Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering af mitofagi med fluorescerende farvestoffer til mitokondrier og lysosomer

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64647
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1, 1, 1,2
1Institute for Regenerative Medicine, Shanghai East Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 3Department of Pharmacy, Shanghai East Hospital, Tongji University

Summary

Mitofagi er den primære mekanisme for mitokondrie kvalitetskontrol. Evalueringen af mitophagy in vivo hindres imidlertid af manglen på pålidelige kvantitative assays. Præsenteret her er en protokol til observation af mitofagi i levende celler ved hjælp af et cellepermeant grøn-fluorescerende mitokondrier farvestof og et rød-fluorescerende lysosomfarvestof.

Abstract

Mitokondrier, der er cellens kraftcentre, spiller vigtige roller i bioenergetik, fri radikalgeneration, calciumhomeostase og apoptose. Mitofagi er den primære mekanisme for mitokondrie kvalitetskontrol og studeres generelt ved hjælp af mikroskopisk observation, men in vivo mitophagy assays er vanskelige at udføre. Evaluering af mitofagi ved billeddannelse af levende organeller er en alternativ og nødvendig metode til mitokondrieforskning. Denne protokol beskriver procedurerne for anvendelse af det cellepermeant grøn-fluorescerende mitokondrifarvestof MitoTracker Green og det rød-fluorescerende lysosomfarvestof LysoTracker Red i levende celler, herunder indlæsning af farvestofferne, visualisering af mitokondrierne og lysosomet og forventede resultater. Detaljerede trin til evaluering af mitofagi i levende celler samt tekniske noter om mikroskopsoftwareindstillinger leveres også. Denne metode kan hjælpe forskere med at observere mitofagi ved hjælp af levende celle fluorescerende mikroskopi. Derudover kan den bruges til at kvantificere mitokondrier og lysosomer og vurdere mitokondriemorfologi.

Introduction

Mitokondrier er kraftcentrene i næsten alle eukaryote celler 1,2. Ud over ATP-produktion gennem oxidativ phosphorylering spiller mitokondrier en afgørende rolle i andre processer såsom bioenergetik, calciumhomeostase, fri radikalgeneration, apoptose og cellulær homeostase 3,4,5. Da mitokondrier genererer reaktive iltarter (ROS) fra flere komplekser i elektrontransportkæden, stimuleres de konstant af potentiel oxidativ stress, hvilket i sidste ende kan føre til strukturel skade og dysfunktion, når antioxidantforsvarssystemet kollapser 6,7. Mitokondrie dysfunktion har vist sig at bidrage til mange sygdomme, herunder metaboliske lidelser, neurodegeneration og hjerte-kar-sygdom8. Derfor er det afgørende at opretholde sunde mitokondriepopulationer og deres rette funktion. Mitokondrier er meget plastiske og dynamiske organeller; deres morfologi og funktion styres af mitokondrie kvalitetskontrolmekanismer, herunder posttranslationelle modifikationer (PTM) af mitokondrieproteiner, mitokondriel biogenese, fusion, fission og mitofagi 9,10. Mitokondriefission medieret af dynaminrelateret protein 1 (DRP1), en GTPase af dynaminsuperfamilien af proteiner, resulterer i små og runde mitokondrier og isolerer de dysfunktionelle mitokondrier, som kan ryddes og nedbrydes ved mitofagi11,12.

Mitofagi er en cellulær proces, der selektivt nedbryder mitokondrier ved autofagi, der normalt forekommer i beskadigede mitokondrier efter skade, aldring eller stress. Derefter leveres disse mitokondrier til lysosomer til nedbrydning10. Mitofagi er således en katabolisk proces, der hjælper med at opretholde mængden og kvaliteten af mitokondrier i en sund tilstand i en bred vifte af celletyper. Det spiller en afgørende rolle i genoprettelsen af cellulær homeostase under normale fysiologiske og stressforhold13,14. Celler er kendetegnet ved en kompleks mitofagimekanisme, som induceres af forskellige signaler om cellulær stress og udviklingsændringer. Mitofagi regulatoriske veje er klassificeret som ubiquitin-afhængige eller receptorafhængige15,16; den ubiquitinafhængige autofagi medieres af kinasen PINK1 og rekrutteringen af ubiquitin ligase Parkin E3 til mitokondrierne 17,18, mens receptorafhængig autofagi involverer binding af autofagireceptorer til den mikrotubuli-associerede proteinlyskæde LC3, der medierer mitofagi som reaktion på mitokondrieskader19.

Transmissionselektronmikroskopi (TEM) er den mest almindeligt anvendte metode og stadig en af de bedste metoder til at observere og detektere mitofagi20. De morfologiske træk ved mitofagi er autofagosomer eller autolysosomer dannet ved fusion af autofagosomer med lysosomer, som kan observeres fra elektronmikroskopibilleder21. Svagheden ved elektronmikroskopi (EM) er imidlertid manglende evne til at overvåge de dynamiske processer af mitofagi, såsom mitokondriel depolarisering, mitokondriefission og fusion af autofagosomer og lysosomer i den levende celle20. Således er evaluering af mitofagi gennem billeddannelse af levende organeller en attraktiv alternativ metode til mitokondrieforskning. Den levende cellebilleddannelsesteknik, der er beskrevet her, bruger to fluorescerende farvestoffer til at plette mitokondrier og lysosomer. Når mitofagi opstår, farves beskadigede eller overflødige mitokondrier opslugt af autofagosomer grønt af mitokondriefarvestoffet, mens det røde farvestof pletter lysosomerne. Fusionen af disse autofagosomer og lysosomer, kaldet autolysosomer, får den grønne og røde fluorescens til at overlappe og manifestere sig som gule prikker, hvilket indikerer forekomsten af mitofagi22. Det cellepermente mitokondriefarvestof (MitoTracker Green) indeholder en mildt thiol-reaktiv chlormethyldel til mærkning af mitokondrier23. For at mærke mitokondrier inkuberes celler simpelthen med farvestoffet, som diffunderer passivt over plasmamembranen og akkumuleres i aktive mitokondrier. Dette mitokondrifarvestof kan let plette levende celler og er mindre effektivt til farvning af aldehydfikserede eller døde celler. Lysosomfarvestoffet (LysoTracker Red) er en fluorescerende acidotrop sonde, der anvendes til mærkning og sporing af sure organeller i levende celler. Dette farvestof udviser en høj selektivitet for sure organeller og kan effektivt mærke levende celler ved nanomolære koncentrationer24.

Procedurerne for anvendelse af disse fluorescerende farvestoffer i levende celler, herunder indlæsning af farvestoffer og visualisering af mitokondrier og lysosomer, præsenteres her. Denne metode kan hjælpe forskere med at observere mitofagi ved hjælp af levende celle fluorescerende mikroskopi. Det kan også bruges til at kvantificere mitokondrier og lysosomer og vurdere mitokondriel morfologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellekultur og passaging

BEMÆRK: Protokollen er beskrevet ved hjælp af rutinemæssigt dyrkede museembryonale fibroblaster (MEF'er) som et eksempel.

  1. Kultur MEF-celler i 10 cm cellekulturretter med 10 ml Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM). Inkuberes ved 37 °C og 5% CO2 og overvåges cellerne under et mikroskop ved 100x forstørrelse.
  2. Udfør rutinemæssig cellepasning.
    1. Når cellerne når 80% -90% sammenløb (hver 3. dag), vaskes cellerne med 2 ml Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS). Tilsæt derefter 2 ml 0,05% trypsin-EDTA i 1 minut for at adskille cellerne, efterfulgt af 2 ml DMEM for at stoppe virkningen af trypsin-EDTA. Cellesuspensionen centrifugeres ved 100 x g i 3 minutter, og cellepelleten resuspenderes i 1 ml DMEM.
    2. Tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret celletæller og celletællingskammerdias (se Materialetabel), og pod derefter 1,5 x 106 celler i en ny 10 cm cellekulturskål indeholdende 10 ml DMEM.
  3. Til mitophagy-analysen fremstilles en cellesuspension som i trin 1.2.1. Cellesuspensionen fortyndes til 1 x 105 celler/ml i frisk DMEM.
  4. Tilsæt 2 ml af den fortyndede cellesuspension til en 20 mm konfokal skål (se Materialetabel) og ryst kulturskålen i et "kryds". Inkuber cellekulturskålen i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 24 timer.

2. Mitokondrie farvning

  1. Stamopløsningen aliquoterne af det grønfluorescerende mitokondriefarvestof og det rødfluorescerende lysosomfarvestof (se Materialeoversigten) fjernes fra fryseren -20 °C.
  2. Forbered arbejdsopløsninger af farvestofferne ved at fortynde stamopløsningerne 1:1.000 i DMEM og bland godt. For eksempel tilsættes 2 μL hver af 1 mM mitokondriefarvestof og lysosomfarvestof til 2 ml DMEM for at opnå en arbejdskoncentration på 1 μM for begge farvestoffer.
  3. Fjern mediet fra den konfokale kulturskål (trin 1.4). Der tilsættes 1 ml farvningsopløsning (fremstillet i trin 2.2) for at dække cellerne. Cellekulturskålen anbringes i en inkubator ved 37 °C, 5% CO2 i 20-30 min.

3. Konfokal billeddannelse

  1. Der opstilles 1 liter Krebs-Henseleit (KH) buffer (138,2 mM NaCl, 3,7 mM KCl, 0,25 mM CaCl 2, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4,7H2O, 15 mM glucose og 21,85 mM HEPES;endelig pH 7,4) og opbevares ved4 °C (i op til 1 måned).
  2. På dagen for konfokal billeddannelse skal du fjerne KH-bufferen fra køleskabet på forhånd og forvarme den til stuetemperatur (20 til 25 °C).
  3. Indstil parametrene for den konfokale mikroskopibilleddannelsessoftware (se Materialetabel): For dobbelte excitationsbilleder skal du bruge sekventiel excitation ved 488 nm og 543 nm og indsamle emission ved henholdsvis 505-545 nm og >560 nm.
    BEMÆRK: Indstil billedindstillingerne som følger. Scanningstilstand: ramme; Hastighed: 9; Gennemsnit: antal, 1; Gevinst: 450 til 600; Pinhole: 30 til 200; laser: <10%. Det er bedst at starte billedbehandlingssoftwaren først og derefter tænde 488 nm laseren helt. 543 nm laseren skal tændes og stabiliseres i 3-5 minutter før brug (figur 1A).
  4. Fjern dyrkningsmediet, der indeholder farvestoffet, fra inkubatoren (trin 2.3) og tilsæt 1 ml KH-buffer til skålen.
  5. For at inducere mitofagi behandles cellerne med carbonylcyanid-4-(trifluormethoxy) phenylhydrazon (FCCP) ved 1 μM (endelig koncentration) i KH-buffer i 10 minutter ved stuetemperatur, og fortsæt straks med at afbilde cellerne ved hjælp af det konfokale mikroskop.
  6. Påfør en passende mængde olie på toppen af 63x olielinsen (se Materialetabel). Celleprøven anbringes på prøvestadiet af det konfokale mikroskop, og flyt den direkte over objektivlinsen.
  7. Brug billedbehandlingssoftwaren til at finde eksemplet ved at klikke på fanen Find i øverste venstre hjørne af softwaregrænsefladen (figur 1B). Vælg et grønt filtersæt til eksperimentet.
  8. Brug den grove justeringsknap til hurtigt at fokusere ved at flytte objektivet op og ned. Når celleprøven er tydeligt synlig gennem okularet, skal du søge og fokusere området for enkeltceller og flytte det til midten af synsfeltet.
  9. Klik på fanen Anskaffelse i øverste venstre hjørne i softwaregrænsefladen for at hente billeder. Vælg kun 488 nm-kanalen og rammeopløsningen 1024 x 1024 for at få vist en forhåndsvisning.
  10. Klik på fanen Live i øverste venstre hjørne for at starte en live scanning. Juster synsfeltet til det skarpeste, og juster lasereffekten ved at flytte skyderen til venstre eller højre (figur 1A). Hold forstærkningsindstillingen under 600 for at undgå overeksponering.
  11. Juster pinhole-værdien til 156, gain value til 545 og digital offset value til 0.
  12. Vælg det bedste synsfelt, kontroller de to kanaler (488 nm og 543 nm), og vælg rammeopløsningen 1024 x 1024. Klik på Fastgør for at hente 2D-billeder. Gem de erhvervede billeder.
    BEMÆRK: Det grønne mitokondrifarvestof har en excitationstop ved 490 nm og en emissionstop ved 516 nm; Det kan ophidses ved hjælp af en 488 nm laser. Det røde lysosomfarvestof har en excitationstop ved 576 nm og en emissionstop ved 590 nm; Det kan ophidses ved hjælp af en 543 nm laser.

4. Billedanalyse

  1. Åbn det gemte billede med ImageJ, og importer det flettede billede til det.
  2. Tæl manuelt antallet af gule prikker i hver celle, hvilket indikerer, at lysosomet opsluger mitokondrier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MitoTracker Green er en grøn-fluorescerende mitokondrieplet, der er i stand til nøjagtigt at lokalisere til mitokondrier. Farvestoffet kan let plette levende celler og er mindre effektivt til farvning af aldehydfikserede eller døde celler (figur 2). Det rød-fluorescerende lysosomfarvestof LysoTracker Red er i stand til at mærke og spore sure lysosomale organeller og kan kun plette levende celler (figur 2). Konfokal mikroskopbilleddannelse muliggør visualisering af mitokondrier og lysosomer farvet med de passende farvestoffer (figur 1 og figur 2).

Mitofagi er en katabolisk cellulær proces, der selektivt nedbryder mitokondrier ved autofagi, som normalt forekommer i beskadigede mitokondrier efter skade, aldring eller stress20. Derefter leveres disse mitokondrier til lysosomer til nedbrydning. Mitofagi hjælper med at opretholde mængden og kvaliteten af mitokondrier i en sund tilstand i en bred vifte af celletyper. I raske pattedyrceller forekommer mitofagi sjældent, og derfor kræves andre stimuli for at inducere denne proces25. Carbonylcyanid-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazon (FCCP), en mitokondrieafkobling, er en uspecifik ionofor, der forårsager et alvorligt tab af mitokondriemembranpotentiale inden for få minutter, ændring af intracellulær pH og efterfølgende mitofagi26,27. I denne undersøgelse blev FCCP brugt til at udløse mitofagi i MEF-celler til konfokal billeddannelse. Når beskadigede grønfarvede mitokondrier opsluges af rødfarvede lysosomer, overlapper den grønne og røde fluorescens hinanden for at afsløre gule co-lokaliserede mitokondrier-lysosomer (figur 3). De gule prikker i figur 3D og figur 4B svarer til disse co-lokaliserede mitokondrier-lysosomer, der repræsenterer igangværende mitofagi, og kan således tælles for at evaluere omfanget af mitofagi (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Billeddannelsesparametre for den konfokale mikroskopibilleddannelsessoftware. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Skematisk illustration af konfokal billeddannelse af levende celler. De levende celler farves sammen med det grøn-fluorescerende mitokondriefarvestof og rødfluorescerende lysosomalt farvestof, og derefter afbildes de levende celler ved hjælp af konfokal mikroskopi. Billedbehandling og dataanalyse blev udført ved hjælp af den mikroskop-associerede billedbehandlingssoftware eller Image J. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Konfokal billeddannelse af levende celler. (A) Repræsentative billeder af celler farvet med det grønfluorescerende mitokondrifarvestof viser mitokondrierne. (B) Repræsentative billeder af celler farvet med det rød-fluorescerende lysosomfarvestof, der viser lysosomet. (C) Flettet billede af begge fluorescerende farvestoffer. (D) Udvidet område, der viser mitofagi. Den hvide pil angiver grønne mitokondrier opslugt af røde lysosomer. Forkortelse: Ex = excitation bølgelængde. Det grøn-fluorescerende mitokondrifarvestof er ophidset ved 488 nm med emission opsamlet ved 505-545 nm. Det rød-fluorescerende lysosomfarvestof ophidses ved 543 nm med emission opsamlet ved >560 nm. Skalabjælker = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Mitofagi udløst af FCCP-stimulering. (A) Repræsentative billeder af celler, der er co-farvet med det grøn-fluorescerende mitokondrifarvestof og det rød-fluorescerende lysosomfarvestof. (B) Repræsentative billeder af celler behandlet med 1 μM FCCP i 10 min. Den hvide pil angiver grønne mitokondrier opslugt af røde lysosomer. (C) Kvantitative data for mitofagi indikeret ved lysosomal-mitokondrier overlay. Data er gennemsnitlige ± SEM, n = 8 celler. *p < 0,05 versus kontrol. Skalabjælker = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her giver en metode til evaluering og overvågning af den dynamiske proces af mitofagi i levende celler, der involverer autofagosomer, lysosomer og mitokondriefission gennem co-farvning med cellepermeant mitokondrier og lysosomfarvestoffer. Metoden kan også bruges til at identificere mitokondrier og vurdere mitokondriel morfologi. Begge farvestoffer, der anvendes i denne undersøgelse, bør beskyttes mod lys, flere fryse-optøningscyklusser bør undgås, og farvestofferne bør så vidt muligt opbevares i engangsalikvoter. Det anbefales at forberede arbejdsopløsninger af farvestofferne for at undgå at tilføje dem direkte til cellekulturmediet, hvilket kan resultere i høje lokale koncentrationer og utilstrækkelig blanding af farvestofferne. For at undgå farvning af andre cellulære strukturer skal MEF-cellerne farves i 30 minutter før billeddannelse med det konfokale mikroskop. Det anbefales at udføre farvningsproceduren umiddelbart før billeddannelse. I MEF-celler er både mitokondrier og lysosomfarvestoffer ved 1 μM godt lokaliseret i henholdsvis mitokondrier og lysosomer med højere farvestofkoncentrationer, hvilket resulterer i cytotoksicitet såvel som uspecifik farvning af andre cellulære strukturer. Denne koncentration er også optimal til farvning af mitokondrier og lysosomer i H9C2-celler. For andre cellelinjer skal farvestofkoncentrationen og farvningstiden, der gør det muligt for farvestoffet at lokalisere godt til organellerne, optimeres. For at opnå klare billeder af mitokondrier og lysosomer skal billedindsamlingsparametrene (se noten i trin 3.3) justeres samvittighedsfuldt. Cellesammenløb ved 50%-60% er afgørende for at opnå individuelle levende cellebilleder, og derfor skal celler tælles før såning. Hvis laboratoriet ikke har konfokale retter, kan cirkulære dækslips bruges som et alternativ. I nogle dyreforsøg, især i kliniske undersøgelser, er det vanskeligt at opdage mitofagi i levende vævsprøver fra dyr på grund af manglen på pålidelige og bekvemme kvantitative eksperimenter til undersøgelse af mitofagi. Ikke desto mindre kan mitofagi i celler isoleret fra dyrevæv vurderes ved hjælp af protokollen beskrevet her. En begrænsning ved denne metode er, at selvom begge farvestoffer let kan plette levende celler, er de mindre effektive til farvning af døde eller aldehydfikserede celler.

Ud over de farvestoffer, der anvendes i denne undersøgelse, er andre mitokondrier og lysosomsporstoffer, såsom henholdsvis MitoMM1/2 og LysoKK, i øjeblikket tilgængelige for forskere til evaluering af mitofagi28,29. Mens MitoMM1/2 kan plette mitokondrier i paraformaldehydfikserede celler eller væv, kan det ikke direkte vurdere mitofagi og kræver dobbeltfarvning med et specifikt antistof, såsom anti-LC3B, for at detektere mitofagi. Da LysoKK kun kan plette levende celler, kan kombinationen af disse farvestoffer også kun detektere mitokondrie autofagi i levende celler28,29. Ikke desto mindre er MitoMM1/2 nem at bruge og tillader brug af TRITC-filter (da det ikke viser excitation, når du bruger en blå laser og ikke producerer grøn emission). LysoKK kan plette organeller inden for 5 minutter, hvilket letter hurtig overvågning og vurdering af adskillige stimuli28,29.

Mitofagi forekommer i celler via en kompleks mekanisme, som induceres af forskellige cellulære stresssignaler og udviklingsændringer. FCCP, en potent afkobling af mitokondriel oxidativ phosphorylering, er en uspecifik ionophore26, der blev brugt til at inducere mitofagi i denne undersøgelse. FCCP (1 μM) interfererer med protongradienten ved at transportere protoner over den indre mitokondriemembran, en proces, der forårsager en ændring i intracellulær pH. FCCP kan således forårsage et alvorligt tab af mitokondriemembranpotentiale inden for få minutter og derefter inducere mitokondrie autofagi ved at rekruttere Parkin og mikrotubuli-associeret proteinlyskæde 3 (LC3) til mitokondrierne26,27,30. Mitofagi regulatoriske veje er klassificeret som ubiquitin-afhængige (PINK1-parkin-medieret) eller receptorafhængige (medieret af LC3 og andre receptorer)15,16. Mitofagi er blevet undersøgt ved anvendelse af specifikke antistoffer, der binder til nøglemolekyler i den receptorafhængige autofagiske vej, såsom LC3B, efterfulgt af co-farvning med rødt fluorescerende lysosomfarvestof31,32. Selvom det er vanskeligt at skelne mellem disse to veje ved hjælp af de farvestoffer, der anvendes i denne protokol, tilbyder de en simpel metode til at evaluere omfanget af mitofagi i levende celler og vurdere mitokondriel morfologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist finansieret af National Key Research and Development Program of China (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), National Natural Science Foundation of China (81970333,31901044,) og programmet for professor i særlig udnævnelse ved Shanghai Institutions of Higher Learning (GZ2020008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated cell counter Countstar IC1000
Cell counting chamber slides Countstar 12-0005-50
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Corning 10-013-CV
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Corning 21-031-CVC
Glass bottom cell culture dish (confocal dish) NEST 801002
Image J (Rasband, NIH) NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit(KHB) buffer Self-prepared
LysoTracker Red Invitrogen 1818430 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye
MitoTracker Green Invitrogen 1842298 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye
Mouse Embryonic Fibroblasts Self-prepared
Objective (63x oil lens) ZEISS ZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25% Gibico Cat# 25200056
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope ZEISS ZEISS LSM 880
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) ZEISS ZEN 2.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
  2. Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
  3. Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
  4. Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).
  5. Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
  6. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  7. Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
  8. Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
  9. Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).
  10. Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
  11. Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
  12. Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).
  13. Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).
  14. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
  15. Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
  16. Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
  17. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  18. Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
  19. Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
  20. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
  21. Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
  22. Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
  23. Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
  24. Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
  25. Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
  26. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
  27. Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
  28. Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
  29. Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
  30. Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
  31. Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
  32. Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).

Tags

Biologi udgave 189
Visualisering af mitofagi med fluorescerende farvestoffer til mitokondrier og lysosomer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, B., Li, A., Qin, Y., Chen, L.,… More

Liu, B., Li, A., Qin, Y., Chen, L., Gao, M., Gong, G. Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome. J. Vis. Exp. (189), e64647, doi:10.3791/64647 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter