Mitophagy är den primära mekanismen för mitokondriell kvalitetskontroll. Utvärderingen av mitophagy in vivo hindras emellertid av bristen på tillförlitliga kvantitativa analyser. Här presenteras ett protokoll för observation av mitophagy i levande celler med användning av ett cellpermeant grönfluorescerande mitokondrifärgämne och ett rött fluorescerande lysosomfärgämne.
Mitokondrier, som är cellens kraftverk, spelar viktiga roller i bioenergetik, generering av fria radikaler, kalciumhomeostas och apoptos. Mitophagy är den primära mekanismen för mitokondriell kvalitetskontroll och studeras vanligtvis med mikroskopisk observation, men in vivo mitophagy-analyser är svåra att utföra. Utvärdering av mitofagi genom avbildning av levande organeller är en alternativ och nödvändig metod för mitokondriell forskning. Detta protokoll beskriver procedurerna för användning av det cellpermenade grönfluorescerande mitokondrifärgämnet MitoTracker Green och det rödfluorescerande lysosomfärgämnet LysoTracker Red i levande celler, inklusive laddning av färgämnena, visualisering av mitokondrierna och lysosomen och förväntade resultat. Detaljerade steg för utvärdering av mitophagy i levande celler, samt tekniska anteckningar om mikroskopprogramvaruinställningar, tillhandahålls också. Denna metod kan hjälpa forskare att observera mitophagi med hjälp av fluorescerande mikroskopi med levande celler. Dessutom kan den användas för att kvantifiera mitokondrier och lysosomer och bedöma mitokondriell morfologi.
Mitokondrier är kraftverk för nästan alla eukaryota celler 1,2. Förutom ATP-produktion genom oxidativ fosforylering spelar mitokondrier en viktig roll i andra processer såsom bioenergetik, kalciumhomeostas, generering av fria radikaler, apoptos och cellulär homeostas 3,4,5. Eftersom mitokondrier genererar reaktiva syrearter (ROS) från flera komplex i elektrontransportkedjan stimuleras de ständigt av potentiell oxidativ stress, vilket så småningom kan leda till strukturella skador och dysfunktion när antioxidantförsvarssystemet kollapsar 6,7. Mitokondriell dysfunktion har visat sig bidra till många sjukdomar, inklusive metaboliska störningar, neurodegeneration och hjärt-kärlsjukdom8. Därför är det viktigt att upprätthålla friska mitokondriella populationer och deras korrekta funktion. Mitokondrier är mycket plastiska och dynamiska organeller; Deras morfologi och funktion styrs av mitokondriella kvalitetskontrollmekanismer, inklusive post-translationella modifieringar (PTM) av mitokondriella proteiner, mitokondriell biogenes, fusion, fission och mitofagi 9,10. Mitokondriell fission medierad av dynaminrelaterat protein 1 (DRP1), ett GTPas av dynaminsuperfamiljen av proteiner, resulterar i små och runda mitokondrier och isolerar de dysfunktionella mitokondrierna, som kan rensas och brytas ned av mitophagy11,12.
Mitophagy är en cellulär process som selektivt bryter ner mitokondrier genom autofagi, som vanligtvis förekommer i skadade mitokondrier efter skada, åldrande eller stress. Därefter levereras dessa mitokondrier till lysosomer för nedbrytning10. Således är mitophagy en katabolisk process som hjälper till att upprätthålla kvantiteten och kvaliteten på mitokondrier i ett hälsosamt tillstånd i ett brett spektrum av celltyper. Det spelar en avgörande roll i återställandet av cellulär homeostas under normala fysiologiska och stressförhållanden13,14. Celler kännetecknas av en komplex mitophagimekanism, som induceras av olika signaler om cellulär stress och utvecklingsförändringar. Mitophagy regulatoriska vägar klassificeras som ubiquitinberoende eller receptorberoende15,16; den ubiquitinberoende autofagin förmedlas av kinaset PINK1 och rekryteringen av ubiquitinligasen Parkin E3 till mitokondrierna 17,18, medan receptorberoende autofagi involverar bindning av autofagireceptorer till den mikrotubuliassocierade proteinljuskedjan LC3 som förmedlar mitophagi som svar på mitokondriell skada19.
Transmissionselektronmikroskopi (TEM) är den vanligaste metoden, och fortfarande en av de bästa metoderna, för att observera och upptäcka mitophagy20. De morfologiska egenskaperna hos mitophagi är autofagosomer eller autolysosomer bildade genom fusion av autofagosomer med lysosomer, vilket kan observeras från elektronmikroskopibilder21. Svagheten hos elektronmikroskopi (EM) är emellertid oförmågan att övervaka de dynamiska processerna för mitophagi, såsom mitokondriell depolarisering, mitokondriell fision och fusion av autofagosomer och lysosomer, i den levande cellen20. Således är utvärdering av mitofagi genom avbildning av levande organeller en attraktiv alternativ metod för mitokondriell forskning. Den levande cellavbildningstekniken som beskrivs här använder två fluorescerande färgämnen för att fläcka mitokondrier och lysosomer. När mitophagi inträffar färgas skadade eller överflödiga mitokondrier som uppslukas av autofagosomer gröna av mitokondriellt färgämne, medan det röda färgämnet fläckar lysosomerna. Fusionen av dessa autofagosomer och lysosomer, kallade autolysosomer, får den gröna och röda fluorescensen att överlappa varandra och manifesteras som gula prickar, vilket indikerar förekomsten av mitophagi22. Det cellpermeant mitokondrifärgämnet (MitoTracker Green) innehåller en milt tiolreaktiv klormetyldel för att märka mitokondrier23. För att märka mitokondrier inkuberas cellerna helt enkelt med färgämnet, som diffunderar passivt över plasmamembranet och ackumuleras i aktiva mitokondrier. Detta mitokondrifärgämne kan lätt fläcka levande celler och är mindre effektivt vid färgning av aldehydfixerade eller döda celler. Lysosomfärgämnet (LysoTracker Red) är en fluorescerande acidotrop sond som används för att märka och spåra sura organeller i levande celler. Detta färgämne uppvisar en hög selektivitet för sura organeller och kan effektivt märka levande celler vid nanomolära koncentrationer24.
Förfarandena för användning av dessa fluorescerande färgämnen i levande celler, inklusive laddning av färgämnen och visualisering av mitokondrier och lysosomer, presenteras här. Denna metod kan hjälpa forskare att observera mitophagi med hjälp av fluorescerande mikroskopi med levande celler. Det kan också användas för att kvantifiera mitokondrier och lysosomer och bedöma mitokondriell morfologi.
Protokollet som beskrivs här ger en metod för att utvärdera och övervaka den dynamiska processen med mitophagi i levande celler, som involverar autofagosomer, lysosomer och mitokondriell fission, genom samfärgning med cellpermeant mitokondrier och lysosomfärger. Metoden kan också användas för att identifiera mitokondrier och bedöma mitokondriell morfologi. Båda färgämnena som används i denna studie bör skyddas mot ljus, flera frys-tina cykler bör undvikas och färgämnena bör förvaras i alikvoter för e…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades delvis av Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), National Natural Science Foundation of China (81970333,31901044,) och programmet för professor i särskild utnämning vid Shanghai Institutions of Higher Learning (GZ2020008).
Automated cell counter | Countstar | IC1000 | |
Cell counting chamber slides | Countstar | 12-0005-50 | |
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
Glass bottom cell culture dish (confocal dish) | NEST | 801002 | |
Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Krebs–Henseleit(KHB) buffer | Self-prepared | ||
LysoTracker Red | Invitrogen | 1818430 | 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye |
MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye |
Mouse Embryonic Fibroblasts | Self-prepared | ||
Objective (63x oil lens) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) | ZEISS | ZEN 2.1 |