Summary
Mitofaji, mitokondriyal kalite kontrolünün birincil mekanizmasıdır. Bununla birlikte, in vivo mitofajinin değerlendirilmesi, güvenilir kantitatif tahlillerin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, hücre pervasıtalı yeşil-floresan mitokondri boyası ve kırmızı-floresan lizozom boyası kullanılarak canlı hücrelerde mitofajinin gözlemlenmesi için bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Hücrenin güç merkezleri olan mitokondri, biyoenerjetik çalışmalarda, serbest radikal oluşumunda, kalsiyum homeostazında ve apoptozda önemli roller oynamaktadır. Mitofaji, mitokondriyal kalite kontrolün birincil mekanizmasıdır ve genellikle mikroskobik gözlem kullanılarak incelenir, ancak in vivo mitofi tahlillerinin yapılması zordur. Mitofajiyi canlı organelleri görüntüleyerek değerlendirmek, mitokondriyal araştırmalar için alternatif ve gerekli bir yöntemdir. Bu protokol, boyaların yüklenmesi, mitokondri ve lizozomun görselleştirilmesi ve beklenen sonuçlar dahil olmak üzere, hücre perkastı yeşil floresan mitokondri boyası MitoTracker Green ve kırmızı floresan lizozom boyası LysoTracker Red'in canlı hücrelerde kullanılmasına ilişkin prosedürleri açıklar. Canlı hücrelerde mitofajinin değerlendirilmesi için ayrıntılı adımlar ve mikroskop yazılım ayarları hakkında teknik notlar da sağlanmaktadır. Bu yöntem, araştırmacıların canlı hücreli floresan mikroskopi kullanarak mitofajiyi gözlemlemelerine yardımcı olabilir. Ek olarak, mitokondri ve lizozomları ölçmek ve mitokondriyal morfolojiyi değerlendirmek için kullanılabilir.
Introduction
Mitokondri, neredeyse tüm ökaryotik hücrelerin güç merkezleridir 1,2. Oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimine ek olarak, mitokondri biyoenerjetik kalsiyum homeostazı, serbest radikal üretimi, apoptoz ve hücresel homeostaz 3,4,5 gibi diğer süreçlerde hayati bir rol oynamaktadır. Mitokondri, elektron taşıma zincirindeki çoklu komplekslerden reaktif oksijen türleri (ROS) ürettiğinden, antioksidan savunma sistemi çöktüğünde yapısal hasara ve işlev bozukluğuna yol açabilecek potansiyel oksidatif stres tarafından sürekli olarak uyarılırlar 6,7. Mitokondriyal disfonksiyonun metabolik bozukluklar, nörodejenerasyon ve kardiyovasküler hastalık8 dahil olmak üzere birçok hastalığa katkıda bulunduğu bulunmuştur. Bu nedenle, sağlıklı mitokondriyal popülasyonları ve bunların uygun işlevlerini korumak çok önemlidir. Mitokondri oldukça plastik ve dinamik organellerdir; morfolojileri ve fonksiyonları, mitokondriyal proteinlerin post-translasyonel modifikasyonları (PTM), mitokondriyal biyogenez, füzyon, fisyon ve mitofaji 9,10 dahil olmak üzere mitokondriyal kalite kontrol mekanizmaları tarafından kontrol edilir. Proteinlerin dinamin süper ailesinin bir GTPazı olan dinamin ile ilişkili protein 1'in (DRP1) aracılık ettiği mitokondriyal fisyon, küçük ve yuvarlak mitokondri ile sonuçlanır ve mitofaji11,12 tarafından temizlenebilen ve parçalanabilen işlevsiz mitokondrileri izole eder.
