Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen histonmodifizierenden Enzymen und Transkriptionsfaktoren in vivo durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64656
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

Summary

Der Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) ist ein bildgebendes Verfahren zum Nachweis von Proteininteraktionen in lebenden Zellen. Hier wird ein FRET-Protokoll vorgestellt, um die Assoziation von Histon-modifizierenden Enzymen mit Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, die sie zu den Zielpromotoren für die epigenetische Regulation der Genexpression in Pflanzengeweben rekrutieren.

Abstract

Die epigenetische Regulation der Genexpression wird häufig durch histonmodifizierende Enzyme (HMEs) beeinflusst, die heterochromatische oder euchromatische Histonmarkierungen für die transkriptionelle Unterdrückung bzw. Aktivierung erzeugen. HMEs werden durch Transkriptionsfaktoren (TFs) zu ihrem Zielchromatin rekrutiert. Daher ist die Erkennung und Charakterisierung direkter Interaktionen zwischen HMEs und TFs entscheidend, um ihre Funktion und Spezifität besser zu verstehen. Diese Studien wären biologisch relevanter, wenn sie in vivo in lebendem Gewebe durchgeführt würden. Hier wird ein Protokoll zur Visualisierung von Wechselwirkungen in Pflanzenblättern zwischen einer pflanzlichen Histon-Deubiquitinase und einem Pflanzentranskriptionsfaktor mittels Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) beschrieben, das den Nachweis von Komplexen zwischen Proteinmolekülen ermöglicht, die innerhalb von <10 nm voneinander entfernt sind. Zwei Varianten der FRET-Technik werden vorgestellt: SE-FRET (sensibilisierte Emission) und AB-FRET (Akzeptorbleiche), bei der die Energie strahlenfrei vom Donor auf den Akzeptor übertragen oder vom Donor beim Photobleaching des Akzeptors strahlend emittiert wird. Sowohl SE-FRET- als auch AB-FRET-Ansätze können leicht angepasst werden, um andere Wechselwirkungen zwischen anderen Proteinen in planta zu entdecken.

Introduction

Pflanzliche Histon-Deubiquitinasen spielen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Genexpression durch posttranslationale Modifikation von Histonen, insbesondere durch Löschen ihrer Monoubiquitylierungsmarkierungen1. OTLD1 ist bisher eines der wenigen pflanzlichen Histon-Deubiquitinasen, die auf molekularer Ebene in Arabidopsis 2,3 charakterisiert wurden. OTLD1 entfernt Monoubiquitingruppen aus den H2B-Histonmolekülen und fördert dadurch die Entfernung oder Addition von euchromatischer Acetylierung und Methylierungsmodifikationen von H3-Histonen im ZielgenChromatin 4,5. Darüber hinaus interagiert OTLD1 mit einem anderen chromatinmodifizierenden Enzym, der Histon-Lysin-Demethylase KDM1C, um die transkriptionelle Unterdrückung der Zielgene 6,7 zu beeinflussen.

Die meisten Histon-modifizierenden Enzyme haben keine DNA-Bindungsfähigkeiten und können daher ihre Zielgene nicht direkt erkennen. Eine Möglichkeit ist, dass sie mit DNA-bindenden Transkriptionsfaktor-Proteinen zusammenarbeiten, die diese Enzyme binden und zu ihren Chromatinzielen leiten. Insbesondere in Pflanzen ist bekannt, dass mehrere wichtige Histon-modifizierende Enzyme (d. h. Histon-Methyltransferasen 8,9, Histonacetyltransferasen 10, Histon-Demethylasen 11 und Polycomb-Repressionskomplexe12,13,14) durch Transkriptionsfaktoren rekrutiert werden. In Übereinstimmung mit dieser Idee wurde kürzlich ein möglicher Mechanismus für die OTLD1-Rekrutierung zu den Zielpromotoren vorgeschlagen, der auf spezifischen Protein-Protein-Interaktionen von OTLD1 mit einem Transkriptionsfaktor LSH1015 basiert.

LSH10 gehört zu einer Familie der pflanzlichen ALOG-Proteine (Arabidopsis LSH1 und Oryza G1), die als zentrale Entwicklungsregulatorenfungieren 16,17,18,19,20,21,22. Die Tatsache, dass die Mitglieder der ALOG-Proteinfamilie DNA-bindende Motive 23 enthalten und die Fähigkeiten zur Transkriptionsregulation22, Kernlokalisation19 und Homodimisierung24 aufweisen, unterstützt die Annahme, dass diese Proteine, einschließlich LSH10, während der epigenetischen Regulation der Transkription als spezifische Transkriptionsfaktoren wirken können. Eine der wichtigsten experimentellen Techniken zur Charakterisierung der LSH10-OTLD1-Wechselwirkung in vivo ist der Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)15.

FRET ist ein bildgebendes Verfahren zur direkten Detektion von Nahbereichswechselwirkungen zwischen Proteinen innerhalb von <10 nm voneinanderentfernt von 25 lebenden Zellen. Es gibt zwei Hauptvarianten des FRET-Ansatzes26: sensibilisierte Emission (SE-FRET) (Abbildung 1A) und Akzeptorbleiche (AB-FRET) (Abbildung 1B). In SE-FRET übertragen die interagierenden Proteine - von denen eines mit einem Donorfluorochrom (z. B. grün fluoreszierendes Protein, GFP) und das andere mit einem Akzeptor Fluorochrom (z. B. monomeres rot fluoreszierendes Protein, mRFP27,28) markiert ist - nicht-strahlend die Energie des angeregten Zustands vom Donor auf den Akzeptor. Da bei dieser Übertragung keine Photonen emittiert werden, entsteht ein fluoreszierendes Signal, das ein Strahlungsemissionsspektrum ähnlich dem des Akzeptors aufweist. In AB-FRET werden Proteininteraktionen basierend auf einer erhöhten Strahlungsemission des Donors detektiert und quantifiziert, wenn der Akzeptor durch Photobleaching dauerhaft inaktiviert wird und daher nicht in der Lage ist, die vom Donor übertragene nicht-strahlende Energie zu empfangen (Abbildung 1). Wichtig ist, dass die subzelluläre Lage der FRET-Fluoreszenz auf die Lokalisation der interagierenden Proteine in der Zelle hinweist.

