Summary

Visualisering av mitofagi med fluorescerande färgämnen för mitokondrier och lysosom

Published: November 30, 2022
doi:

Summary

Mitophagy är den primära mekanismen för mitokondriell kvalitetskontroll. Utvärderingen av mitophagy in vivo hindras emellertid av bristen på tillförlitliga kvantitativa analyser. Här presenteras ett protokoll för observation av mitophagy i levande celler med användning av ett cellpermeant grönfluorescerande mitokondrifärgämne och ett rött fluorescerande lysosomfärgämne.

Abstract

Mitokondrier, som är cellens kraftverk, spelar viktiga roller i bioenergetik, generering av fria radikaler, kalciumhomeostas och apoptos. Mitophagy är den primära mekanismen för mitokondriell kvalitetskontroll och studeras vanligtvis med mikroskopisk observation, men in vivo mitophagy-analyser är svåra att utföra. Utvärdering av mitofagi genom avbildning av levande organeller är en alternativ och nödvändig metod för mitokondriell forskning. Detta protokoll beskriver procedurerna för användning av det cellpermenade grönfluorescerande mitokondrifärgämnet MitoTracker Green och det rödfluorescerande lysosomfärgämnet LysoTracker Red i levande celler, inklusive laddning av färgämnena, visualisering av mitokondrierna och lysosomen och förväntade resultat. Detaljerade steg för utvärdering av mitophagy i levande celler, samt tekniska anteckningar om mikroskopprogramvaruinställningar, tillhandahålls också. Denna metod kan hjälpa forskare att observera mitophagi med hjälp av fluorescerande mikroskopi med levande celler. Dessutom kan den användas för att kvantifiera mitokondrier och lysosomer och bedöma mitokondriell morfologi.

Introduction

Mitokondrier är kraftverk för nästan alla eukaryota celler 1,2. Förutom ATP-produktion genom oxidativ fosforylering spelar mitokondrier en viktig roll i andra processer såsom bioenergetik, kalciumhomeostas, generering av fria radikaler, apoptos och cellulär homeostas 3,4,5. Eftersom mitokondrier genererar reaktiva syrearter (ROS) från flera komplex i elektrontransportkedjan stimuleras de ständigt av potentiell oxidativ stress, vilket så småningom kan leda till strukturella skador och dysfunktion när antioxidantförsvarssystemet kollapsar 6,7. Mitokondriell dysfunktion har visat sig bidra till många sjukdomar, inklusive metaboliska störningar, neurodegeneration och hjärt-kärlsjukdom8. Därför är det viktigt att upprätthålla friska mitokondriella populationer och deras korrekta funktion. Mitokondrier är mycket plastiska och dynamiska organeller; Deras morfologi och funktion styrs av mitokondriella kvalitetskontrollmekanismer, inklusive post-translationella modifieringar (PTM) av mitokondriella proteiner, mitokondriell biogenes, fusion, fission och mitofagi 9,10. Mitokondriell fission medierad av dynaminrelaterat protein 1 (DRP1), ett GTPas av dynaminsuperfamiljen av proteiner, resulterar i små och runda mitokondrier och isolerar de dysfunktionella mitokondrierna, som kan rensas och brytas ned av mitophagy11,12.

Mitophagy är en cellulär process som selektivt bryter ner mitokondrier genom autofagi, som vanligtvis förekommer i skadade mitokondrier efter skada, åldrande eller stress. Därefter levereras dessa mitokondrier till lysosomer för nedbrytning10. Således är mitophagy en katabolisk process som hjälper till att upprätthålla kvantiteten och kvaliteten på mitokondrier i ett hälsosamt tillstånd i ett brett spektrum av celltyper. Det spelar en avgörande roll i återställandet av cellulär homeostas under normala fysiologiska och stressförhållanden13,14. Celler kännetecknas av en komplex mitophagimekanism, som induceras av olika signaler om cellulär stress och utvecklingsförändringar. Mitophagy regulatoriska vägar klassificeras som ubiquitinberoende eller receptorberoende15,16; den ubiquitinberoende autofagin förmedlas av kinaset PINK1 och rekryteringen av ubiquitinligasen Parkin E3 till mitokondrierna 17,18, medan receptorberoende autofagi involverar bindning av autofagireceptorer till den mikrotubuliassocierade proteinljuskedjan LC3 som förmedlar mitophagi som svar på mitokondriell skada19.

Transmissionselektronmikroskopi (TEM) är den vanligaste metoden, och fortfarande en av de bästa metoderna, för att observera och upptäcka mitophagy20. De morfologiska egenskaperna hos mitophagi är autofagosomer eller autolysosomer bildade genom fusion av autofagosomer med lysosomer, vilket kan observeras från elektronmikroskopibilder21. Svagheten hos elektronmikroskopi (EM) är emellertid oförmågan att övervaka de dynamiska processerna för mitophagi, såsom mitokondriell depolarisering, mitokondriell fision och fusion av autofagosomer och lysosomer, i den levande cellen20. Således är utvärdering av mitofagi genom avbildning av levande organeller en attraktiv alternativ metod för mitokondriell forskning. Den levande cellavbildningstekniken som beskrivs här använder två fluorescerande färgämnen för att fläcka mitokondrier och lysosomer. När mitophagi inträffar färgas skadade eller överflödiga mitokondrier som uppslukas av autofagosomer gröna av mitokondriellt färgämne, medan det röda färgämnet fläckar lysosomerna. Fusionen av dessa autofagosomer och lysosomer, kallade autolysosomer, får den gröna och röda fluorescensen att överlappa varandra och manifesteras som gula prickar, vilket indikerar förekomsten av mitophagi22. Det cellpermeant mitokondrifärgämnet (MitoTracker Green) innehåller en milt tiolreaktiv klormetyldel för att märka mitokondrier23. För att märka mitokondrier inkuberas cellerna helt enkelt med färgämnet, som diffunderar passivt över plasmamembranet och ackumuleras i aktiva mitokondrier. Detta mitokondrifärgämne kan lätt fläcka levande celler och är mindre effektivt vid färgning av aldehydfixerade eller döda celler. Lysosomfärgämnet (LysoTracker Red) är en fluorescerande acidotrop sond som används för att märka och spåra sura organeller i levande celler. Detta färgämne uppvisar en hög selektivitet för sura organeller och kan effektivt märka levande celler vid nanomolära koncentrationer24.

Förfarandena för användning av dessa fluorescerande färgämnen i levande celler, inklusive laddning av färgämnen och visualisering av mitokondrier och lysosomer, presenteras här. Denna metod kan hjälpa forskare att observera mitophagi med hjälp av fluorescerande mikroskopi med levande celler. Det kan också användas för att kvantifiera mitokondrier och lysosomer och bedöma mitokondriell morfologi.

Protocol

1. Cellodling och passaging OBS: Protokollet beskrivs med rutinmässigt odlade musembryonala fibroblaster (MEF) som ett exempel. Odla MEF-celler i 10 cm cellodlingsskålar med 10 ml Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM). Inkubera vid 37 °C och 5%CO2 och övervaka cellerna i mikroskop med 100x förstoring. Utför rutinmässig cellpassage.När cellerna når 80%-90% sammanflöde (var 3: e dag), tvätta cellerna med 2 ml Dulbeccos fosfat…

Representative Results

MitoTracker Green är en grönfluorescerande mitokondriell fläck som exakt kan lokaliseras till mitokondrier. Färgämnet kan lätt fläcka levande celler och är mindre effektivt vid färgning av aldehydfixerade eller döda celler (figur 2). Det röda fluorescerande lysosomfärgämnet LysoTracker Red kan märka och spåra sura lysosomala organeller och kan bara fläcka levande celler (figur 2). Konfokalmikroskopavbildning möjliggör visualisering av mitokondr…

Discussion

Protokollet som beskrivs här ger en metod för att utvärdera och övervaka den dynamiska processen med mitophagi i levande celler, som involverar autofagosomer, lysosomer och mitokondriell fission, genom samfärgning med cellpermeant mitokondrier och lysosomfärger. Metoden kan också användas för att identifiera mitokondrier och bedöma mitokondriell morfologi. Båda färgämnena som används i denna studie bör skyddas mot ljus, flera frys-tina cykler bör undvikas och färgämnena bör förvaras i alikvoter för e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete finansierades delvis av Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), National Natural Science Foundation of China (81970333,31901044,) och programmet för professor i särskild utnämning vid Shanghai Institutions of Higher Learning (GZ2020008).

Materials

Automated cell counter Countstar IC1000
Cell counting chamber slides Countstar 12-0005-50
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Corning 10-013-CV
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Corning 21-031-CVC
Glass bottom cell culture dish (confocal dish) NEST 801002
Image J (Rasband, NIH) NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit(KHB) buffer Self-prepared
LysoTracker Red Invitrogen 1818430 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye
MitoTracker Green Invitrogen 1842298 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye
Mouse Embryonic Fibroblasts Self-prepared
Objective (63x oil lens) ZEISS ZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25% Gibico Cat# 25200056
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope ZEISS ZEISS LSM 880
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) ZEISS ZEN 2.1

References

  1. Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
  2. Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
  3. Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
  4. Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).
  5. Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
  6. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  7. Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
  8. Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
  9. Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).
  10. Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
  11. Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
  12. Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).
  13. Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).
  14. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
  15. Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
  16. Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
  17. Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
  18. Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
  19. Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
  20. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
  21. Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
  22. Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
  23. Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
  24. Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
  25. Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
  26. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
  27. Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
  28. Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
  29. Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
  30. Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
  31. Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
  32. Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).

Play Video

Cite This Article
Liu, B., Li, A., Qin, Y., Chen, L., Gao, M., Gong, G. Visualizing Mitophagy with Fluorescent Dyes for Mitochondria and Lysosome. J. Vis. Exp. (189), e64647, doi:10.3791/64647 (2022).

View Video