Mitofaji, mitokondrileri otofaji ile seçici olarak bozan, genellikle yaralanma, yaşlanma veya stresten sonra hasarlı mitokondrilerde ortaya çıkan hücresel bir süreçtir. Daha sonra, bu mitokondriler bozulma10 için lizozomlara verilir. Bu nedenle, mitofaji, mitokondrinin miktarını ve kalitesini çok çeşitli hücre tiplerinde sağlıklı bir durumda tutmaya yardımcı olan katabolik bir süreçtir. Normal fizyolojik ve stres koşulları altında hücresel homeostazın restorasyonunda çok önemli bir rol oynar13,14. Hücreler, farklı hücresel stres sinyalleri ve gelişimsel değişiklikler tarafından indüklenen karmaşık bir mitofaji mekanizması ile karakterizedir. Mitopaji düzenleyici yolakları ubikitine bağımlı veya reseptöre bağımlı15,16 olarak sınıflandırılır; ubikitin bağımlı otofajiye kinaz PINK1 ve ubikitin ligaz Parkin E3'ün mitokondri17,18'e alınması aracılık ederken, reseptöre bağımlı otofaji, otofaji reseptörlerinin mitokondriyal hasara yanıt olarak mitofajiye aracılık eden mikrotübül ile ilişkili protein hafif zincir LC3'e bağlanmasını içerir19.
İletim elektron mikroskobu (TEM), mitofaji20'yi gözlemlemek ve tespit etmek için en yaygın kullanılan yöntemdir ve hala en iyi yöntemlerden biridir. Mitofajinin morfolojik özellikleri, otofagozomların lizozomlarla füzyonu ile oluşan otofagozomlar veya otolizozomlardır ve elektron mikroskobu görüntülerinden gözlemlenebilir21. Bununla birlikte, elektron mikroskobunun (EM) zayıflığı, mitokondriyal depolarizasyon, mitokondriyal fisyon ve otofagozomların ve lizozomların füzyonu gibi mitofajinin dinamik süreçlerini canlı hücre20'de izleyememektir. Bu nedenle, canlı organelleri görüntüleme yoluyla mitofajiyi değerlendirmek, mitokondriyal araştırmalar için cazip bir alternatif yöntemdir. Burada açıklanan canlı hücre görüntüleme tekniği, mitokondri ve lizozomları boyamak için iki floresan boya kullanır. Mitofaji meydana geldiğinde, otofagozomlar tarafından yutulan hasarlı veya gereksiz mitokondri, mitokondriyal boya tarafından yeşile boyanırken, kırmızı boya lizozomları boyar. Otolizozomlar olarak adlandırılan bu otofagozomların ve lizozomların füzyonu, yeşil ve kırmızı floresanın üst üste binmesine ve sarı noktalar olarak tezahür etmesine neden olur, böylece mitofaji22'nin oluşumunu gösterir. Hücre perkastı mitokondri boyası (MitoTracker Green), mitokondri23'ü etiketlemek için hafif bir tiol-reaktif klorometil moiety içerir. Mitokondrileri etiketlemek için, hücreler plazma zarı boyunca pasif olarak yayılan ve aktif mitokondride biriken boya ile basitçe inkübe edilir. Bu mitokondri boyası canlı hücreleri kolayca lekeleyebilir ve aldehit ile sabitlenmiş veya ölü hücrelerin boyanmasında daha az etkilidir. Lizozom boyası (LysoTracker Red), canlı hücrelerdeki asidik organelleri etiketlemek ve izlemek için kullanılan floresan asidotropik bir probdur. Bu boya, asidik organeller için yüksek bir seçicilik sergiler ve canlı hücreleri nanomolar konsantrasyonlarda etkili bir şekilde etiketleyebilir24.
Bu floresan boyaların, boyaların yüklenmesi ve mitokondri ve lizozomların görselleştirilmesi de dahil olmak üzere canlı hücrelerde kullanılması için prosedürler burada sunulmuştur. Bu yöntem, araştırmacıların canlı hücreli floresan mikroskopi kullanarak mitofajiyi gözlemlemelerine yardımcı olabilir. Mitokondri ve lizozomları ölçmek ve mitokondriyal morfolojiyi değerlendirmek için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre kültürü ve pasaj
NOT: Protokol, örnek olarak rutin olarak kültürlenmiş fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) kullanılarak tanımlanmıştır.
- Kültür MEF hücreleri, 10 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile 10 cm hücre kültürü kaplarında. 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin ve hücreleri mikroskop altında 100x büyütmede izleyin.
- Rutin hücre geçişi gerçekleştirin.
- Hücreler% 80-90 akıcılığa ulaştığında (her 3 günde bir), hücreleri 2 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile yıkayın. Daha sonra hücreleri ayırmak için 1 dakika boyunca 2 mL% 0.05 tripsin-EDTA, ardından tripsin-EDTA'nın etkisini durdurmak için 2 mL DMEM ekleyin. Hücre süspansiyonunu 100 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj edin ve hücre peletini 1 mL DMEM'de yeniden askıya alın.