Die Fähigkeit, FRET in lebenden Geweben einzusetzen und die subzelluläre Lokalisation der interagierenden Proteine gleichzeitig mit dem Nachweis dieser Interaktion an sich zu bestimmen, macht FRET zur Technik der Wahl für Studien und die erste Charakterisierung von Protein-Protein-Interaktionen in vivo. Eine vergleichbare In-vivo-Fluoreszenzbildgebungsmethode, die bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC)29,30,31,32, ist ein guter alternativer Ansatz, obwohl BiFC im Gegensatz zu FRET aufgrund der spontanen Assemblierung der autofluoreszierenden BiFC-Reporter 33 falsch positive Ergebnisse erzeugen kann und die Quantifizierung seiner Daten weniger präzise ist.

Dieser Artikel teilt die erfolgreichen Erfahrungen bei der Implementierung von SE-FRET- und AB-FRET-Techniken und stellt ein Protokoll für ihren Einsatz vor, um die Wechselwirkungen zwischen OTLD1 und LSH10 in Pflanzenzellen zu untersuchen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Für die vorliegende Studie wurden Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA105 oder GV3101 verwendet.

1. FRET-Vektorkonstruktion

  1. Wählen Sie fluoreszierende Tags für das FRET-Paar Donor/Akzeptor aus.
    1. Verwenden Sie EGFP aus pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (siehe Materialtabelle), um den Donorvektor zu erzeugen.
    2. Verwenden Sie mRFP aus pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (siehe Materialtabelle), um den Akzeptorvektor zu generieren.
  2. Generieren Sie die Spender/Akzeptor-FRET-Konstrukte unter Verwendung einer standortspezifischen Rekombinationsklonierungstechnik34, wie dem Gateway-Rekombinationsklonierungssystem35.
    1. Amplifizieren Sie die kodierenden Sequenzen der interessierenden Proteine36 (d.h. die Arabidopsis OTLD1 und LSH10)15.
      HINWEIS: Es ist auch eine gute Idee, eine negative Kontrolle zu verwenden, die ein Homolog eines der interagierenden Proteine darstellt, aber keine Wechselwirkung zeigt; Die OTLD1-LSH10-Interaktionsstudie verwendet ein Homolog von LSH10, LSH4, das OTLD1 nicht erkennt. OTLD1-, LSH10- und LSH4-cDNAs werden mittels PCR unter Verwendung der in Tabelle 1 aufgeführten Primer amplifiziert.
    2. Klonen von OTLD1, LSH10 und LSH4 in den Eintrittsvektor pDONR207 durch die ortsspezifische Rekombinationsklonierungstechnik34.
    3. Verwenden Sie das Gateway LR Clonase II (siehe Materialtabelle), um LSH10 und LSH4 von pDONR207 in den binären Zielvektor pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 zu übertragen, um die binären Donorkonstrukte p35S::LSH10-GFP (getestetes Konstrukt) und p35S::LSH4-GFP (Negativkontrolle) zu erzeugen.
    4. Verwenden Sie dasselbe kommerziell erhältliche Enzym (Schritt 1.2.3), um OTLD1 von pDONR207 in den binären Zielvektor pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 zu übertragen, um das binäre Akzeptorkonstrukt p35S:: OTLD1-mRFP (getestetes Konstrukt) zu erzeugen.
    5. PCR-amplify36 mRFP aus pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 unter Verwendung der in Tabelle 1 aufgeführten Primer, klonen Sie es durch die Rekombinationsklonierungstechnik in pDONR207 und verwenden Sie dann LR Clonase II, um mRFP in pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 zu übertragen, um das binäre Fusionskonstrukt p35S::mRFP-GFP (Positivkontrolle) zu erzeugen.
  3. Führen Sie die Umwandlung der Spender- und Akzeptorkonstrukte in Agrobacterium durch.
    1. 1 μg jedes Plasmids aus den Schritten 1.2.3-1.2.5 bis 100 μL der Kultur kompetenter Zellen des Agrobacterium tumefaciens-Stammes EHA105 oder GV3101 zugeben, die unter Verwendung der Standardprotokolle 37 hergestellt oder kommerziell gewonnen wurden, und 5 min lang bei37 °C inkubieren.
    2. 1 ml LB-Medium (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt und 1% NaCl; siehe Materialtabelle) in die zuständige Zellmischung geben und bei 200 U/min und 28°C für 1,5 h rühren. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 3.000 × g für 1 min bei Raumtemperatur.
    3. Resuspendieren Sie die Zellen in 0,1 ml LB-Medium durch Pipettieren und verteilen Sie sie auf LB-Agar, ergänzt mit den entsprechenden Antibiotika (z. B. 0,01% Spectinomycin und 0,005% Rifampicin; siehe Materialtabelle). 2 Tage bei 28 °C anbauen.
    4. Wählen Sie einzelne Kolonien und impfen Sie jede von ihnen separat in 1 ml LB-Brühe, ergänzt mit den entsprechenden Antibiotika.
    5. Die Zellen werden 24 h lang bei 28 °C gezüchtet und 0,2 ml der Kultur in ein neues Röhrchen überführt. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei 10.000 × g für 30 s bei Raumtemperatur gesammelt.
    6. Extraktion von Plasmid-DNA nach einem Standardprotokoll zur Isolierung von Plasmiden aus Agrobacterium-Zellen 38 und Resuspendierung der extrahierten DNA in30 μL Wasser. Um die Kolonien zu identifizieren, die die gewünschten Plasmide beherbergen, verwenden Sie 2 μL des DNA-Präparats als Vorlage für die PCR mit genspezifischen Primern, die in Tabelle 1 aufgeführt sind. 0,7 ml der identifizierten Kultur mit 0,3 ml Glycerin mischen und bei -80 °C lagern.

