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Biology

Visualización de la mitofagia con tintes fluorescentes para mitocondrias y lisosomas

Published: November 30, 2022 doi: 10.3791/64647
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1, 1, 1,2
1Institute for Regenerative Medicine, Shanghai East Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ministry of Education, School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 3Department of Pharmacy, Shanghai East Hospital, Tongji University

Summary

La mitofagia es el principal mecanismo de control de calidad mitocondrial. Sin embargo, la evaluación de la mitofagia in vivo se ve obstaculizada por la falta de ensayos cuantitativos fiables. Aquí se presenta un protocolo para la observación de la mitofagia en células vivas utilizando un colorante mitocondrial verde-fluorescente permean celular y un colorante lisosómico rojo-fluorescente.

Abstract

Las mitocondrias, al ser las centrales eléctricas de la célula, juegan un papel importante en la bioenergética, la generación de radicales libres, la homeostasis del calcio y la apoptosis. La mitofagia es el mecanismo primario del control de calidad mitocondrial y generalmente se estudia mediante observación microscópica, sin embargo, los ensayos de mitofagia in vivo son difíciles de realizar. La evaluación de la mitofagia mediante imágenes de orgánulos vivos es un método alternativo y necesario para la investigación mitocondrial. Este protocolo describe los procedimientos para usar el colorante mitocondrial verde-fluorescente permean celular MitoTracker Green y el colorante lisosómico rojo-fluorescente LysoTracker Red en células vivas, incluida la carga de los colorantes, la visualización de las mitocondrias y el lisosoma, y los resultados esperados. También se proporcionan pasos detallados para la evaluación de la mitofagia en células vivas, así como notas técnicas sobre la configuración del software del microscopio. Este método puede ayudar a los investigadores a observar la mitofagia utilizando microscopía fluorescente de células vivas. Además, se puede utilizar para cuantificar mitocondrias y lisosomas y evaluar la morfología mitocondrial.

Introduction

Las mitocondrias son las centrales eléctricas de casi todas las células eucariotas 1,2. Además de la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa, las mitocondrias juegan un papel vital en otros procesos como la bioenergética, la homeostasis del calcio, la generación de radicales libres, la apoptosis y la homeostasis celular 3,4,5. A medida que las mitocondrias generan especies reactivas de oxígeno (ROS) a partir de múltiples complejos en la cadena de transporte de electrones, son estimuladas constantemente por el estrés oxidativo potencial, que eventualmente puede conducir a daños estructurales y disfunción cuando el sistema de defensa antioxidante colapsa 6,7. Se ha encontrado que la disfunción mitocondrial contribuye a muchas enfermedades, incluidos los trastornos metabólicos, la neurodegeneración y las enfermedades cardiovasculares8. Por lo tanto, es crucial mantener poblaciones mitocondriales sanas y su función adecuada. Las mitocondrias son orgánulos altamente plásticos y dinámicos; su morfología y función están controladas por mecanismos de control de calidad mitocondrial, incluyendo modificaciones postraduccionales (PTM) de proteínas mitocondriales, biogénesis mitocondrial, fusión, fisión y mitofagia 9,10. La fisión mitocondrial mediada por la proteína 1 relacionada con la dinamina (DRP1), una GTPasa de la superfamilia de proteínas dinamina, da como resultado mitocondrias pequeñas y redondas y aísla las mitocondrias disfuncionales, que pueden ser eliminadas y degradadas por la mitofagia11,12.

La mitofagia es un proceso celular que degrada selectivamente las mitocondrias por autofagia, que generalmente ocurre en las mitocondrias dañadas después de una lesión, envejecimiento o estrés. Posteriormente, estas mitocondrias son entregadas a los lisosomas para su degradación10. Por lo tanto, la mitofagia es un proceso catabólico que ayuda a mantener la cantidad y calidad de las mitocondrias en un estado saludable en una amplia gama de tipos de células. Desempeña un papel crucial en la restauración de la homeostasis celular en condiciones fisiológicas y de estrés normales13,14. Las células se caracterizan por un complejo mecanismo de mitofagia, que es inducido por diferentes señales de estrés celular y cambios en el desarrollo. Las vías reguladoras de la mitofagia se clasifican como dependientes de ubiquitina o dependientes de receptores15,16; la autofagia dependiente de ubiquitina está mediada por la quinasa PINK1 y el reclutamiento de ubiquitina ligasa Parkin E3 a las mitocondrias 17,18, mientras que la autofagia dependiente del receptor implica la unión de los receptores de autofagia a la cadena ligera LC3 asociada a microtúbulos que media la mitofagia en respuesta al daño mitocondrial19.