- Otomatik bir hücre sayacı ve hücre sayma odası slaytları kullanarak hücreleri sayın (bkz. Malzeme Tablosu) ve ardından 1.5 x 106 hücreleri, 10 mL DMEM içeren yeni bir 10 cm'lik hücre kültürü kabına aşılayın.
- Mitofaji testi için, adım 1.2.1'de olduğu gibi bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Hücre süspansiyonunu taze DMEM'de 1 x 105 hücre / mL'ye seyreltin.
- 20 mm'lik bir konfokal kaba 2 mL seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve kültür kabını bir "çapraz" içinde sallayın. Hücre kültürü kabını 37 °C, % 5 CO 2 inkübatöründe24 saat boyunca inkübe edin.
2. Mitokondriyal boyama
- Yeşil floresan mitokondriyal boya ve kırmızı floresan lizozom boyasının stok çözeltisi alikotlarını -20 °C dondurucudan çıkarın.
- DMEM'deki stok çözeltileri 1:1.000 oranında seyrelterek boyaların çalışma çözeltilerini hazırlayın ve iyice karıştırın. Örneğin, her iki boya için 1 μM'lik bir çalışma konsantrasyonu elde etmek için 1 mM mitokondriyal boyanın her birine 2 μL DMEM'e 2 μL mitokondriyal boya ve lizozom boyası ekleyin.
- Ortamı konfokal kültür kabından çıkarın (adım 1.4). Hücreleri örtmek için 1 mL boyama çözeltisi (adım 2.2'de hazırlanan) ekleyin. Hücre kültürü kabını 37 ° C'de bir inkübatöre, 20-30 dakika boyunca% 5 CO 2'ye yerleştirin.
3. Konfokal görüntüleme
- 1 L Krebs-Henseleit (KH) tamponu (138,2 mM NaCl, 3,7 mM KCl, 0,25 mM CaCl 2,1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4,7H2O, 15 mM glikoz ve 21,85 mM HEPES; son pH7,4) hazırlayın ve4 °C'de (1 aya kadar) saklayın.
- Konfokal görüntüleme gününde, KH tamponunu buzdolabından önceden çıkarın ve oda sıcaklığına (20 ila 25 ° C) önceden ısıtın.
- Konfokal mikroskopi görüntüleme yazılımının parametrelerini ayarlayın ( bkz. Malzeme Tablosu): Çift uyarma görüntüleri için, 488 nm ve 543 nm'de sıralı uyarma kullanın ve sırasıyla 505-545 nm ve >560 nm'de emisyon toplayın.
NOT: Görüntüleme ayarlarını aşağıdaki gibi yapın. Tarama Modu: çerçeve; Hız: 9; Ortalama: sayı, 1; Kazanç: 450 ila 600; İğne deliği: 30 ila 200; lazer: %<10. Önce görüntüleme yazılımını başlatmak ve ardından 488 nm lazeri tamamen açmak en iyisidir. 543 nm lazerin kullanımdan önce 3-5 dakika boyunca açılması ve stabilize edilmesi gerekir (Şekil 1A). - Boyayı içeren kültür ortamını inkübatörden çıkarın (adım 2.3) ve kaba 1 mL KH tamponu ekleyin.
- Mitofajiyi indüklemek için, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca KH tamponunda 1 μM'de (son konsantrasyon) karbonil siyanür-4-(triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) ile tedavi edin ve hemen konfokal mikroskop kullanarak hücreleri görüntülemeye devam edin.
- 63x yağlı lensin üst kısmına uygun miktarda yağ uygulayın (bkz. Hücre örneğini konfokal mikroskobun numune aşamasına yerleştirin ve doğrudan objektif lensin üzerine taşıyın.
- Yazılım arabiriminin sol üst köşesindeki Bul sekmesine tıklayarak örneği bulmak için görüntüleme yazılımını kullanın (Şekil 1B). Deneme için yeşil bir filtre kümesi seçin.
- Objektif lensi yukarı ve aşağı hareket ettirerek hızlı bir şekilde odaklanmak için kaba ayar düğmesini kullanın. Hücre örneği göz merceğinden açıkça görülebildikten sonra, tek hücrelerin alanını arayın ve odaklayın ve görüş alanının merkezine taşıyın.
- Görüntüleri almak için yazılım arayüzünün sol üst köşesindeki Edinme sekmesine tıklayın. Önizleme için yalnızca 488 nm kanalı ve kare çözünürlüğü 1024 x 1024'ü seçin.
- Canlı bir tarama başlatmak için sol üst köşedeki Canlı sekmesine tıklayın. Görüş alanını en keskin olana ayarlayın ve kaydırıcıyı sola veya sağa hareket ettirerek lazer gücünü ayarlayın (Şekil 1A). Aşırı pozlamayı önlemek için kazanç ayarını 600'ün altında tutun.
- İğne deliği değerini 156, kazanç değerini 545 ve dijital ofset değerini 0 olarak ayarlayın.
- En iyi görüş alanını seçin, iki kanalı (488 nm ve 543 nm) kontrol edin ve 1024 x 1024 kare çözünürlüğünü seçin. 2B görüntüler elde etmek için Tuttur'u tıklatın. Alınan görüntüleri kaydedin.
NOT: Yeşil mitokondri boyasının 490 nm'de bir uyarma zirvesi ve 516 nm'de bir emisyon zirvesi vardır; 488 nm lazer kullanılarak uyarılabilir. Kırmızı lizozom boyası 576 nm'de bir uyarma zirvesine ve 590 nm'de bir emisyon zirvesine sahiptir; 543 nm lazer kullanılarak uyarılabilir.
4. Görüntü analizi
- Kaydedilen görüntüyü ImageJ ile açın ve birleştirilmiş görüntüyü içine aktarın.
- Her hücredeki sarı noktaların sayısını manuel olarak sayın, bu da lizozomun mitokondri yuttuğunu gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MitoTracker Green, mitokondriye doğru bir şekilde lokalize olabilen yeşil floresan mitokondriyal bir lekedir. Boya, canlı hücreleri kolayca lekeleyebilir ve aldehit ile sabitlenmiş veya ölü hücrelerin boyanmasında daha az etkilidir (Şekil 2). Kırmızı floresan lizozom boyası LysoTracker Red, asidik lizozomal organelleri etiketleyebilir ve izleyebilir ve sadece canlı hücreleri lekeleyebilir (Şekil 2). Konfokal mikroskop görüntüleme, uygun boyalarla boyanmış mitokondri ve lizozomların görüntülenmesini sağlar (Şekil 1 ve Şekil 2).
Mitofaji, mitokondrileri otofaji ile seçici olarak bozan, genellikle yaralanma, yaşlanma veya stres20'den sonra hasarlı mitokondrilerde ortaya çıkan katabolik bir hücresel süreçtir. Daha sonra, bu mitokondriler bozulma için lizozomlara verilir. Mitofaji, çok çeşitli hücre tiplerinde mitokondrinin miktarını ve kalitesini sağlıklı bir durumda tutmaya yardımcı olur. Sağlıklı memeli hücrelerinde, mitofaji nadiren görülür ve bu nedenle bu süreci indüklemek için diğer uyaranlar gereklidir25. Bir mitokondriyal uncoupler olan karbonil siyanür-4 (triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP), dakikalar içinde mitokondriyal membran potansiyelinin ciddi kaybına, hücre içi pH'ın değişmesine ve ardından mitofaji 26,27'ye neden olan spesifik olmayan bir iyonofordur. Bu çalışmada, konfokal görüntüleme için MEF hücrelerinde mitofajiyi tetiklemek için FCCP kullanıldı. Hasarlı yeşil lekeli mitokondri kırmızı lekeli lizozomlar tarafından yutulduğunda, yeşil ve kırmızı floresan sarı birlikte lokalize mitokondri-lizozomları ortaya çıkarmak için üst üste biner (Şekil 3). Şekil 3D ve Şekil 4B'deki sarı noktalar, devam eden mitofajiyi temsil eden bu birlikte lokalize mitokondri-lizozomlara karşılık gelir ve bu nedenle mitofajinin derecesini değerlendirmek için sayılabilir (Şekil 4).
Şekil 1: Konfokal mikroskopi görüntüleme yazılımının görüntüleme parametreleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Canlı hücrelerin konfokal görüntülemesinin şematik gösterimi. Canlı hücreler yeşil-floresan mitokondriyal boya ve kırmızı-floresan lizozomal boya ile birlikte boyanır ve daha sonra canlı hücreler konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenir. Görüntü işleme ve veri analizi, mikroskopla ilişkili görüntüleme yazılımı veya Görüntü J. kullanılarak gerçekleştirilmiştir .
Şekil 3: Canlı hücrelerin konfokal görüntülemesi . (A) Yeşil floresan mitokondri boyası ile boyanmış hücrelerin temsili görüntüleri mitokondrileri göstermektedir. (B) Lizozomu gösteren kırmızı-floresan lizozom boyası ile boyanmış hücrelerin temsili görüntüleri. (C) Her iki floresan boyanın birleştirilmiş görüntüsü. (D) Mitofajisi gösteren genişletilmiş alan. Beyaz ok, kırmızı lizozomlar tarafından yutulmuş yeşil mitokondrileri gösterir. Kısaltma: Ex = uyarma dalga boyu. Yeşil floresan mitokondri boyası, 505-545 nm'de toplanan emisyon ile 488 nm'de uyarılır. Kırmızı floresan lizozom boyası, >560 nm'de toplanan emisyon ile 543 nm'de uyarılır. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: FCCP stimülasyonu ile tetiklenen mitofaji . (A) Yeşil floresan mitokondri boyası ve kırmızı-floresan lizozom boyası ile birlikte boyanmış hücrelerin temsili görüntüleri. (B) 10 dakika boyunca 1 μM FCCP ile muamele edilen hücrelerin temsili görüntüleri. Beyaz ok, kırmızı lizozomlar tarafından yutulmuş yeşil mitokondrileri gösterir. (C) Lizozomal-mitokondri bindirmesi ile gösterilen mitofajinin kantitatif verileri. Veriler ortalama SEM ±, n = 8 hücredir. *p < 0.05 ve kontrol. Ölçek çubukları = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol, canlı hücrelerde otofagozomlar, lizozomlar ve mitokondriyal fisyonu içeren dinamik mitofaji sürecini, hücre perkastlı mitokondri ve lizozom boyaları ile birlikte boyama yoluyla değerlendirmek ve izlemek için bir yöntem sağlar. Yöntem ayrıca mitokondrileri tanımlamak ve mitokondriyal morfolojiyi değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu çalışmada kullanılan her iki boya da ışıktan korunmalı, çoklu donma-çözülme döngülerinden kaçınılmalı ve boyalar mümkün olduğunca tek kullanımlık alikotlarda saklanmalıdır. Doğrudan hücre kültürü ortamına eklenmesini önlemek için boyaların çalışma çözeltilerinin hazırlanması önerilir, bu da yüksek yerel konsantrasyonlara ve boyaların yetersiz karıştırılmasına neden olabilir. Diğer hücresel yapıların lekelenmesini önlemek için, MEF hücreleri konfokal mikroskopla görüntülemeden önce 30 dakika boyunca boyanmalıdır. Boyama prosedürünün görüntülemeden hemen önce yapılması önerilir. MEF hücrelerinde, 1 μM'deki hem mitokondri hem de lizozom boyaları, sırasıyla mitokondri ve lizozomlarda iyi lokalize olup, daha yüksek boya konsantrasyonları, sitotoksisitenin yanı sıra diğer hücresel yapıların spesifik olmayan boyanmasına neden olur. Bu konsantrasyon aynı zamanda H9C2 hücrelerinde mitokondri ve lizozomların boyanması için de idealdir. Diğer hücre hatları için, boyanın organellere iyi lokalize olmasını sağlayan boya konsantrasyonu ve boyama süresinin optimize edilmesi gerekir. Mitokondri ve lizozomların net görüntülerini elde etmek için, görüntü toplama parametreleri (adım 3.3'teki nota bakın) bilinçli olarak ayarlanmalıdır. Bireysel canlı hücre görüntüleri elde etmek için% 50-60'lık hücre birleşimi çok önemlidir ve bu nedenle hücreler tohumlamadan önce sayılmalıdır. Laboratuvarda konfokal tabaklar yoksa, dairesel örtüler alternatif olarak kullanılabilir. Bazı hayvan çalışmalarında, özellikle klinik muayenelerde, mitofajiyi incelemek için güvenilir ve uygun nicel deneylerin bulunmaması nedeniyle hayvan canlı doku örneklerinde mitofajiyi tespit etmek zordur. Bununla birlikte, hayvan dokularından izole edilen hücrelerdeki mitofaji, burada açıklanan protokol kullanılarak değerlendirilebilir. Bu yöntemin bir sınırlaması, her iki boyanın da canlı hücreleri kolayca boyayabilmesine rağmen, ölü veya aldehit ile sabitlenmiş hücreleri boyamada daha az etkili olmalarıdır.
Bu çalışmada kullanılan boyalara ek olarak, sırasıyla MitoMM1/2 ve LysoKK gibi diğer mitokondri ve lizozom izleyicileri, şu anda mitofaji 28,29'u değerlendirmek için araştırmacılar tarafından kullanılabilir. MitoMM1/2, paraformaldehit ile sabitlenmiş hücrelerde veya dokularda mitokondri boyayabilirken, mitofajiyi doğrudan değerlendiremez ve mitofajiyi tespit etmek için anti-LC3B gibi spesifik bir antikor ile çift boyama gerektirir. LysoKK sadece canlı hücreleri boyayabildiğinden, bu boyaların kombinasyonu sadece canlı hücrelerdeki mitokondriyal otofajiyi de tespit edebilir28,29. Bununla birlikte, MitoMM1/2'nin kullanımı kolaydır ve TRITC filtresinin kullanımına izin verir (mavi bir lazer kullanırken uyarma göstermediğinden ve yeşil emisyon üretmediğinden). LysoKK organelleri 5 dakika içinde boyayabilir ve çok sayıda uyaranın hızlı bir şekilde izlenmesini ve değerlendirilmesini kolaylaştırır28,29.
Mitofaji, hücrelerde farklı hücresel stres sinyalleri ve gelişimsel değişiklikler tarafından indüklenen karmaşık bir mekanizma yoluyla oluşur. Mitokondriyal oksidatif fosforilasyonun güçlü bir çözücüsü olan FCCP, bu çalışmada mitofajiyi indüklemek için kullanılan spesifik olmayan bir iyonofor26'dır. FCCP (1 μM), protonları iç mitokondriyal membran boyunca taşıyarak proton gradyanına müdahale eder, bu da hücre içi pH'da bir değişikliğe neden olan bir süreçtir. Bu nedenle, FCCP dakikalar içinde mitokondriyal membran potansiyelinde ciddi bir kayba neden olabilir ve daha sonra Parkin ve mikrotübül ile ilişkili protein hafif zincir 3'ü (LC3) mitokondri 26,27,30'a alarak mitokondriyal otofajiyi indükleyebilir. Mitopaji düzenleyici yolaklar ubikitine bağımlı (PINK1-parkin aracılı) veya reseptöre bağımlı (LC3 ve diğer reseptörlerin aracılık ettiği) olarak sınıflandırılır15,16. Mitofaji, LC3B gibi reseptöre bağımlı otofajik yolaktaki anahtar moleküllere bağlanan spesifik antikorlar kullanılarak incelenmiş, ardından kırmızı floresan lizozom boyası31,32 ile birlikte boyanmıştır. Bu protokolde kullanılan boyaları kullanarak bu iki yol arasında ayrım yapmak zor olsa da, canlı hücrelerdeki mitofajinin derecesini değerlendirmek ve mitokondriyal morfolojiyi değerlendirmek için basit bir yöntem sunarlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81970333,31901044) ve Şangay Yüksek Öğrenim Kurumlarında Özel Atama Profesörü Programı (GZ2020008) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated cell counter | Countstar | IC1000 | |
| Cell counting chamber slides | Countstar | 12-0005-50 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
| Glass bottom cell culture dish (confocal dish) | NEST | 801002 | |
| Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Krebs–Henseleit(KHB) buffer | Self-prepared | ||
| LysoTracker Red | Invitrogen | 1818430 | 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye |
| MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Self-prepared | ||
| Objective (63x oil lens) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
| ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) | ZEISS | ZEN 2.1 |
References
- Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
- Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
- Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
- Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).
- Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
- Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
- Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
- Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).
- Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
- Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
- Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).
- Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
- Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
- Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
- Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
- Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
- Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
- Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
- Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
- Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).