2. Agroinfiltration

  1. Züchten Sie Nicotiana benthamiana Pflanzen.
    HINWEIS: Während des gesamten Experiments müssen alle Pflanzen gesund sein.
    1. Säen und züchten Sie N. benthamiana Samen in einem Topf mit nasser Erde in hoher Dichte.
    2. Halten Sie die gepflanzten Samen in einer Wachstumskammer bei 23 °C mit 16 h Licht und 8 h Dunkelzyklus mit 150-170 μmol/m2s Lichtintensität, bis der Durchmesser des Euphylls 0,5 cm erreicht.
    3. Die Sämlinge in größere Töpfe geben und in derselben Kammer mit den gleichen Parametern wachsen lassen.
      HINWEIS: Pflanzen sind bereit für die Agroinfiltration, wenn ihre größten Blätter einen Durchmesser von 5-7 cm haben, normalerweise innerhalb von 4-5 Wochen. In kleineren Anlagen, die zu jung sind, sind die Auswirkungen der Agroinfiltration für die FRET-Analyse zu schwerwiegend.
  2. Bereiten Sie Bakterienzellen für die Agroinfiltration vor.
    1. Jede Agrobacterium-Kolonie, die die FRET-Konstrukte enthält, züchtet über Nacht in 5 ml LB-Medium, ergänzt mit den entsprechenden Antibiotika (Schritt 1.3.3) und 150 μM Acetosyringon bei 28 °C (siehe Materialtabelle).
    2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 3.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
    3. Resuspendieren Sie die Zellen im Agroinfiltrationspuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 150 μM Acetosyringon) auf OD600 = 0,5.
    4. Kombinieren Sie die resuspendierten Zellen im Verhältnis 1:1 v/v zwischen den Zellen, die die entsprechenden Konstrukte beherbergen (Schritt 2.2.5).
    5. Für die Agroinfiltrationen mit doppeltem Konstrukt mischen Sie die Aliquots zweier Kulturen und bei Agroinfiltrationen mit einem Konstrukt die Aliquots derselben Kultur:
      1. Getestete Proteine: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (Bakterien, die die Konstrukte p35S::OTLD1-mRFP und p35S::LSH10-GFP beherbergen).
      2. Negativkontrolle: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (Bakterien, die die Konstrukte p35S::OTLD1-mRFP und p35S::LSH4-GFP beherbergen).
      3. Negativkontrolle: LSH10-GFP + freies mRFP (Bakterien, die die Konstrukte p35S::LSH10-GFP und pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 beherbergen).
      4. Positivkontrolle: mRFP-GFP (Bakterien, die das p35S::mRFP-GFP-Konstrukt beherbergen).
    6. Die Zellen bei 28 °C für 0,5-1 h inkubieren.
  3. Führen Sie Agroinfiltration durch.
    1. Laden Sie die Bakterienkultur in eine 1 ml nadellose Spritze.
    2. Drücken Sie die Düse der Spritze vorsichtig, aber fest gegen die abaxiale Seite der vollständig expandierten N. benthamiana-Blätter , während Sie das Blatt mit einem behandschuhten Finger auf der adaxialen Seite halten.
    3. Infiltrieren Sie bis zu vier Flecken auf einem Blatt, drei Blätter pro Pflanze, zwei oder drei Pflanzen für jede Bakterienkultur. Wechseln Sie die Handschuhe zwischen den Proben, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
    4. Die agroinfiltrierten Pflanzen werden 24 h bis 36 h lang unter den gleichen Bedingungen, wie in Schritt 2.1.2 beschrieben, in derselben Wachstumskammer gehalten. Bewahren Sie die agroinfiltrierten Pflanzen nicht länger als 36 h auf, da dies das Fluoreszenzsignal reduziert.