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) es el método más utilizado, y sigue siendo uno de los mejores, para observar y detectar la mitofagia20. Las características morfológicas de la mitofagia son autofagosomas o autolisosomas formados por la fusión de autofagosomas con lisosomas, que pueden ser observados a partir de imágenes de microscopía electrónica21. La debilidad de la microscopía electrónica (EM), sin embargo, es la incapacidad de monitorear los procesos dinámicos de la mitofagia, como la despolarización mitocondrial, la fisión mitocondrial y la fusión de autofagosomas y lisosomas, en la célula viva20. Por lo tanto, la evaluación de la mitofagia a través de imágenes de orgánulos vivos es un método alternativo atractivo para la investigación mitocondrial. La técnica de imagen de células vivas descrita aquí utiliza dos tintes fluorescentes para teñir mitocondrias y lisosomas. Cuando ocurre la mitofagia, las mitocondrias dañadas o superfluas engullidas por autofagosomas se tiñen de verde por el tinte mitocondrial, mientras que el tinte rojo tiñe los lisosomas. La fusión de estos autofagosomas y lisosomas, denominados autolisosomas, hace que la fluorescencia verde y roja se superponga y se manifieste como puntos amarillos, indicando así la ocurrencia de mitofagia22. El colorante mitocondrial permean celular (MitoTracker Green) contiene una fracción clorometilo ligeramente reactiva al tiol para etiquetar las mitocondrias23. Para etiquetar las mitocondrias, las células simplemente se incuban con el tinte, que se difunde pasivamente a través de la membrana plasmática y se acumula en las mitocondrias activas. Este colorante mitocondrial puede teñir fácilmente las células vivas y es menos eficaz para teñir las células muertas o fijadas en aldehído. El colorante lisosómico (LysoTracker Red) es una sonda acidotrópica fluorescente utilizada para etiquetar y rastrear orgánulos ácidos en células vivas. Este colorante exhibe una alta selectividad para orgánulos ácidos y puede etiquetar eficazmente las células vivas a concentraciones nanomolares24.

Aquí se presentan los procedimientos para usar estos tintes fluorescentes en células vivas, incluida la carga de los tintes y la visualización de mitocondrias y lisosomas. Este método puede ayudar a los investigadores a observar la mitofagia utilizando microscopía fluorescente de células vivas. También se puede utilizar para cuantificar mitocondrias y lisosomas, y evaluar la morfología mitocondrial.

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Protocol

1. Cultivo celular y pasaging

NOTA: El protocolo se describe utilizando fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) cultivados rutinariamente como ejemplo.

  1. Cultive células MEF en placas de cultivo celular de 10 cm con 10 ml de medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco. Incubar a 37 °C y 5% deCO2 y monitorizar las células bajo un microscopio a un aumento de 100x.
  2. Realizar el paso celular de rutina.
    1. Cuando las células alcancen el 80% -90% de confluencia (cada 3 días), lave las células con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco. Luego agregue 2 ml de tripsina-EDTA al 0,05% durante 1 minuto para disociar las células, seguido de 2 ml de DMEM para detener la acción de la tripsina-EDTA. Centrifugar la suspensión celular a 100 x g durante 3 min y resuspender el pellet celular en 1 mL de DMEM.
    2. Cuente las células utilizando un contador de células automatizado y portaobjetos de cámara de conteo de células (consulte la Tabla de materiales) y luego inocule 1,5 x 106 células en una nueva placa de cultivo celular de 10 cm que contenga 10 ml de DMEM.
  3. Para el ensayo de mitofagia, preparar una suspensión celular como en el paso 1.2.1. Diluir la suspensión celular a 1 x 105 células/ml en DMEM fresco.
  4. Agregue 2 ml de la suspensión celular diluida a una placa confocal de 20 mm (consulte la Tabla de materiales) y agite la placa de cultivo en una "cruz". Incubar la placa de cultivo celular en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante 24 h.

2. Tinción mitocondrial

  1. Retirar las alícuotas de la solución madre del colorante mitocondrial verde-fluorescente y del colorante lisosómico rojo-fluorescente (ver tabla de materiales) del congelador a -20 °C.
  2. Preparar soluciones de trabajo de los colorantes diluyendo las soluciones madre 1:1.000 en DMEM y mezclar bien. Por ejemplo, agregue 2 μL de colorante mitocondrial de 1 mM y colorante lisosómico a 2 ml de DMEM para obtener una concentración de trabajo de 1 μM para ambos colorantes.
  3. Retire el medio de la placa de cultivo confocal (paso 1.4). Añadir 1 ml de la solución de tinción (preparada en el paso 2.2) para cubrir las células. Colocar la placa de cultivo celular en una incubadora a 37 °C, 5% deCO2 durante 20-30 min.

3. Imágenes confocales

  1. Preparar 1 L de tampón de Krebs-Henseleit (KH) (138,2 mM de NaCl, 3,7 mM de KCl, 0,25 mM de CaCl 2, 1,2 mM KH 2 PO 4,1,2 mM de MgSO 4,7H2 O, 15 mM de glucosa y 21,85 mM de HEPES; pH final 7,4) y conservar a4 °C (hasta 1 mes).
  2. El día de la toma de imágenes confocales, retire el tampón KH del refrigerador con anticipación y precaliéntelo a temperatura ambiente (20 a 25 °C).
  3. Establezca los parámetros del software de imágenes de microscopía confocal (consulte la Tabla de materiales): Para imágenes de excitación dual, use excitación secuencial a 488 nm y 543 nm, y recopile la emisión a 505-545 nm y >560 nm, respectivamente.
    NOTA: Establezca la configuración de imágenes de la siguiente manera. Modo de escaneo: marco; Velocidad: 9; Promedio: número, 1; Ganancia: 450 a 600; Estenopeico: 30 a 200; Láser: <10%. Es mejor iniciar primero el software de imágenes y luego encender completamente el láser de 488 nm. El láser de 543 nm debe encenderse y estabilizarse durante 3-5 minutos antes de su uso (Figura 1A).
  4. Retire el medio de cultivo que contiene el colorante de la incubadora (paso 2.3) y añada 1 ml de tampón KH al plato.
  5. Para inducir la mitofagia, tratar las células con cianuro de carbonilo-4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) a 1 μM (concentración final) en tampón KH durante 10 minutos a temperatura ambiente, e inmediatamente proceder a obtener imágenes de las células utilizando el microscopio confocal.
  6. Aplique una cantidad adecuada de aceite en la parte superior de la lente de aceite 63x (consulte la Tabla de materiales). Coloque la muestra de células en la etapa de muestra del microscopio confocal y muévala directamente por encima de la lente del objetivo.
  7. Utilice el software de imágenes para encontrar la muestra haciendo clic en la pestaña Localizar en la esquina superior izquierda de la interfaz del software (Figura 1B). Seleccione un conjunto de filtros verdes para el experimento.
  8. Utilice la perilla de ajuste gruesa para enfocar rápidamente moviendo la lente del objetivo hacia arriba y hacia abajo. Después de que la muestra de células sea claramente visible a través del ocular, busque y enfoque el área de celdas individuales y muévala al centro del campo de visión.
  9. Haga clic en la pestaña Adquisición en la esquina superior izquierda de la interfaz del software para adquirir imágenes. Seleccione sólo el canal de 488 nm y la resolución de fotogramas 1024 x 1024 para la vista previa.
  10. Haga clic en la pestaña En vivo en la esquina superior izquierda para iniciar un escaneo en vivo . Ajuste el campo de visión al máximo y ajuste la potencia del láser moviendo el control deslizante hacia la izquierda o hacia la derecha (Figura 1A). Mantenga el ajuste de ganancia por debajo de 600 para evitar la sobreexposición.
  11. Ajuste el valor estenopeico a 156, el valor de ganancia a 545 y el valor de desplazamiento digital a 0.
  12. Seleccione el mejor campo de visión, compruebe los dos canales (488 nm y 543 nm) y elija la resolución de fotogramas 1024 x 1024. Haga clic en Ajustar para adquirir imágenes 2D. Guarde las imágenes adquiridas.
    NOTA: El colorante verde de las mitocondrias tiene un pico de excitación a 490 nm y un pico de emisión a 516 nm; Se puede excitar usando un láser de 488 nm. El colorante lisosómico rojo tiene un pico de excitación a 576 nm y un pico de emisión a 590 nm; Se puede excitar usando un láser de 543 nm.

4. Análisis de imágenes

  1. Abra la imagen guardada con ImageJ e importe la imagen combinada en ella.
  2. Cuente manualmente el número de puntos amarillos en cada celda, que indican que el lisosoma está envolviendo a las mitocondrias.

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Representative Results

MitoTracker Green es una tinción mitocondrial verde-fluorescente que es capaz de localizar con precisión las mitocondrias. El colorante puede teñir fácilmente las células vivas y es menos eficaz para teñir las células muertas o fijadas en aldehído (Figura 2). El colorante lisosómico rojo-fluorescente LysoTracker Red es capaz de etiquetar y rastrear orgánulos lisosomales ácidos y solo puede teñir células vivas (Figura 2). La imagen del microscopio confocal permite la visualización de mitocondrias y lisosomas teñidos con los tintes apropiados (Figura 1 y Figura 2).

La mitofagia es un proceso celular catabólico que degrada selectivamente las mitocondrias por autofagia, que generalmente ocurre en las mitocondrias dañadas después de una lesión, envejecimiento o estrés20. Posteriormente, estas mitocondrias se entregan a los lisosomas para su degradación. La mitofagia ayuda a mantener la cantidad y calidad de las mitocondrias en un estado saludable en una amplia gama de tipos de células. En las células sanas de mamíferos, la mitofagia ocurre con poca frecuencia, y por lo tanto se requieren otros estímulos para inducir este proceso25. El cianuro de carbonilo-4 (trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP), un desacoplador mitocondrial, es un ionóforo inespecífico que causa una pérdida severa del potencial de la membrana mitocondrial en cuestión de minutos, alteración del pH intracelular y posterior mitofagia26,27. En este estudio, FCCP se utilizó para desencadenar la mitofagia en células MEF para imágenes confocales. Cuando las mitocondrias dañadas teñidas de verde son engullidas por lisosomas teñidos de rojo, la fluorescencia verde y roja se superponen para revelar mitocondrias-lisosomas colocalizados amarillos (Figura 3). Los puntos amarillos en la Figura 3D y la Figura 4B corresponden a estos mitocondrias-lisosomas colocalizados, que representan la mitofagia en curso, y por lo tanto se pueden contar para evaluar el alcance de la mitofagia (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Parámetros de imagen del software de imágenes de microscopía confocal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Ilustración esquemática de la imagen confocal de células vivas. Las células vivas se tiñen conjuntamente con el colorante mitocondrial verde-fluorescente y el colorante lisosomal rojo-fluorescente, y luego las células vivas se visualizan mediante microscopía confocal. El procesamiento de imágenes y el análisis de datos se realizaron utilizando el software de imágenes asociado al microscopio o la Imagen J. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Imágenes confocales de células vivas . (A) Imágenes representativas de células teñidas con el colorante mitocondrial verde-fluorescente muestran las mitocondrias. (B) Imágenes representativas de células teñidas con el colorante lisosómico fluorescente rojo que muestran el lisosoma. (C) Imagen combinada de ambos tintes fluorescentes. (D) Área expandida que muestra mitofagia. La flecha blanca indica mitocondrias verdes engullidas por lisosomas rojos. Abreviatura: Ex = longitud de onda de excitación. El colorante mitocondrias verde-fluorescente se excita a 488 nm con emisión recogida a 505-545 nm. El colorante lisosómico fluorescente rojo se excita a 543 nm con emisión recogida a >560 nm. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Mitofagia desencadenada por la estimulación de FCCP . (A) Imágenes representativas de células teñidas conjuntamente con el colorante mitocondrial verde-fluorescente y el colorante lisosómico rojo-fluorescente. (B) Imágenes representativas de células tratadas con FCCP de 1 μM durante 10 min. La flecha blanca indica mitocondrias verdes engullidas por lisosomas rojos. (C) Datos cuantitativos de mitofagia indicados por superposición lisosomal-mitocondria. Los datos son medias ± SEM, n = 8 células. *p < 0,05 versus control. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo descrito aquí proporciona un método para evaluar y monitorear el proceso dinámico de la mitofagia en células vivas, que involucra autofagosomas, lisosomas y fisión mitocondrial, a través de la tinción conjunta con mitocondrias permisas y colorantes lisosómicos permisionales. El método también se puede utilizar para identificar mitocondrias y evaluar la morfología mitocondrial. Ambos colorantes utilizados en este estudio deben protegerse de la luz, deben evitarse los ciclos múltiples de congelación y descongelación y los tintes deben almacenarse en alícuotas de un solo uso tanto como sea posible. Se recomienda preparar soluciones de trabajo de los colorantes para evitar agregarlos directamente al medio de cultivo celular, lo que puede resultar en altas concentraciones locales y una mezcla inadecuada de los colorantes. Para evitar la tinción de otras estructuras celulares, las células MEF deben teñirse durante 30 minutos antes de obtener imágenes con el microscopio confocal. Se recomienda realizar el procedimiento de tinción inmediatamente antes de la obtención de imágenes. En las células MEF, tanto los colorantes mitocondriales como los lisosómicos a 1 μM están bien localizados en las mitocondrias y los lisosomas, respectivamente, con concentraciones de colorantes más altas que resultan en citotoxicidad y tinción inespecífica de otras estructuras celulares. Esta concentración también es óptima para teñir mitocondrias y lisosomas en células H9C2. Para otras líneas celulares, la concentración de tinte y el tiempo de tinción que permiten que el tinte se localice bien en los orgánulos deben optimizarse. Para obtener imágenes claras de mitocondrias y lisosomas, los parámetros de recolección de imágenes (ver la nota en el paso 3.3) deben ajustarse concienzudamente. La confluencia celular al 50%-60% es crucial para obtener imágenes individuales de células vivas y, por lo tanto, las células deben contarse antes de la siembra. Si el laboratorio no tiene platos confocales, se pueden usar cubreobjetos circulares como alternativa. En algunos estudios con animales, especialmente en exámenes clínicos, es difícil detectar mitofagia en muestras de tejido vivo animal debido a la falta de experimentos cuantitativos confiables y convenientes para estudiar la mitofagia. Sin embargo, la mitofagia en células aisladas de tejidos animales puede evaluarse utilizando el protocolo descrito aquí. Una limitación de este método es que, aunque ambos colorantes pueden teñir fácilmente las células vivas, son menos efectivos para teñir células muertas o fijadas en aldehído.

Además de los colorantes utilizados en este estudio, otros trazadores mitocondriales y lisosomas, como MitoMM1/2 y LysoKK, respectivamente, están actualmente disponibles para los investigadores para evaluar la mitofagia28,29. Si bien MitoMM1/2 puede teñir mitocondrias en células o tejidos fijados en paraformaldehído, no puede evaluar directamente la mitofagia y requiere doble tinción con un anticuerpo específico, como anti-LC3B, para detectar la mitofagia. Dado que LysoKK sólo puede teñir células vivas, la combinación de estos colorantes también puede detectar sólo la autofagia mitocondrial en células vivas28,29. Sin embargo, MitoMM1/2 es fácil de usar y permite el uso del filtro TRITC (ya que no muestra excitación cuando se usa un láser azul y no produce emisión verde). LysoKK puede teñir orgánulos en 5 min, facilitando la rápida monitorización y evaluación de numerosos estímulos28,29.

La mitofagia ocurre en las células a través de un mecanismo complejo, que es inducido por diferentes señales de estrés celular y cambios en el desarrollo. FCCP, un potente desacoplador de la fosforilación oxidativa mitocondrial, es un ionóforo26 inespecífico que se utilizó para inducir la mitofagia en este estudio. FCCP (1 μM) interfiere con el gradiente de protones transportando protones a través de la membrana mitocondrial interna, un proceso que causa un cambio en el pH intracelular. Por lo tanto, FCCP puede causar una pérdida severa del potencial de membrana mitocondrial en cuestión de minutos y luego inducir la autofagia mitocondrial mediante el reclutamiento de Parkin y la proteína asociada a microtúbulos de cadena ligera 3 (LC3) a las mitocondrias26,27,30. Las vías reguladoras de la mitofagia se clasifican como dependientes de ubiquitina (mediada por PINK1-parkin) o dependientes de receptores (mediada por CL3 y otros receptores)15,16. La mitofagia se ha estudiado utilizando anticuerpos específicos que se unen a moléculas clave en la vía autofágica dependiente del receptor, como LC3B, seguida de tinción conjunta con colorante lisosómico fluorescente rojo31,32. Aunque es difícil diferenciar entre estas dos vías utilizando los colorantes empleados en este protocolo, ofrecen un método simple para evaluar el grado de mitofagia en células vivas y evaluar la morfología mitocondrial.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado parcialmente por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81970333,31901044), y el Programa para Profesor de Nombramiento Especial en las Instituciones de Educación Superior de Shanghai (GZ2020008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated cell counter Countstar IC1000
Cell counting chamber slides Countstar 12-0005-50
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Corning 10-013-CV
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Corning 21-031-CVC
Glass bottom cell culture dish (confocal dish) NEST 801002
Image J (Rasband, NIH) NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit(KHB) buffer Self-prepared
LysoTracker Red Invitrogen 1818430 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye
MitoTracker Green Invitrogen 1842298 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye
Mouse Embryonic Fibroblasts Self-prepared
Objective (63x oil lens) ZEISS ZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25% Gibico Cat# 25200056
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope ZEISS ZEISS LSM 880
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) ZEISS ZEN 2.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biología Número 189
Visualización de la mitofagia con tintes fluorescentes para mitocondrias y lisosomas
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Liu, B., Li, A., Qin, Y., Chen, L.,… More

Liu, B., Li, A., Qin, Y., Chen, L., Gao, M., Gong, G. Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome. J. Vis. Exp. (189), e64647, doi:10.3791/64647 (2022).

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