色荧光溶酶体染料共染色，然后使用共聚焦显微镜对活细胞进行成像。使用显微镜相关的成像软件或图像J进行图像处理和 数据分析。
图3：活细胞的共聚焦成像 。 （A）用绿色荧光线粒体染料染色的细胞的代表性图像显示线粒体。（B）用红色荧光溶酶体染料染色的细胞的代表性图像，显示溶酶体。（C）两种荧光染料的合并图像。（D）显示线粒体自噬的扩大区域。白色箭头表示被红色溶酶体吞没的绿色线粒体。缩写：Ex = 激发波长。绿色荧光线粒体染料在488nm处激发，发射在505-545nm处收集。红色荧光溶酶体染料在 543 nm 处激发，发射在 >560 nm 处收集。比例尺 = 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图4：由FCCP刺激触发的线粒体自噬 。 （A）与绿色荧光线粒体染料和红色荧光溶酶体染料共染色的细胞的代表性图像。（B）用1μM FCCP处理10分钟的细胞的代表性图像。白色箭头表示被红色溶酶体吞没的绿色线粒体。（C）溶酶体-线粒体叠加指示的线粒体自噬的定量数据。数据是 SEM ±平均值，n = 8 个细胞。*p < 0.05 与对照组相比。比例尺 = 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这里描述的方案提供了一种评估和监测活细胞中线粒体自噬的动态过程的方法，包括自噬体、溶酶体和线粒体裂变，通过与细胞通透的线粒体和溶酶体染料共染色。该方法还可用于识别线粒体和评估线粒体形态。本研究中使用的两种染料都应避光，应避免多次冻融循环，并且染料应尽可能以一次性等分试样储存。建议制备染料的工作溶液，以避免将它们直接添加到细胞培养基中，这可能导致高局部浓度和染料混合不充分。为避免染色其他细胞结构，MEF细胞应在用共聚焦显微镜成像之前染色30分钟。建议在成像前立即进行染色程序。在MEF细胞中，1μM的线粒体和溶酶体染料分别在线粒体和溶酶体中定位良好，较高的染料浓度导致细胞毒性以及其他细胞结构的非特异性染色。该浓度也是染色H9C2细胞中线粒体和溶酶体的最佳选择。对于其他细胞系，需要优化染料浓度和染色时间，以使染料能够很好地定位到细胞器。为了获得清晰的线粒体和溶酶体图像，必须认真调整图像采集参数（参见步骤3.3中的注释）。50%-60%的细胞汇合对于获得单个活细胞图像至关重要，因此必须在接种前对细胞进行计数。如果实验室没有共聚焦培养皿，可以使用圆形盖玻片作为替代方案。在一些动物研究中，特别是在临床检查中，由于缺乏可靠方便的定量实验来研究线粒体自噬，很难检测动物活体组织样本中的线粒体自噬。然而，可以使用此处描述的方案评估从动物组织中分离的细胞中的线粒体自噬。这种方法的局限性在于，尽管这两种染料都可以轻松染色活细胞，但它们在染色死细胞或醛固定细胞方面效果较差。
除了本研究中使用的染料外，研究人员目前还可以使用其他线粒体和溶酶体示踪剂，例如MitoMM1 / 2和LysoKK来评估线粒体自噬28，29。虽然MitoMM1/2可以对多聚甲醛固定细胞或组织中的线粒体进行染色，但它不能直接评估线粒体自噬，需要用特异性抗体（如抗LC3B）进行双重染色以检测线粒体自噬。由于LysoKK只能对活细胞进行染色，因此这些染料的组合也只能检测活细胞中的线粒体自噬28，29。尽管如此，MitoMM1/2易于使用，并允许使用TRITC滤波器（因为它在使用蓝色激光时不会显示激发，也不会产生绿色发射）。LysoKK可以在5分钟内对细胞器进行染色，有助于快速监测和评估多种刺激物28，29。
线粒体自噬通过复杂的机制在细胞中发生，该机制由不同的细胞应激信号和发育变化诱导。FCCP是线粒体氧化磷酸化的有效解偶联剂，是一种非特异性离子载体26，在本研究中用于诱导线粒体自噬。FCCP（1μM）通过在线粒体内膜传输质子来干扰质子梯度，这一过程会导致细胞内pH值发生变化。因此，FCCP可以在几分钟内导致线粒体膜电位的严重丧失，然后通过向线粒体26，27，30募集帕金和微管相关蛋白轻链3（LC3）来诱导线粒体自噬。线粒体自噬调节途径分为泛素依赖性（PINK1-parkin介导）或受体依赖性（由LC3和其他受体介导）15，16。已经使用与受体依赖性自噬途径中的关键分子结合的特异性抗体（例如LC3B）研究了线粒体自噬，然后与红色荧光溶酶体染料31，32共染色。尽管使用本协议中使用的染料很难区分这两种途径，但它们提供了一种简单的方法来评估活细胞中线粒体自噬的程度并评估线粒体形态。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作由国家重点研发计划（2017YFA0105601，2018YFA0107102）、国家自然科学基金（81970333，31901044）和上海高等学校特聘教授计划（GZ2020008）部分资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated cell counter | Countstar | IC1000 | |
| Cell counting chamber slides | Countstar | 12-0005-50 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
| Glass bottom cell culture dish (confocal dish) | NEST | 801002 | |
| Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Krebs–Henseleit(KHB) buffer | Self-prepared | ||
| LysoTracker Red | Invitrogen | 1818430 | 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye |
| MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Self-prepared | ||
| Objective (63x oil lens) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
| ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) | ZEISS | ZEN 2.1 |
References
- Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
- Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
- Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
- Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).
- Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
- Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
- Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
- Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).
- Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
- Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
- Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).
- Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
- Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
- Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
- Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
- Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
- Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
- Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
- Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
- Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).