3. Konfokale Mikroskopie

  1. Bereiten Sie Objektträger für die Fluoreszenzvisualisierung vor.
    1. Nach 24-36 h der Infiltration schneiden Sie jedes agroinfiltrierte Blatt mit einer Rasierklinge in kleine Stücke (2 mm x 4 mm) zwischen den Adern.
    2. Legen Sie die Blattstücke auf einen Glasobjektträger, wobei die abaxiale Blattoberfläche nach oben zeigt. Geben Sie einen Tropfen Wasser auf die Blattstücke und bedecken Sie sie mit dem Deckglas. Klopfen Sie leicht auf das Deckglas, um Luftblasen zu entfernen.
    3. Schalten Sie das Mikroskop und den Laser ein (siehe Materialtabelle). Legen Sie den Objektträger in den Plattenhalter des Mikroskops, um ihn unter den spezifischen FRET-Parametern abzubilden (Schritte 3.2 und 3.3).
    4. Beginnen Sie die Beobachtungen mit einem 10-fachen Objektiv, um Zellen zu identifizieren, die sowohl das GFP- als auch das mRFP-Signal aufweisen, und verwenden Sie dann ein 40-faches Objektiv für nachfolgende detaillierte Beobachtungen.
      HINWEIS: Wichtig ist, dass SE-FRET und AB-FRET normalerweise an derselben Gewebeprobe durchgeführt werden, so dass die gleichen Kanaleinstellungen (Schritt 3.2) verwendet werden können, mit Ausnahme des FRET-Kanals, der für die SE-FRET- bzw. AB-FRET-Beobachtungen ein- bzw. ausgeschaltet wird (Schritte 3.2.2.3 und 3.3.1).
  2. Richten Sie die Parameter für SE-FRET ein (Abbildung 1A).
    1. Öffnen Sie das MDE-Tool (Multi-Dimensional Acquisition).
    2. Richten Sie einen Satz von drei konfokalen Kanälen im selben Sichtfeld ein (ergänzende Abbildung 1).
      1. Stellen Sie den Donorkanal (den GFP-Kanal) für die Anregung und Emission des Donorfluorochroms mit dem 405 nm Anregungslaser und dem 400-597 nm Emissionsfilter ein.
      2. Stellen Sie den Akzeptorkanal (den mRFP-Kanal) für die Anregung und Emission des Akzeptors Fluorochrom mit dem 561 nm Anregungslaser und dem 400-597 nm Emissionsfilter ein.
        HINWEIS: Der Emissionsfilter für mRFP wurde auf 400-597 nm eingestellt, um das mRFP-Signal vom FRET-Signal bei 597-617 nm zu trennen (Schritt 3.2.2.3) und somit die FRET-unabhängige mRFP-Emission zu reduzieren.
      3. Stellen Sie den FRET-Kanal für die Anregung des Donators und die Emission der Akzeptorfluorochrome mit dem 405 nm Anregungslaser und dem 597-617 nm Emissionsfilter ein.
    3. Stellen Sie die Anregungsintensität des Spenders auf ein Mindestniveau ein, um FRET zu beobachten und gleichzeitig Photobleaching zu vermeiden, wodurch die SE-FRET-Effizienz verringert wird.
      HINWEIS: Diese Anregungsintensität wird experimentell ausgewählt, bevor das FRET-Verfahren durchgeführt wird, um Photobleaching zu vermeiden. Es variiert je nach Blattdicke, Alter und Zeit nach Überexpression.
    4. Stimulieren Sie den Spender und suchen Sie nach Zellen, die das erwartete Fluoreszenzsignal des Akzeptors enthalten.
    5. Wählen Sie den Bereich aus, der das interessierende Fluoreszenzsignal enthält.
    6. Erfassen Sie eine SE-FRET-Bildsequenz, indem Sie die Taste "Einrasten" drücken.
      1. Bild 10-15 Zellen, die zuerst das mRFP-GFP-Konstrukt (Positivkontrolle) exprimieren; Passen Sie die Parameter für Fokus, Zoom und intelligente Verstärkung an, um sich auf den zu erfassenden Bereich zu konzentrieren (ergänzende Abbildung 2).
      2. Mit den gleichen Einstellungen stellen Sie 10-15 Zellen vor, die jeweils OTLD1-mRFP, freie mRFP, LSH10-GFP oder LSH4-GFP separat ausdrücken.
        HINWEIS: Diese Bilder werden vom Plug-in "PixFRET" von ImageJ (siehe Materialtabelle) erfasst, das für die FRET-Datenanalysen (Schritt 3.4.1) verwendet wurde, um die spektralen Durchblutungswerte (SBT) für die Akzeptoren und die Donatoren zu bestimmen. Diese Bilder werden von der Software verwendet, um die SE-FRET-Images für die OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP und LSH10-GFP + freie mRFP-Proteinpaare zu generieren (Schritt 3.2.6.3).
      3. Mit den gleichen Einstellungen stellen Sie auch 10-15 Zellen vor, die OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP und LSH10-GFP + freie mRFP-Proteinpaare koexprimieren.
  3. Richten Sie Parameter für AB-FRET ein (Abbildung 1B).
    1. Verwenden Sie die für SE-FRET eingestellten Parameter für den Donor- und Akzeptorkanal (Schritt 3.2.2), deaktivieren Sie jedoch den FRET-Kanal.
    2. Stellen Sie die Parameter für das Photobleaching des Akzeptors (mRFP) ein (ergänzende Abbildung 3).
      1. Stellen Sie sicher, dass das Bleichen nach fünf Bildern beginnt. Lassen Sie 200 Iterationen für jedes Flächenbleichmittel zu. Halten Sie 100% Laserintensität bei 561 nm.
      2. Halten Sie eine Bleichdauer von 45 s ein. Stellen Sie eine Scangeschwindigkeit von 512 x 512 Pixel bei 400 Hz sicher.
    3. Zeichne den Bereich der zu bleichenden Zelle; Zum Beispiel werden für Kernwechselwirkungen Regionen von Interesse um die gesamte Fläche des Zellkerns39 gezeichnet.
    4. Aktivieren Sie das Bleichen, indem Sie die Schaltfläche Experiment starten drücken. Wenn Sie diese Funktion aktivieren, wird das Photobleaching durchgeführt und die AB-FRET-Bildsequenz erfasst.
  4. Analysieren Sie die FRET-Daten.
    1. Verwenden Sie für die Analyse von SE-FRET-Daten das Plug-in "PixFRET" für die ImageJ-Software, um korrigierte Bilder der SE-FRET-Effizienz nach Subtraktion von SBT40 zu erzeugen (Schritt 3.2.6.2).
    2. Für die Analyse der AB-FRET-Daten berechnen Sie %AB-FRET als prozentualen Anstieg der GFP-Emission nach mRFP-Photobleiche mit der folgenden Formel41: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, wobei GFPpost die GFP-Emission nach mRFP-Photobleiche und GFPpre die GFP-Emission vor der mRFP-Photobleiche ist.
    3. Achten Sie bei der Überprüfung der FRET-Bilder auf die subzelluläre Lokalisierung des FRET-Signals.
      HINWEIS: In vielen Fällen können diese zellulären Kompartimente (z. B. Zellkern, Chloroplasten, ER usw.) leicht identifiziert werden und liefern als zusätzlicher Vorteil der FRET-Technik wichtige Hinweise auf die biologische Funktion der interagierenden Proteine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Abbildung 2 zeigt die typischen Ergebnisse eines SE-FRET-Experiments, bei dem die Zellkerne gleichzeitig in drei Kanälen (d.h. Donor GFP, Akzeptor mRFP und SE-FRET) aufgezeichnet wurden. Diese Daten wurden verwendet, um Bilder der SE-FRET-Effizienz zu erzeugen, die in einer Pseudo-Farbskala codiert sind. Auf dieser Skala entspricht der Übergang von Blau zu Rot einer Steigerung der FRET-Effizienz, einem Maß für die Protein-Protein-Nähe von 0% bis 100%. In diesem repräsentativen Experiment wurde das SE-FRET-Signal im Zellkern aufgezeichnet, und seine Intensität nach der Koexpression von LSH10 und OTLD1 war vergleichbar mit der nach der Expression der mRFP-GFP (d.h. Positivkontrolle). Bei Negativkontrollen wurde kein SE-FRET beobachtet (d. h. Koexpression von OTLD1-mRFP und LSH4-GFP oder freiem mRFP und LSH10-GFP).

