Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering av mitofagi med fluorescerende fargestoffer for mitokondrier og lysosom

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64647
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1, 1, 1,2
1Institute for Regenerative Medicine, Shanghai East Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 3Department of Pharmacy, Shanghai East Hospital, Tongji University

Summary

Mitophagy er den primære mekanismen for mitokondriell kvalitetskontroll. Evalueringen av mitofagi in vivo hindres imidlertid av mangelen på pålitelige kvantitative analyser. Presentert her er en protokoll for observasjon av mitophagy i levende celler ved hjelp av et celle-permeant grønn-fluorescerende mitokondrier fargestoff og en rød-fluorescerende lysosom fargestoff.

Abstract

Mitokondrier, som er cellens kraftverk, spiller viktige roller i bioenergetikk, generering av frie radikaler, kalsiumhomeostase og apoptose. Mitofagi er den primære mekanismen for mitokondriell kvalitetskontroll og studeres vanligvis ved hjelp av mikroskopisk observasjon, men in vivo mitophagy-analyser er vanskelige å utføre. Evaluering av mitofagi ved å avbilde levende organeller er en alternativ og nødvendig metode for mitokondriell forskning. Denne protokollen beskriver prosedyrene for bruk av celle-permeant grønn-fluorescerende mitokondrier fargestoff MitoTracker Green og rød-fluorescerende lysosom fargestoff LysoTracker Red i levende celler, inkludert lasting av fargestoffer, visualisering av mitokondrier og lysosom, og forventede resultater. Detaljerte trinn for evaluering av mitofagi i levende celler, samt tekniske notater om mikroskopprogramvareinnstillinger, er også gitt. Denne metoden kan hjelpe forskere med å observere mitofagi ved hjelp av levende cellefluorescerende mikroskopi. I tillegg kan den brukes til å kvantifisere mitokondrier og lysosomer og vurdere mitokondriell morfologi.

Introduction

Mitokondrier er kraftverkene til nesten alle eukaryote celler 1,2. I tillegg til ATP-produksjon gjennom oksidativ fosforylering, spiller mitokondrier en viktig rolle i andre prosesser som bioenergetikk, kalsiumhomeostase, generering av frie radikaler, apoptose og cellulær homeostase 3,4,5. Som mitokondrier genererer reaktive oksygenarter (ROS) fra flere komplekser i elektrontransportkjeden, blir de stadig stimulert av potensielt oksidativt stress, noe som til slutt kan føre til strukturell skade og dysfunksjon når antioksidantforsvaret kollapser 6,7. Mitokondriell dysfunksjon har vist seg å bidra til mange sykdommer, inkludert metabolske forstyrrelser, nevrodegenerasjon og kardiovaskulær sykdom8. Derfor er det avgjørende å opprettholde sunne mitokondrielle populasjoner og deres riktige funksjon. Mitokondrier er svært plastiske og dynamiske organeller; deres morfologi og funksjon styres av mitokondrielle kvalitetskontrollmekanismer, inkludert posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM) av mitokondrielle proteiner, mitokondriell biogenese, fusjon, fisjon og mitophagy 9,10. Mitokondriell fisjon mediert av dynaminrelatert protein 1 (DRP1), en GTPase av dynamin-superfamilien av proteiner, resulterer i små og runde mitokondrier og isolerer de dysfunksjonelle mitokondriene, som kan fjernes og nedbrytes av mitofagi11,12.

Mitophagy er en cellulær prosess som selektivt nedbryter mitokondrier ved autofagi, som vanligvis forekommer i skadede mitokondrier etter skade, aldring eller stress. Deretter leveres disse mitokondriene til lysosomer for nedbrytning10. Dermed er mitofagi en katabolsk prosess som bidrar til å opprettholde mengden og kvaliteten på mitokondrier i en sunn tilstand i et bredt spekter av celletyper. Det spiller en avgjørende rolle i restaureringen av cellulær homeostase under normale fysiologiske og stressforhold13,14. Celler er preget av en kompleks mitofagimekanisme, som induseres av forskjellige signaler om cellulær stress og utviklingsendringer. Mitophagy regulatoriske veier er klassifisert som ubiquitin-avhengige eller reseptoravhengige15,16; den ubiquitinavhengige autofagien medieres av kinase PINK1 og rekrutteringen av ubiquitinligase Parkin E3 til mitokondriene 17,18, mens reseptoravhengig autofagi innebærer binding av autofagireseptorer til den mikrotubuli-assosierte proteinlyskjeden LC3 som formidler mitofagi som respons på mitokondriell skade19.

Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) er den mest brukte metoden, og fortsatt en av de beste metodene, for å observere og oppdage mitofagi20. De morfologiske egenskapene til mitofagi er autofagosomer eller autolysosomer dannet ved fusjon av autofagosomer med lysosomer, som kan observeres fra elektronmikroskopibilder21. Svakheten ved elektronmikroskopi (EM) er imidlertid manglende evne til å overvåke de dynamiske prosessene for mitofagi, som mitokondriell depolarisering, mitokondriell fisjon og fusjon av autofagosomer og lysosomer, i levende celle20. Dermed er evaluering av mitofagi gjennom avbildning av levende organeller en attraktiv alternativ metode for mitokondriell forskning. Levende celleavbildningsteknikken beskrevet her bruker to fluorescerende fargestoffer for å flekke mitokondrier og lysosomer. Når mitofagi oppstår, blir skadede eller overflødige mitokondrier oppslukt av autofagosomer farget grønt av mitokondrielt fargestoff, mens det røde fargestoffet flekker lysosomene. Fusjonen av disse autofagosomer og lysosomer, referert til som autolysosomer, fører til at grønn og rød fluorescens overlapper og manifesterer seg som gule prikker, og indikerer dermed forekomsten av mitophagy22. Den celle-permeant mitokondrier fargestoff (MitoTracker Green) inneholder en mildt tiol-reaktiv klormetyl del å merke mitokondrier23. For å merke mitokondrier inkuberes celler ganske enkelt med fargestoffet, som diffunderer passivt over plasmamembranen og akkumuleres i aktive mitokondrier. Dette mitokondrierfargestoffet kan lett flekke levende celler, og er mindre effektivt i farging av aldehydfaste eller døde celler. Lysosomfargestoffet (LysoTracker Red) er en fluorescerende acidotrop sonde som brukes til merking og sporing av sure organeller i levende celler. Dette fargestoffet utviser en høy selektivitet for sure organeller og kan effektivt merke levende celler ved nanomolare konsentrasjoner24.

Prosedyrene for bruk av disse fluorescerende fargestoffene i levende celler, inkludert lasting av fargestoffer og visualisering av mitokondrier og lysosomer, presenteres her. Denne metoden kan hjelpe forskere med å observere mitofagi ved hjelp av levende cellefluorescerende mikroskopi. Det kan også brukes til å kvantifisere mitokondrier og lysosomer, og vurdere mitokondriell morfologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellekultur og passasje

MERK: Protokollen er beskrevet ved hjelp av rutinemessig dyrkede mus embryonale fibroblaster (MEFs) som et eksempel.

  1. Kultur MEF-celler i 10 cm cellekulturretter med 10 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM). Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 og overvåk cellene under et mikroskop ved 100x forstørrelse.
  2. Utfør rutinemessig cellepassasje.
    1. Når cellene når 80% -90% sammenløp (hver 3. dag), vask cellene med 2 ml Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS). Tilsett deretter 2 ml 0,05% trypsin-EDTA i 1 minutt for å dissosiere cellene, etterfulgt av 2 ml DMEM for å stoppe virkningen av trypsin-EDTA. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 100 x g i 3 minutter og resuspenderer cellepelleten i 1 ml DMEM.
    2. Tell cellene ved hjelp av en automatisert celleteller og celletellingskammer (se tabell over materialer), og inokuler deretter 1,5 x 106 celler til en ny 10 cm cellekulturskål som inneholder 10 ml DMEM.
  3. For mitofagianalysen, lag en cellesuspensjon som i trinn 1.2.1. Fortynn cellesuspensjonen til 1 x 105 celler/ml i fersk DMEM.
  4. Tilsett 2 ml av den fortynnede cellesuspensjonen til en 20 mm konfokal tallerken (se materialtabell) og rist kulturskålen i et "kryss". Inkuber cellekulturskålen i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 24 timer.

2. Mitokondriell farging

  1. Fjern stamløsningen aliquots av det grønnfluorescerende mitokondrielle fargestoffet og rødfluorescerende lysosomfargestoffet (se materialtabell) fra fryseren på -20 °C.
  2. Forbered arbeidsløsninger av fargestoffene ved å fortynne lagerløsningene 1: 1000 i DMEM og bland godt. Tilsett for eksempel 2 μL hver av 1 mM mitokondrielt fargestoff og lysosomfargestoff til 2 ml DMEM for å oppnå en arbeidskonsentrasjon på 1 μM for begge fargestoffene.
  3. Fjern mediet fra den konfokale kulturskålen (trinn 1.4). Tilsett 1 ml av fargeløsningen (fremstilt i trinn 2.2) for å dekke cellene. Plasser cellekulturskålen i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 i 20-30 minutter.

3. Konfokal avbildning

  1. Forbered 1 L Krebs-Henseleit (KH) buffer (138,2 mM NaCl, 3,7 mM KCl, 0,25 mM CaCl 2, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4,7H2O, 15 mM glukose og 21,85 mM HEPES; endeligpH 7,4) og oppbevares ved4 °C (i opptil 1 måned).
  2. På dagen for konfokal avbildning, fjern KH-bufferen fra kjøleskapet på forhånd og forvarm den til romtemperatur (20 til 25 ° C).
  3. Still inn parametrene for programvaren for konfokal mikroskopiavbildning (se materialtabell): For doble eksitasjonsbilder, bruk sekvensiell eksitasjon ved henholdsvis 488 nm og 543 nm, og samle utslipp ved henholdsvis 505-545 nm og >560 nm.
    MERK: Angi bildeinnstillingene som følger. Skannemodus: ramme; Hastighet: 9; Gjennomsnitt: antall, 1; Gevinst: 450 til 600; Pinhole: 30 til 200; laser: <10%. Det er best å starte bildebehandlingsprogramvaren først og deretter slå på 488 nm laseren helt. 543 nm laseren må slås på og stabiliseres i 3-5 minutter før bruk (figur 1A).
  4. Fjern kulturmediet som inneholder fargestoffet fra inkubatoren (trinn 2.3) og tilsett 1 ml KH-buffer til parabolen.
  5. For å indusere mitofagi, behandle cellene med karbonylcyanid-4- (trifluormetoksy) fenylhydrazon (FCCP) ved 1 μM (endelig konsentrasjon) i KH-buffer i 10 minutter ved romtemperatur, og fortsett umiddelbart å avbilde cellene ved hjelp av konfokalmikroskopet.
  6. Påfør en passende mengde olje på toppen av 63x oljelinsen (se materialtabell). Plasser celleprøven på prøvetrinnet i det konfokale mikroskopet og flytt den rett over objektivlinsen.
  7. Bruk bildebehandlingsprogramvaren til å finne eksemplet ved å klikke på Finn øverst til venstre i programvaregrensesnittet (figur 1B). Velg et grønt filtersett for eksperimentet.
  8. Bruk grovjusteringsknappen til å fokusere raskt ved å flytte objektivlinsen opp og ned. Etter at celleprøven er tydelig synlig gjennom okularet, søk og fokuser området av enkeltceller og flytt det til midten av synsfeltet.
  9. Klikk på fanen Anskaffelse øverst til venstre i programvaregrensesnittet for å skaffe bilder. Velg bare 488 nm-kanalen og bildeoppløsningen 1024 x 1024 for forhåndsvisning.
  10. Klikk på Live-fanen øverst til venstre for å starte en live skanning. Juster synsfeltet til det skarpeste, og juster lasereffekten ved å flytte glidebryteren til venstre eller høyre (figur 1A). Hold forsterkningsinnstillingen under 600 for å unngå overeksponering.
  11. Juster nålehullsverdien til 156, forsterkningsverdi til 545 og digital forskyvningsverdi til 0.
  12. Velg det beste synsfeltet, sjekk de to kanalene (488 nm og 543 nm), og velg rammeoppløsningen 1024 x 1024. Klikk på Fest for å hente 2D-bilder. Lagre de hentede bildene.
    MERK: Det grønne mitokondriefargestoffet har en eksitasjonstopp på 490 nm og en utslippstopp på 516 nm; Den kan begeistre ved hjelp av en 488 nm laser. Det røde lysosomfargestoffet har en eksitasjonstopp på 576 nm og en utslippstopp på 590 nm; Den kan begeistre ved hjelp av en 543 nm laser.

4. Bildeanalyse

  1. Åpne det lagrede bildet med ImageJ og importer det sammenslåtte bildet til det.
  2. Tell manuelt antall gule prikker i hver celle, noe som indikerer at lysosomet oppsluker mitokondrier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MitoTracker Green er en grønn-fluorescerende mitokondriell flekk som er i stand til å lokalisere nøyaktig til mitokondrier. Fargestoffet kan lett farge levende celler og er mindre effektivt i farging av aldehydfaste eller døde celler (figur 2). Det rødfluorescerende lysosomfargestoffet LysoTracker Red er i stand til å merke og spore sure lysosomale organeller og kan bare flekke levende celler (figur 2). Konfokalmikroskopavbildning tillater visualisering av mitokondrier og lysosomer farget med passende fargestoffer (figur 1 og figur 2).

Mitophagy er en katabolsk cellulær prosess som selektivt nedbryter mitokondrier ved autofagi, som vanligvis oppstår i skadede mitokondrier etter skade, aldring eller stress20. Deretter leveres disse mitokondriene til lysosomer for nedbrytning. Mitophagy bidrar til å opprettholde mengden og kvaliteten på mitokondrier i en sunn tilstand i et bredt spekter av celletyper. I friske pattedyrceller forekommer mitofagi sjelden, og derfor er det nødvendig med andre stimuli for å indusere denne prosessen25. Karbonylcyanid-4 (trifluormetoksy) fenylhydrason (FCCP), en mitokondriell frakobling, er en ikke-spesifikk ionofor som forårsaker et alvorlig tap av mitokondriell membranpotensial i løpet av få minutter, endring av intracellulær pH og påfølgende mitophagy26,27. I denne studien ble FCCP brukt til å utløse mitofagi i MEF-celler for konfokal avbildning. Når skadede grønnfargede mitokondrier oppslukes av rødfargede lysosomer, overlapper den grønne og røde fluorescensen for å avsløre gule samlokaliserte mitokondrier-lysosomer (figur 3). De gule prikkene i figur 3D og figur 4B tilsvarer disse samlokaliserte mitokondriene-lysosomene, som representerer pågående mitofagi, og kan dermed telles for å evaluere omfanget av mitofagi (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Bildeparametere for programvaren for konfokal mikroskopiavbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk illustrasjon av konfokal avbildning av levende celler. De levende cellene er co-farget med grønn-fluorescerende mitokondrie fargestoff og rød-fluorescerende lysosomal fargestoff, og deretter levende celler er avbildet ved hjelp av konfokal mikroskopi. Bildebehandling og dataanalyse ble utført ved hjelp av den mikroskopassosierte bildebehandlingsprogramvaren eller Image J. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Konfokal avbildning av levende celler. (A) Representative bilder av celler farget med grønn-fluorescerende mitokondrier fargestoff viser mitokondriene. (B) Representative bilder av celler farget med det rødfluorescerende lysosomfargestoffet som viser lysosomet. (C) Sammenslått bilde av begge fluorescerende fargestoffer. (D) Utvidet område som viser mitophagy. Den hvite pilen indikerer grønne mitokondrier oppslukt av røde lysosomer. Forkortelse: ex = eksitasjonsbølgelengde. Den grønn-fluorescerende mitokondrier fargestoff er begeistret på 488 nm med utslipp samlet på 505-545 nm. Det rødfluorescerende lysosomfargestoffet er begeistret ved 543 nm med utslipp samlet ved >560 nm. Skala barer = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Mitofagi utløst av FCCP-stimulering . (A) Representative bilder av celler co-farget med grønn-fluorescerende mitokondrier fargestoff og rød-fluorescerende lysosom fargestoff. (B) Representative bilder av celler behandlet med 1 μM FCCP i 10 minutter. Den hvite pilen indikerer grønne mitokondrier oppslukt av røde lysosomer. (C) Kvantitative data for mitofagi indikert ved lysosomal-mitokondrieroverlegg. Data er gjennomsnitt ± SEM, n = 8 celler. *p < 0,05 mot kontroll. Skala barer = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her gir en metode for evaluering og overvåking av den dynamiske prosessen med mitofagi i levende celler, som involverer autofagosomer, lysosomer og mitokondriell fisjon, gjennom farging med cellepermeant mitokondrier og lysosomfarger. Metoden kan også brukes til å identifisere mitokondrier og vurdere mitokondriell morfologi. Begge fargestoffene som brukes i denne studien bør beskyttes mot lys, flere fryse-tine sykluser bør unngås, og fargestoffene bør lagres i engangsbruk aliquots så mye som mulig. Det anbefales å forberede arbeidsløsninger av fargestoffene for å unngå å legge dem direkte til cellekulturmediet, noe som kan føre til høye lokale konsentrasjoner og utilstrekkelig blanding av fargestoffene. For å unngå farging av andre cellulære strukturer, bør MEF-cellene farges i 30 minutter før avbildning med konfokalmikroskopet. Det anbefales å utføre fargeprosedyren umiddelbart før avbildning. I MEF-celler er både mitokondrier og lysosomfarger ved 1 μM godt lokalisert i henholdsvis mitokondrier og lysosomer, med høyere fargestoffkonsentrasjoner som resulterer i cytotoksisitet samt ikke-spesifikk farging av andre cellulære strukturer. Denne konsentrasjonen er også optimal for farging av mitokondrier og lysosomer i H9C2-celler. For andre cellelinjer må fargestoffkonsentrasjonen og fargetiden som gjør at fargestoffet kan lokaliseres godt til organellene, optimaliseres. For å få klare bilder av mitokondrier og lysosomer, må bildesamlingsparametrene (se notatet i trinn 3.3) justeres samvittighetsfullt. Cellekonfluens ved 50% -60% er avgjørende for å oppnå individuelle levende cellebilder, og derfor må celler telles før såing. Hvis laboratoriet ikke har konfokale retter, kan sirkulære coverslips brukes som et alternativ. I noen dyreforsøk, spesielt i kliniske undersøkelser, er det vanskelig å oppdage mitofagi i dyrelevende vevsprøver på grunn av mangel på pålitelige og praktiske kvantitative eksperimenter for å studere mitofagi. Likevel kan mitofagi i celler isolert fra animalsk vev vurderes ved hjelp av protokollen beskrevet her. En begrensning av denne metoden er at selv om begge fargestoffene lett kan flekke levende celler, er de mindre effektive i farging av døde eller aldehydfaste celler.

I tillegg til fargestoffene som ble brukt i denne studien, er andre mitokondrier og lysosomsporere, som henholdsvis MitoMM1/2 og LysoKK, for tiden tilgjengelige for forskere for evaluering av mitofagi28,29. Mens MitoMM1 / 2 kan flekke mitokondrier i paraformaldehydfaste celler eller vev, kan det ikke direkte vurdere mitofagi og krever dobbel farging med et spesifikt antistoff, for eksempel anti-LC3B, for å oppdage mitofagi. Siden LysoKK bare kan flekke levende celler, kan kombinasjonen av disse fargestoffene også bare oppdage mitokondriell autofagi i levende celler28,29. Likevel er MitoMM1 / 2 enkel å bruke og tillater bruk av TRITC-filter (da det ikke viser eksitasjon ved bruk av en blå laser og ikke produserer grønn utslipp). LysoKK kan flekke organeller innen 5 minutter, noe som letter rask overvåking og vurdering av mange stimuli28,29.

Mitofagi forekommer i celler via en kompleks mekanisme, som induseres av forskjellige cellulære stresssignaler og utviklingsendringer. FCCP, en potent frakobling av mitokondriell oksidativ fosforylering, er en ikke-spesifikk ionofor26 som ble brukt til å indusere mitofagi i denne studien. FCCP (1 μM) forstyrrer protongradienten ved å transportere protoner over den indre mitokondrielle membranen, en prosess som forårsaker endring i intracellulær pH. Dermed kan FCCP forårsake et alvorlig tap av mitokondriell membranpotensial i løpet av minutter og deretter indusere mitokondriell autofagi ved å rekruttere Parkin og mikrotubuliassosiert proteinlyskjede 3 (LC3) til mitokondriene26,27,30. Mitophagy regulatoriske veier er klassifisert som ubiquitin-avhengige (PINK1-parkinmedierte) eller reseptoravhengige (mediert av LC3 og andre reseptorer) 15,16. Mitophagy har blitt studert ved hjelp av spesifikke antistoffer som binder seg til nøkkelmolekyler i den reseptoravhengige autofagiske banen, for eksempel LC3B, etterfulgt av co-farging med rødt fluorescerende lysosomfargestoff31,32. Selv om det er vanskelig å skille mellom disse to veiene ved hjelp av fargestoffene som brukes i denne protokollen, tilbyr de en enkel metode for å evaluere omfanget av mitofagi i levende celler og vurdere mitokondriell morfologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis finansiert av National Key Research and Development Program of China (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), National Natural Science Foundation of China (81970333,31901044,), og programmet for professor i spesiell avtale ved Shanghai Institutions of Higher Learning (GZ2020008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated cell counter Countstar IC1000
Cell counting chamber slides Countstar 12-0005-50
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Corning 10-013-CV
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Corning 21-031-CVC
Glass bottom cell culture dish (confocal dish) NEST 801002
Image J (Rasband, NIH) NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit(KHB) buffer Self-prepared
LysoTracker Red Invitrogen 1818430 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye
MitoTracker Green Invitrogen 1842298 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye
Mouse Embryonic Fibroblasts Self-prepared
Objective (63x oil lens) ZEISS ZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25% Gibico Cat# 25200056
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope ZEISS ZEISS LSM 880
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) ZEISS ZEN 2.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
  2. Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
  3. Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
  4. Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).
  5. Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
  6. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  7. Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
  8. Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
  9. Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).
  10. Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
  11. Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
  12. Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).
  13. Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).
  14. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
  15. Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
  16. Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
  17. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  18. Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
  19. Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
  20. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
  21. Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
  22. Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
  23. Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
  24. Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
  25. Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
  26. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
  27. Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
  28. Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
  29. Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
  30. Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
  31. Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
  32. Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).

Tags

Biologi utgave 189
Visualisering av mitofagi med fluorescerende fargestoffer for mitokondrier og lysosom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, B., Li, A., Qin, Y., Chen, L.,… More

Liu, B., Li, A., Qin, Y., Chen, L., Gao, M., Gong, G. Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome. J. Vis. Exp. (189), e64647, doi:10.3791/64647 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter