Summary
Mitophagy är den primära mekanismen för mitokondriell kvalitetskontroll. Utvärderingen av mitophagy in vivo hindras emellertid av bristen på tillförlitliga kvantitativa analyser. Här presenteras ett protokoll för observation av mitophagy i levande celler med användning av ett cellpermeant grönfluorescerande mitokondrifärgämne och ett rött fluorescerande lysosomfärgämne.
Abstract
Mitokondrier, som är cellens kraftverk, spelar viktiga roller i bioenergetik, generering av fria radikaler, kalciumhomeostas och apoptos. Mitophagy är den primära mekanismen för mitokondriell kvalitetskontroll och studeras vanligtvis med mikroskopisk observation, men in vivo mitophagy-analyser är svåra att utföra. Utvärdering av mitofagi genom avbildning av levande organeller är en alternativ och nödvändig metod för mitokondriell forskning. Detta protokoll beskriver procedurerna för användning av det cellpermenade grönfluorescerande mitokondrifärgämnet MitoTracker Green och det rödfluorescerande lysosomfärgämnet LysoTracker Red i levande celler, inklusive laddning av färgämnena, visualisering av mitokondrierna och lysosomen och förväntade resultat. Detaljerade steg för utvärdering av mitophagy i levande celler, samt tekniska anteckningar om mikroskopprogramvaruinställningar, tillhandahålls också. Denna metod kan hjälpa forskare att observera mitophagi med hjälp av fluorescerande mikroskopi med levande celler. Dessutom kan den användas för att kvantifiera mitokondrier och lysosomer och bedöma mitokondriell morfologi.
Introduction
Mitokondrier är kraftverk för nästan alla eukaryota celler 1,2. Förutom ATP-produktion genom oxidativ fosforylering spelar mitokondrier en viktig roll i andra processer såsom bioenergetik, kalciumhomeostas, generering av fria radikaler, apoptos och cellulär homeostas 3,4,5. Eftersom mitokondrier genererar reaktiva syrearter (ROS) från flera komplex i elektrontransportkedjan stimuleras de ständigt av potentiell oxidativ stress, vilket så småningom kan leda till strukturella skador och dysfunktion när antioxidantförsvarssystemet kollapsar 6,7. Mitokondriell dysfunktion har visat sig bidra till många sjukdomar, inklusive metaboliska störningar, neurodegeneration och hjärt-kärlsjukdom8. Därför är det viktigt att upprätthålla friska mitokondriella populationer och deras korrekta funktion. Mitokondrier är mycket plastiska och dynamiska organeller; Deras morfologi och funktion styrs av mitokondriella kvalitetskontrollmekanismer, inklusive post-translationella modifieringar (PTM) av mitokondriella proteiner, mitokondriell biogenes, fusion, fission och mitofagi 9,10. Mitokondriell fission medierad av dynaminrelaterat protein 1 (DRP1), ett GTPas av dynaminsuperfamiljen av proteiner, resulterar i små och runda mitokondrier och isolerar de dysfunktionella mitokondrierna, som kan rensas och brytas ned av mitophagy11,12.
Mitophagy är en cellulär process som selektivt bryter ner mitokondrier genom autofagi, som vanligtvis förekommer i skadade mitokondrier efter skada, åldrande eller stress. Därefter levereras dessa mitokondrier till lysosomer för nedbrytning10. Således är mitophagy en katabolisk process som hjälper till att upprätthålla kvantiteten och kvaliteten på mitokondrier i ett hälsosamt tillstånd i ett brett spektrum av celltyper. Det spelar en avgörande roll i återställandet av cellulär homeostas under normala fysiologiska och stressförhållanden13,14. Celler kännetecknas av en komplex mitophagimekanism, som induceras av olika signaler om cellulär stress och utvecklingsförändringar. Mitophagy regulatoriska vägar klassificeras som ubiquitinberoende eller receptorberoende15,16; den ubiquitinberoende autofagin förmedlas av kinaset PINK1 och rekryteringen av ubiquitinligasen Parkin E3 till mitokondrierna 17,18, medan receptorberoende autofagi involverar bindning av autofagireceptorer till den mikrotubuliassocierade proteinljuskedjan LC3 som förmedlar mitophagi som svar på mitokondriell skada19.
Transmissionselektronmikroskopi (TEM) är den vanligaste metoden, och fortfarande en av de bästa metoderna, för att observera och upptäcka mitophagy20. De morfologiska egenskaperna hos mitophagi är autofagosomer eller autolysosomer bildade genom fusion av autofagosomer med lysosomer, vilket kan observeras från elektronmikroskopibilder21. Svagheten hos elektronmikroskopi (EM) är emellertid oförmågan att övervaka de dynamiska processerna för mitophagi, såsom mitokondriell depolarisering, mitokondriell fision och fusion av autofagosomer och lysosomer, i den levande cellen20. Således är utvärdering av mitofagi genom avbildning av levande organeller en attraktiv alternativ metod för mitokondriell forskning. Den levande cellavbildningstekniken som beskrivs här använder två fluorescerande färgämnen för att fläcka mitokondrier och lysosomer. När mitophagi inträffar färgas skadade eller överflödiga mitokondrier som uppslukas av autofagosomer gröna av mitokondriellt färgämne, medan det röda färgämnet fläckar lysosomerna. Fusionen av dessa autofagosomer och lysosomer, kallade autolysosomer, får den gröna och röda fluorescensen att överlappa varandra och manifesteras som gula prickar, vilket indikerar förekomsten av mitophagi22. Det cellpermeant mitokondrifärgämnet (MitoTracker Green) innehåller en milt tiolreaktiv klormetyldel för att märka mitokondrier23. För att märka mitokondrier inkuberas cellerna helt enkelt med färgämnet, som diffunderar passivt över plasmamembranet och ackumuleras i aktiva mitokondrier. Detta mitokondrifärgämne kan lätt fläcka levande celler och är mindre effektivt vid färgning av aldehydfixerade eller döda celler. Lysosomfärgämnet (LysoTracker Red) är en fluorescerande acidotrop sond som används för att märka och spåra sura organeller i levande celler. Detta färgämne uppvisar en hög selektivitet för sura organeller och kan effektivt märka levande celler vid nanomolära koncentrationer24.
Förfarandena för användning av dessa fluorescerande färgämnen i levande celler, inklusive laddning av färgämnen och visualisering av mitokondrier och lysosomer, presenteras här. Denna metod kan hjälpa forskare att observera mitophagi med hjälp av fluorescerande mikroskopi med levande celler. Det kan också användas för att kvantifiera mitokondrier och lysosomer och bedöma mitokondriell morfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellodling och passaging
OBS: Protokollet beskrivs med rutinmässigt odlade musembryonala fibroblaster (MEF) som ett exempel.
- Odla MEF-celler i 10 cm cellodlingsskålar med 10 ml Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM). Inkubera vid 37 °C och 5%CO2 och övervaka cellerna i mikroskop med 100x förstoring.
- Utför rutinmässig cellpassage.
- När cellerna når 80%-90% sammanflöde (var 3: e dag), tvätta cellerna med 2 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS). Tillsätt sedan 2 ml 0,05% trypsin-EDTA i 1 min för att dissociera cellerna, följt av 2 ml DMEM för att stoppa verkan av trypsin-EDTA. Centrifugera cellsuspensionen vid 100 x g i 3 minuter och återsuspendera cellpelleten i 1 ml DMEM.
- Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cellräknare och cellräkningskammarglas (se materialförteckning) och inokulera sedan 1,5 x 106 celler i en ny 10 cm cellodlingsskål som innehåller 10 ml DMEM.
- För mitophagianalysen, förbered en cellsuspension enligt steg 1.2.1. Späd cellsuspensionen till 1 x 105 celler/ml i färskt DMEM.
- Tillsätt 2 ml av den utspädda cellsuspensionen i en 20 mm konfokal skål (se materialtabell) och skaka odlingsskålen i ett "kors". Inkubera cellodlingsskålen i en 37 °C, 5%CO2-inkubator i 24 timmar.
2. Mitokondriell färgning
- Ta bort stamlösningens alikvoter av det grönfluorescerande mitokondriella färgämnet och det rödfluorescerande lysosomfärgämnet (se materialförteckningen) från frysen på -20 °C.
- Förbered arbetslösningar av färgämnena genom att späda stamlösningarna 1:1 000 i DMEM och blanda väl. Tillsätt till exempel 2 μl vardera av 1 mM mitokondriellt färgämne och lysosomfärgämne till 2 ml DMEM för att erhålla en arbetskoncentration på 1 μM för båda färgämnena.
- Ta bort mediet från konfokalodlingsskålen (steg 1.4). Tillsätt 1 ml av färgningslösningen (beredd i steg 2.2) för att täcka cellerna. Placera cellodlingsskålen i en inkubator vid 37 °C, 5%CO2 i 20-30 min.
3. Konfokal avbildning
- Förbered 1 liter Krebs-Henseleit (KH) buffert (138,2 mM NaCl, 3,7 mM KCl, 0,25 mM CaCl2, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4,7H2O, 15 mM glukos och 21,85 mM HEPES; slutligt pH7,4) och förvara vid 4 °C (i upp till 1 månad).
- På dagen för konfokal avbildning, ta bort KH-bufferten från kylskåpet i förväg och förvärm den till rumstemperatur (20 till 25 °C).
- Ställ in parametrarna för programvaran för konfokalmikroskopi (se materialförteckning): För dubbla excitationsbilder, använd sekventiell excitation vid 488 nm och 543 nm och samla emission vid 505-545 nm respektive >560 nm.
OBS: Ställ in bildinställningarna enligt följande. Skanningsläge: ram; Hastighet: 9; Medelvärde: antal, 1; Vinst: 450 till 600; Pinhole: 30 till 200; laser: <10%. Det är bäst att starta bildprogramvaran först och sedan slå på 488 nm lasern helt. 543 nm-lasern måste vara påslagen och stabiliserad i 3-5 minuter före användning (figur 1A). - Ta bort odlingsmediet som innehåller färgämnet från inkubatorn (steg 2.3) och tillsätt 1 ml KH-buffert till skålen.
- För att inducera mitophagi, behandla cellerna med karbonylcyanid-4-(trifluormetoxi) fenylhydrazon (FCCP) vid 1 μM (slutlig koncentration) i KH-buffert i 10 minuter vid rumstemperatur och fortsätt omedelbart att avbilda cellerna med hjälp av konfokalmikroskopet.
- Applicera en lämplig mängd olja på toppen av 63x oljelinsen (se Materialförteckning). Placera cellprovet på provsteget i konfokalmikroskopet och flytta det direkt ovanför objektivlinsen.
- Använd bildprogramvaran för att hitta exemplet genom att klicka på fliken Hitta i det övre vänstra hörnet av programvarugränssnittet (bild 1B). Välj en grön filteruppsättning för experimentet.
- Använd den grova justeringsknappen för att snabbt fokusera genom att flytta objektivlinsen uppåt och nedåt. När cellprovet är tydligt synligt genom okularet, sök och fokusera området med enskilda celler och flytta det till mitten av synfältet.
- Klicka på fliken Förvärv i det övre vänstra hörnet i programvarugränssnittet för att hämta bilder. Välj endast 488 nm-kanalen och bildruteupplösningen 1024 x 1024 för förhandsgranskning.
- Klicka på fliken Live i det övre vänstra hörnet för att starta en live-skanning. Justera synfältet till det skarpaste och justera lasereffekten genom att flytta skjutreglaget åt vänster eller höger (bild 1A). Håll förstärkningsinställningen under 600 för att undvika överexponering.
- Justera pinhålsvärdet till 156, få värde till 545 och digitalt förskjutningsvärde till 0.
- Välj det bästa synfältet, kontrollera de två kanalerna (488 nm och 543 nm) och välj bildupplösningen 1024 x 1024. Klicka på Fäst för att hämta 2D-bilder. Spara de förvärvade bilderna.
OBS: Det gröna mitokondrifärgämnet har en excitationstopp vid 490 nm och en utsläppstopp vid 516 nm; Det kan exciteras med en 488 nm laser. Det röda lysosomfärgämnet har en excitationstopp vid 576 nm och en utsläppstopp vid 590 nm; Det kan exciteras med en 543 nm laser.
4. Bildanalys
- Öppna den sparade bilden med ImageJ och importera den sammanslagna bilden till den.
- Räkna manuellt antalet gula prickar i varje cell, vilket indikerar att lysosomen uppslukar mitokondrier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MitoTracker Green är en grönfluorescerande mitokondriell fläck som exakt kan lokaliseras till mitokondrier. Färgämnet kan lätt fläcka levande celler och är mindre effektivt vid färgning av aldehydfixerade eller döda celler (figur 2). Det röda fluorescerande lysosomfärgämnet LysoTracker Red kan märka och spåra sura lysosomala organeller och kan bara fläcka levande celler (figur 2). Konfokalmikroskopavbildning möjliggör visualisering av mitokondrier och lysosomer färgade med lämpliga färgämnen (figur 1 och figur 2).
Mitophagy är en katabolisk cellulär process som selektivt bryter ner mitokondrier genom autofagi, som vanligtvis förekommer i skadade mitokondrier efter skada, åldrande eller stress20. Därefter levereras dessa mitokondrier till lysosomer för nedbrytning. Mitophagy hjälper till att upprätthålla kvantiteten och kvaliteten på mitokondrier i ett hälsosamt tillstånd i ett brett spektrum av celltyper. I friska däggdjursceller förekommer mitophagi sällan, och därför krävs andra stimuli för att inducera denna process25. Karbonylcyanid-4 (trifluormetoxi) fenylhydrazon (FCCP), en mitokondriell frikoppling, är en ospecifik jonofor som orsakar en allvarlig förlust av mitokondriell membranpotential inom några minuter, förändring av intracellulärt pH och efterföljande mitofagi26,27. I denna studie användes FCCP för att utlösa mitophagi i MEF-celler för konfokal avbildning. När skadade grönfärgade mitokondrier uppslukas av rödfärgade lysosomer överlappar den gröna och röda fluorescensen för att avslöja gula samlokaliserade mitokondrier-lysosomer (figur 3). De gula prickarna i figur 3D och figur 4B motsvarar dessa samlokaliserade mitokondrier-lysosomer, som representerar pågående mitophagi, och kan därför räknas för att utvärdera omfattningen av mitophagy (figur 4).
Figur 1: Bildparametrar för konfokalmikroskopibildsprogrammet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Schematisk illustration av konfokal avbildning av levande celler. De levande cellerna färgas tillsammans med det grönfluorescerande mitokondriella färgämnet och det rödfluorescerande lysosomala färgämnet, och sedan avbildas de levande cellerna med konfokalmikroskopi. Bildbehandling och dataanalys utfördes med hjälp av den mikroskopassocierade bildprogramvaran eller Image J. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Konfokal avbildning av levande celler. (A) Representativa bilder av celler färgade med det grönfluorescerande mitokondrifärgämnet visar mitokondrierna. (B) Representativa bilder av celler färgade med det röda fluorescerande lysosomfärgämnet som visar lysosomen. (C) Sammanfogad bild av båda fluorescerande färgämnena. (D) Utvidgat område som visar mitophagi. Den vita pilen indikerar gröna mitokondrier uppslukade av röda lysosomer. Förkortning: Ex = excitationsvåglängd. Det grönfluorescerande mitokondrifärgämnet exciteras vid 488 nm med utsläpp som samlas in vid 505-545 nm. Det rödfluorescerande lysosomfärgämnet exciteras vid 543 nm med utsläpp uppsamlat vid >560 nm. Skalstänger = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Mitophagy utlöst av FCCP-stimulering . (A) Representativa bilder av celler som färgats tillsammans med det grönfluorescerande mitokondrifärgämnet och det röda fluorescerande lysosomfärgämnet. (B) Representativa bilder av celler behandlade med 1 μM FCCP i 10 min. Den vita pilen indikerar gröna mitokondrier uppslukade av röda lysosomer. C) Kvantitativa uppgifter om mitophagi som indikeras av lysosomal-mitokondriöverlagring. Data är medelvärde ± SEM, n = 8 celler. *p < 0,05 mot kontroll. Skalstänger = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här ger en metod för att utvärdera och övervaka den dynamiska processen med mitophagi i levande celler, som involverar autofagosomer, lysosomer och mitokondriell fission, genom samfärgning med cellpermeant mitokondrier och lysosomfärger. Metoden kan också användas för att identifiera mitokondrier och bedöma mitokondriell morfologi. Båda färgämnena som används i denna studie bör skyddas mot ljus, flera frys-tina cykler bör undvikas och färgämnena bör förvaras i alikvoter för engångsbruk så mycket som möjligt. Det rekommenderas att förbereda arbetslösningar av färgämnena för att undvika att tillsätta dem direkt till cellodlingsmediet, vilket kan leda till höga lokala koncentrationer och otillräcklig blandning av färgämnena. För att undvika färgning av andra cellulära strukturer bör MEF-cellerna färgas i 30 minuter före avbildning med konfokalmikroskopet. Det rekommenderas att utföra färgningsproceduren omedelbart före avbildning. I MEF-celler är både mitokondrier och lysosomfärger vid 1 μM väl lokaliserade i mitokondrier respektive lysosomer, med högre färgämneskoncentrationer som resulterar i cytotoxicitet såväl som ospecifik färgning av andra cellulära strukturer. Denna koncentration är också optimal för färgning av mitokondrier och lysosomer i H9C2-celler. För andra cellinjer måste färgkoncentrationen och färgningstiden som gör att färgämnet kan lokaliseras väl till organellerna optimeras. För att få tydliga bilder av mitokondrier och lysosomer måste bildinsamlingsparametrarna (se anteckningen i steg 3.3) justeras samvetsgrant. Cellsammanflöde vid 50%-60% är avgörande för att få individuella levande cellbilder, och därför måste celler räknas före sådd. Om labbet inte har konfokala rätter kan cirkulära täckglas användas som ett alternativ. I vissa djurstudier, särskilt i kliniska undersökningar, är det svårt att upptäcka mitophagi i djurlevande vävnadsprover på grund av bristen på tillförlitliga och praktiska kvantitativa experiment för att studera mitofagi. Ändå kan mitophagi i celler isolerade från djurvävnader bedömas med hjälp av det protokoll som beskrivs här. En begränsning med denna metod är att även om båda färgämnena lätt kan fläcka levande celler, är de mindre effektiva vid färgning av döda eller aldehydfixerade celler.
Förutom de färgämnen som används i denna studie är andra mitokondrier och lysosomspårämnen, såsom MitoMM1/2 respektive LysoKK, för närvarande tillgängliga för forskare för utvärdering av mitophagy28,29. Medan MitoMM1/2 kan fläcka mitokondrier i paraformaldehydfixerade celler eller vävnader, kan den inte direkt bedöma mitophagi och kräver dubbel färgning med en specifik antikropp, såsom anti-LC3B, för att detektera mitophagi. Eftersom LysoKK endast kan fläcka levande celler kan kombinationen av dessa färgämnen också bara detektera mitokondriell autofagi i levande celler28,29. Ändå är MitoMM1/2 lätt att använda och tillåter användning av TRITC-filter (eftersom det inte visar excitation vid användning av en blå laser och inte producerar grön emission). LysoKK kan fläcka organeller inom 5 minuter, vilket underlättar snabb övervakning och bedömning av många stimuli28,29.
Mitophagy förekommer i celler via en komplex mekanism, som induceras av olika cellulära stresssignaler och utvecklingsförändringar. FCCP, en potent frikoppling av mitokondriell oxidativ fosforylering, är en ospecifik jonofor26 som användes för att inducera mitophagi i denna studie. FCCP (1 μM) stör protongradienten genom att transportera protoner över det inre mitokondriella membranet, en process som orsakar en förändring i intracellulärt pH. Således kan FCCP orsaka en allvarlig förlust av mitokondriell membranpotential inom några minuter och sedan inducera mitokondriell autofagi genom att rekrytera Parkin och mikrotubuliassocierad proteinljuskedja 3 (LC3) till mitokondrierna26,27,30. Mitophagy regulatoriska vägar klassificeras som ubiquitinberoende (PINK1-parkin-medierad) eller receptorberoende (medierad av LC3 och andra receptorer)15,16. Mitophagy har studerats med hjälp av specifika antikroppar som binder till nyckelmolekyler i den receptorberoende autofagiska vägen, såsom LC3B, följt av samfärgning med rött fluorescerande lysosomfärgämne31,32. Även om det är svårt att skilja mellan dessa två vägar med hjälp av färgämnena som används i detta protokoll, erbjuder de en enkel metod för att utvärdera omfattningen av mitophagi i levande celler och bedöma mitokondriell morfologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades delvis av Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), National Natural Science Foundation of China (81970333,31901044,) och programmet för professor i särskild utnämning vid Shanghai Institutions of Higher Learning (GZ2020008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated cell counter | Countstar | IC1000 | |
| Cell counting chamber slides | Countstar | 12-0005-50 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
| Glass bottom cell culture dish (confocal dish) | NEST | 801002 | |
| Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Krebs–Henseleit(KHB) buffer | Self-prepared | ||
| LysoTracker Red | Invitrogen | 1818430 | 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye |
| MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Self-prepared | ||
| Objective (63x oil lens) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
| ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) | ZEISS | ZEN 2.1 |
References
- Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
- Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
- Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
- Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).
- Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
- Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
- Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
- Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).
- Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
- Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
- Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).
- Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
- Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
- Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
- Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
- Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
- Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
- Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
- Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
- Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).