Die LSH10-OTLD1-Wechselwirkungen wurden mit AB-FRET quantifiziert. Dazu wurde die Donor-GFP-Fluoreszenz im Zellkern vor und nach der Photobleiche des Akzeptors mRFP als Photobleichzeitreihe von Donor- und Akzeptorfluoreszenzmessungen aufgezeichnet (ergänzende Abbildung 4). Die Bilder der aufgezeichneten Zellkerne wurden in Pseudofarbe präsentiert, um die Veränderung der GFP-Fluoreszenz zu quantifizieren. Abbildung 3 zeigt, dass die LSH10-GFP/OTLD1-mRFP-Koexpression zu einer erhöhten GFP-Donorfluoreszenz führte, nachdem der mRFP-Akzeptor photogebleicht wurde und seine Fähigkeit zur Fluoreszenz verlor. Ein ähnlicher Anstieg der Donorfluoreszenz wurde in der mRFP-GFP-Positivkontrolle beobachtet, aber nicht in den Negativkontrollen der LSH4-GFP/OTLD1-mRFP- oder LSH10-GFP/mRFP-Koexpression, während die Akzeptorfluoreszenz in allen Photobleichexperimenten inaktiviert war. Abbildung 4 zeigt die quantitative Analyse der AB-FRET-Daten, die den statistisch signifikanten Anstieg der Donorfluoreszenz (%AB-FRET) um etwa 13% nach Koexprimierung von LSH10 und OTLD1 zeigt. Die positive mRFP-GFP-Kontrolle ergab %AB-FRET von etwa 30%, während die Negativkontrollen keine %AB-FRET ergaben. Sowohl SE-FRET- als auch AB-FRET-Bilder zeigten das FRET-Signal im Zellkern, was mit der subzellulären Lokalisation übereinstimmt, die für die Transkriptionsfaktor-Histon-modifizierenden Enzymkomplexe sowie für die nukleozytoplasmatische Natur der GFP/mRFP-Proteine34 erwartet wird (Abbildung 2 und Abbildung 3).

Zusammenfassend zeigen die repräsentativen Daten, dass dieses FRET-Protokoll verwendet werden kann, um Interaktionen zwischen Histon-modifizierenden Enzymen und Transkriptionsfaktoren zu demonstrieren und zu quantifizieren und deren subzelluläre Lokalisation in lebenden Pflanzenzellen zu bestimmen.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Zusammenfassung der Techniken SE-FRET und AB-FRET. (A) Das Grundprinzip von SE-FRET. Eines der getesteten Proteine ist mit GFP markiert, das als Donorfluorochrom fungiert, und das andere mit mRFP, das als Akzeptor Fluorochrom fungiert. Das Donormolekül wird angeregt und die Akzeptoremission aufgezeichnet. Wenn die getesteten Proteine so miteinander wechselwirken, dass sie innerhalb von 10 nm voneinander positioniert sind, wird die Energie des angeregten Donors strahlungsfrei auf den Akzeptor übertragen, der dann angeregt wird und Fluoreszenz im FRET-Emissionskanal emittiert. Wenn keine Wechselwirkung auftritt, wird keine Energie vom Donor auf den Akzeptor übertragen und keine FRET-Emission durch den Akzeptor detektiert. (B) Das Grundprinzip von AB-FRET. Die getesteten Proteine sind wie unter (A) für SE-FRET beschrieben markiert. Das Spendermolekül wird angeregt, und wenn die Wechselwirkung zwischen den getesteten Proteinen auftritt, regt der Donor den Akzeptor auf nicht-strahlende Weise an, was zu FRET führt. Dann wird der Akzeptor durch Photobleiche dauerhaft inaktiviert, wodurch seine Fähigkeit verloren wird, nicht-strahlende Energie vom Donor aufzunehmen und die FRET-Fluoreszenz im FRET-Emissionskanal zu emittieren; Die vom Donor emittierte Fluoreszenz ist dagegen erhöht, da der Spender durch den nichtstrahlenden Transfer weniger Energie verliert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Spezifische Interaktion von LSH10 mit OTLD1 in N. benthamiana Blättern, nachgewiesen durch SE-FRET. Für die angegebenen Proteinkombinationen werden Bilder von drei Detektionskanälen (Donor, Akzeptor und SE-FRET) gezeigt. Die SE-FRET-Effizienzbilder wurden durch Subtraktion des spektralen Durchblutens (SBT) berechnet und sind in Pseudofarbe dargestellt, wobei die Farben Rot und Blau das höchste bzw. das niedrigste Signal anzeigen. (A) Signal mit hohem SE-FRET-Wirkungsgrad, das von der mRFP-GFP-Positivkontrolle erzeugt wird. (B) Positives SE-FRET-Effizienzsignal, das von den interagierenden LSH10-GFP- und OTLD1-mRFP-Proteinen erzeugt wird. (C) Die Koexpression des Negativkontrollproteins LSH4-GFP und OTLD1-mRFP erzeugte kein SE-FRET-Effizienzsignal. (D) Die Koexpression des negativen kontrollfreien mRFP-Proteins und LSH10-GFP erzeugte kein SE-FRET-Effizienzsignal. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Spezifische Interaktion von LSH10 mit OTLD1 in N. benthamiana Blättern, nachgewiesen durch AB-FRET. Für die angegebenen Proteinkombinationen werden Bilder von zwei Detektionskanälen (Donor und Akzeptor) vor und nach der Photobleiche gezeigt. Der Kreis zeigt den photogebleichten Bereich an. AB-FRET, visualisiert als Anstieg der GFP-Fluoreszenz nach mRFP-Photobleiche, wird mit Pseudofarbe mit den Farben Rot und Blau angezeigt, was das höchste bzw. niedrigste Signal bedeutet. (A) Eine Erhöhung der GFP-Donorfluoreszenz, die durch die mRFP-GFP-Positivkontrolle erzeugt wird. (B) Eine Erhöhung der GFP-Donorfluoreszenz, die durch die wechselwirkenden LSH10-GFP- und OTLD1-mRFP-Proteine erzeugt wird. (C) Die Koexpression des Negativkontrollproteins LSH4-GFP und OTLD1-mRFP führte zu vernachlässigbaren Veränderungen in der GFP-Donorfluoreszenz. (D) Die Koexpression des negativen kontrollfreien mRFP-Proteins und LSH10-GFP führte zu vernachlässigbaren Veränderungen in der GFP-Donorfluoreszenz. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Eine Quantifizierung von AB-FRET. Der prozentuale Anstieg der GFP-Donorfluoreszenz nach mRFP-Photobleiche (%AB-FRET) wird für die angegebenen Proteinkombinationen gezeigt. Fehlerbalken stellen den Mittelwert für n = 13 Zellen für jede Messung dar. Der zweiseitige t-Test ergab, dass Unterschiede zwischen den Mittelwerten für die p-Werte *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 statistisch signifikant sind; S≥ 0,05 sind statistisch nicht signifikant (NS). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Name der Grundierung Sequenz (5ʹ bis 3ʹ) Zweck
OTLD1 Fw ggggacaagtttgtacaaaaagcaggctcaatgactcggattttcaaag OTLD1 aus cDNA amplifizieren
OTLD1 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgtgttcgtgtggctttgcctttgcgtc OTLD1 aus cDNA amplifizieren
LSH10 Fw ggggacaagtttgtacaaaaagcaggctcaatgtcctctccaagagaaagagg Amplify LSH10 aus cDNA
LSH10 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgatgtcaacagagactaaagaaac Amplify LSH10 aus cDNA
LSH4 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggatcatatcatcggctttatg LSH4 aus cDNA amplifizieren
LSH4 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgattagggctacttgaaatcgcc LSH4 aus cDNA amplifizieren
mRFP Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggcctcctccgaggacgt Verstärkung von mRFP von pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
mRFP Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtggagatctgcggccgcgg Verstärkung von mRFP von pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
AttL1 tcgcgttaacgctagcatggatctc Bestätigung von Sequenzen in pDONR207 durch PCR und DNA-Sequenzierung
AttL2 gtaacatcagagattttgagacac Bestätigung von Sequenzen in pDONR207 durch PCR und DNA-Sequenzierung
AttB1 Fw ggggacaagtttgtac aaaaaagcaggct Bestätigung von Sequenzen in Zielvektoren durch PCR und DNA-Sequenzierung
AttB2 Rv ggggaccactttgta caagaaagctgggt Bestätigung von Sequenzen in Zielvektoren durch PCR und DNA-Sequenzierung
35S Promoter Fw ctatccttcgcaagacccttc Sequenzen in Zielvektoren mittels PCR bestätigen

Tabelle 1: Primer zum Klonen und Bestätigen der klonierten Sequenzen in pDONOR207 und Zielvektoren. Fw, vordere Grundierungen; Rv, umgekehrte Grundierungen.

Ergänzende Abbildung 1: Einstellen von Parametern für konfokale Kanäle. (A) Screenshot für die Einstellung der Anregungs- und Emissionsparameter für den Donorkanal (GFP). (B) Screenshot für die Einstellung der Anregungs- und Emissionsparameter für den Akzeptorkanal (mRFP). (C) Screenshot für die Einstellung der Anregungs- und Emissionsparameter für den FRET-Kanal. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Anpassung der Parameter für die Aufnahme von SE-FRET-Bildern der interessierenden Stichprobe. (A) Screenshot für die Einstellung der Scanbereichsparameter (d. h. Bildgröße, Scangeschwindigkeit, Richtung und Mittelwertbildung). (B) Screenshot für die Einstellung der GFP-Kanalparameter (d. h. Laser, Pinhole, Master-Verstärkung und digitale Verstärkung). (C) Screenshot für die Einrichtung der mRFP-Kanalparameter (d. h. Laser, Pinhole, Master-Verstärkung und digitale Verstärkung). (D) Screenshot für die Einrichtung der FRET-Kanalparameter (d. h. Laser, Pinhole, Master-Verstärkung und digitale Verstärkung). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Einstellung der Parameter für die Akzeptor-Photobleiche. (A) Screenshot für die Einstellung der Scanbereichsparameter (d. h. Bildgröße, Scangeschwindigkeit, Richtung und Mittelwertbildung). (B) Screenshot für die Einrichtung der Zeitreihe und der Zeitbleichparameter. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Zeitreihen der Donor- und Akzeptorfluoreszenzmessungen während AP-FRET. Die Kinetik der Akzeptor- (mRFP) und Donorfluoreszenz (GFP) wurde für die angegebenen Proben vor, während und nach der Photobleichphase bestimmt. (A) Positive mRFP-GFP-Kontrolle. (B) LSH10-GFP + OTLD1-mRFP. (C) Negative LSH4-GFP + OTLD1-mRFP-Kontrolle. (D) Negative LSH10-GFP + Freie mRFP-Kontrolle. Gelbe Linien zeigen den Zeitraum der Photobleiche an. Weiße Kurven stellen die Messungen der Fluoreszenzkinetik dar. In jedem Panel zeigen das obere und das untere Bild die Kinetik der Akzeptor- (mRFP) bzw. Donorfluoreszenz (GFP). Beachten Sie, dass die GFP-Fluoreszenz natürlich im Laufe der Zeit oft abnimmt, da der Laser die GFP selbst allmählich photobleichen lässt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dieses FRET-Protokoll ist einfach und leicht zu reproduzieren; Es erfordert auch minimale Versorgungsinvestitionen und verwendet Standardausrüstung für viele moderne Labore. Konkret zeichnen fünf technische Hauptmerkmale die Vielseitigkeit dieses Verfahrens aus. Erstens werden die FRET-Konstrukte mithilfe der ortsspezifischen Rekombination generiert, einem Klonierungsansatz, der einfach zu bedienen ist, genaue Ergebnisse liefert und im Vergleich zum herkömmlichen restriktionsenzymbasierten Klonen Zeit spart. Zweitens sind N. benthamiana Pflanzen einfach zu züchten, produzieren relativ große Mengen an Gewebe und sind in den meisten Laboratorien erhältlich. Drittens führt die Agroinfiltration zu einer transienten Expression der gelieferten Konstrukte und generiert somit Daten innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums (d.h. 24-36 h) im Vergleich zu den Monaten, die zur Herstellung transgener Pflanzen benötigt werden. Viertens ermöglicht die Fähigkeit, verschiedene Kombinationen der interessierenden Konstrukte durch Co-Agroinfiltration zu liefern, das Testen von Wechselwirkungen zwischen beliebigen Proteinen. Schließlich können sowohl SE-FRET als auch AB-FRET sequentiell an derselben Gewebeprobe durchgeführt werden, indem eine der Laserkanaleinstellungen ein- und ausgeschaltet wird. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Mikrobombardmentabgabe42 als alternativer Ansatz für die Konstruktabgabe in das Pflanzengewebe anstelle der Agroinfiltration verwendet werden kann; In diesem Fall ist die Verwendung von binären Vektoren, die für die Agroinfiltration erforderlich sind, nicht erforderlich.

Ein kritischer Schritt dieses Protokolls ist die richtige Auswahl des Donor- und Akzeptor-Fluorochrompaares, um die FRET-Effizienz zu optimieren. Die folgenden drei Faktoren sollten berücksichtigt werden: (1) Das Donoremissionsspektrum muss das Akzeptorabsorptionsspektrum maximal überlappen, um die Menge der übertragenen Energie zu maximieren; (2) Die Emissionsspektren des Donors und des Akzeptors müssen so unterschiedlich sein, dass sie voneinander unterschieden werden und die SBT des mikroskopisch erfassten Signals minimiert werden können. (3) Der Akzeptor muss eine minimale direkte Anregung am Extinktionsmaximum des Spenders aufweisen, um die Erregung des Akzeptors während der Erregung des Spenders zu minimieren. Üblicherweise verwendete Donor/Akzeptor-FRET-Paare sind cyan/gelbe und grün/rot fluoreszierende Proteine (d. h. CFP/YFP bzw. GFP/mRFP). Dieses Protokoll verwendet das GFP/mRFP-Paar, da es für die Bildgebung lebender Zellen geeignet ist und im Gegensatz zu den cyan/gelben FRET-Paaren eine geringe Phototoxizität und eine geringe Photobleiche aufweist43. Praktischerweise dient die translationale Fusion zwischen dem FRET-Paar (d.h. mRFP-GFP) als ideale FRET-Positivkontrolle.

Ein weiterer kritischer Schritt ist die Auswahl der geeigneten Negativkontrollen. Im Falle der LSH10-OTLD1-Interaktion muss die FRET-Analyse beispielsweise immer die Expression von OTLD1 allein, LSH10 allein und die Koexpression von OTLD1 und LSH10 mit Proteinen umfassen, für die die Interaktion nicht erwartet wird (d. h. LSH4 bzw. freie mRFP). In Bezug auf die Wahl der Negativkontrollen können FRET-Experimente den Richtlinien für bewährte Verfahren für die Verwendung der BiFC-Technik44 folgen, einem weiteren auf Fluoreszenzbildgebung basierenden Ansatz, der für den Nachweis von Proteininteraktionen in lebenden Pflanzenzellen angepasst ist 29,30,31,32.

Schließlich ist ein Faktor, der das FRET-Experiment beeinflusst, allen Experimenten in lebenden Pflanzengeweben gemeinsam, und er ergibt sich aus den unterschiedlichen physiologischen Bedingungen der Pflanze im Allgemeinen und der agroinfiltrierten transformierten Zellen im Besonderen, selbst wenn sie unter kontrollierten Wachstumsbedingungen gehalten werden. Diese physiologische Variabilität kann zu einer gewissen Variabilität der FRET-Daten zwischen einzelnen Experimenten, Pflanzen und sogar Blättern beitragen. Daher ist es wichtig, für jeden Versuch mindestens zwei Pflanzen und drei Blätter pro Pflanze zu verwenden und reife, vollständig expandierte Blätter für die Agroinfiltration auszuwählen, da sie bessere Bilder liefern.

Wie alle experimentellen Methoden hat FRET seine technischen und nutzungsbasierten Einschränkungen. Ein solcher limitierender Faktor ist die Art des autofluoreszierenden Tags und seine Lage innerhalb des interessierenden Proteins (z. B. am Amino- oder Carboxylterminus), was die biologischen Eigenschaften dieses Proteins beeinträchtigen kann, wie z.B. sein natives Muster der subzellulären Lokalisation oder die Fähigkeit, seine natürlichen Interaktoren zu erkennen. Vor dem Tagging muss jedes Protein von Interesse so weit wie möglich auf seine strukturellen Merkmale analysiert werden, die durch das Tagging beeinträchtigt werden können. In vielen Fällen müssen die Markierungsparameter jedoch empirisch anhand der bekannten Aktivitäten des interessierenden Proteins bestimmt werden. Eine weitere große Einschränkung ist die relative technische Raffinesse von FRET, die die Verwendung konfokaler Mikroskopie mit der entsprechenden Hard- und Software erfordert. Im Gegensatz zu mehreren anderen Proteininteraktionsmethoden, wie dem Hefe-Zwei-Hybrid-System (Y2H)45,46,47, ist FRET ungeeignet für die Identifizierung von Proteininteraktionen durch Screening von Expressionsbibliotheken, insbesondere Hochdurchsatz-Screens 48. Darüber hinaus ist FRET, wie die meisten in vivo durchgeführten Assays, kein biochemisch reines System und erkennt daher nicht die potenzielle Beteiligung anderer unbekannter zellulärer Faktoren an der Interaktion.

Die Bedeutung von FRET in Bezug auf andere Assays von Proteininteraktionen liegt in der Detektion von Wechselwirkungen über kurze Entfernungen, der Verringerung der Wahrscheinlichkeit falsch-positiver Ergebnisse, der Anwendbarkeit für den Einsatz in vivo in einer Vielzahl von Zellen, Geweben und Organismen (einschließlich Pflanzen) und dem Nachweis der subzellulären Lokalisation der interagierenden Proteine. Viele dieser Eigenschaften von FRET finden sich in anderen In-vivo-Ansätzen, wie Split-Luciferase 49,50 oder BiFC29,30,31,32,33, unter denen BiFC vielleicht am häufigsten verwendet wird. Ein weiterer weit verbreiteter Interaktionstest ist Y2H45,46,47; Außerhalb der hefebiologischen Forschung verwendet dieser Assay jedoch ein heterologes experimentelles System, das anfällig für falsch positive Ergebnisse ist, und seine Ergebnisse müssen durch eine andere Technik bestätigt werden. Eine konzeptionelle Variante von Y2H ist ein Split-Ubiquitin-Assay, der besser geeignet ist, Wechselwirkungen zwischen Membranproteinen51,52 nachzuweisen, und der Einschränkungen gegenüber FRET aufweist, die Y2H ähnlich sind. Schließlich können Proteininteraktionen durch Co-Immunpräzipitation (Co-IP) nachgewiesen werden, was sowohl für den Nachweis in einer komplexen Umgebung von Zellextrakten als auch für genau definierte In-vitro-Reaktionen gilt53,54,55; Nach unserer Erfahrung ist Co-IP als alternative und unabhängige Methode zur Bestätigung von Daten, die mit den fluoreszenzbasierten In-vivo-Ansätzen gewonnen wurden, am nützlichsten.

Während dieses spezifische FRET-Protokoll entwickelt wurde, um die Wechselwirkungen zwischen pflanzlichen Transkriptionsfaktoren und Histon-modifizierenden Enzymen zu untersuchen, kann es verwendet werden, um Interaktionen zwischen vielen anderen Klassen von Proteinen in planta zu entdecken und zu charakterisieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Interessenkonflikte wurden nicht erklärt.

Acknowledgments

Die Arbeit im Labor von V.C. wird durch Zuschüsse von NIH (R35GM144059 und R01GM50224), NSF (MCB1913165 und IOS1758046) und BARD (IS-5276-20) an V.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274 (2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56 (2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83 (2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125 (2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39 (2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712 (2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511 (2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S. Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. Hartley, D. A. , IRL Press. 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237 (2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

Tags

Biologie Ausgabe 188 Histonmodifizierende Enzyme (HMEs) Transkriptionsfaktoren (TFs) Protein-Protein-Interaktionen FRET
Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen histonmodifizierenden Enzymen und Transkriptionsfaktoren <em>in vivo</em> durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vo Phan, M. S., Tran, P. T.,… More

Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter