Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

חקירת אינטראקציות בין אנזימים המשנים היסטון לבין גורמי שעתוק in vivo על ידי העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64656
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

Summary

העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) היא טכניקת הדמיה לאיתור אינטראקציות של חלבונים בתאים חיים. כאן מוצג פרוטוקול FRET כדי לחקור את הקשר של אנזימים משני היסטון עם גורמי שעתוק המגייסים אותם למקדמי היעד לוויסות אפיגנטי של ביטוי גנים ברקמות צמחים.

Abstract

ויסות אפיגנטי של ביטוי גנים מושפע בדרך כלל מאנזימים משנים היסטון (HMEs) המייצרים סימני היסטון הטרוכרומטיים או אאוכרומטיים לדיכוי שעתוק או הפעלה, בהתאמה. HMEs מגויסים לכרומטין היעד שלהם על ידי גורמי שעתוק (TFs). לפיכך, זיהוי ואפיון אינטראקציות ישירות בין HMEs ו- TFs הם קריטיים להבנת תפקידם וספציפיותם טוב יותר. מחקרים אלה יהיו רלוונטיים יותר מבחינה ביולוגית אם יבוצעו in vivo בתוך רקמות חיות. כאן מתואר פרוטוקול להמחשת אינטראקציות בעלים של צמחים בין היסטון דאוביקוויטינאז צמחי לבין גורם שעתוק צמחי באמצעות העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET), המאפשרת זיהוי קומפלקסים בין מולקולות חלבון הנמצאות במרחק של <10 ננומטר זו מזו. מוצגות שתי וריאציות של טכניקת FRET: SE-FRET (פליטה רגישה) ו- AB-FRET (הלבנה מקבלת), שבהן האנרגיה מועברת באופן לא רדיאטיבי מהתורם למקבל או נפלטת באופן רדיאטיבי על ידי התורם עם הפוטו-הלבנה של המקבל. ניתן להתאים בקלות את שתי הגישות SE-FRET ו-AB-FRET כדי לגלות אינטראקציות אחרות בין חלבונים אחרים בפלנטה.

Introduction

היסטון דאוביקוויטינאזות צמחיות ממלאות תפקיד חשוב בשליטה על ביטוי גנים על ידי שינוי פוסט-תרגומי של היסטונים, במיוחד על ידי מחיקת סימני המונוביקוויטילציהשלהם 1. עד כה, OTLD1 הוא אחד הצמחים הבודדים היסטון deubiquitinases המאופיינים ברמה המולקולרית ב Arabidopsis 2,3. OTLD1 מסיר קבוצות מונוביקוויטין ממולקולות היסטון H2B, ובכך מקדם הסרה או הוספה של אצטילציה אאוכרומטית ושינויי מתילציה של H3 היסטונים בגן המטרה כרומטין 4,5. יתר על כן, OTLD1 מקיים אינטראקציה עם אנזים משנה כרומטין אחר, היסטון ליזין דמתילאז KDM1C, כדי להשפיע על דיכוי שעתוק של גני המטרה 6,7.

רוב האנזימים המשנים היסטון חסרים יכולות קשירת DNA, ולכן אינם יכולים לזהות את גני המטרה שלהם באופן ישיר. אפשרות אחת היא שהם משתפים פעולה עם חלבוני פקטורי שעתוק קושרי דנ"א הקושרים את האנזימים האלה ומכוונים אותם למטרות הכרומטין שלהם. באופן ספציפי, בצמחים, מספר אנזימים עיקריים המשנים את ההיסטון (כלומר, היסטון מתיל-טרנספראזות8,9, היסטון אצטילטרנספראזות 10, היסטון דמתילאזות 11, וקומפלקסים מדכאים של פוליקומב12,13,14) ידועים כמגויסים על ידי גורמי שעתוק. בהתאם לרעיון זה, לאחרונה, הוצע מנגנון אפשרי אחד לגיוס OTLD1 למקדמי היעד המבוסס על אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות של OTLD1 עם גורם שעתוק LSH1015.

LSH10 שייך למשפחה של חלבוני ALOG צמחיים (Arabidopsis LSH1 ו-Oryza G1) המתפקדים כמווסתי התפתחות מרכזיים 16,17,18,19,20,21,22. העובדה שחברי משפחת חלבוני ALOG מכילים מוטיבים קושרי דנ"א 23 ומציגים את היכולות של תקנת שעתוק22, לוקליזציה גרעינית19 והומודימריזציה24 תומכת עוד יותר ברעיון שחלבונים אלה, כולל LSH10, עשויים לפעול כגורמי שעתוק ספציפיים במהלך ויסות אפיגנטי של שעתוק. אחת הטכניקות הניסוייות העיקריות המשמשות לאפיון אינטראקציית LSH10-OTLD1 in vivo היא העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET)15.

FRET היא טכניקת הדמיה לגילוי ישיר של אינטראקציות קרובות טווח בין חלבונים בטווח של <10 ננומטר זה מזה25 בתוך תאים חיים. ישנן שתי וריאציות עיקריות של גישת FRET26: פליטה רגישה (SE-FRET) (איור 1A) והלבנה מקבלת (AB-FRET) (איור 1B). ב-SE-FRET, החלבונים המקיימים אינטראקציה - אחד מהם מתויג עם פלואורוכרום תורם (למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק, GFP) והשני עם פלואורוכרום מקבל (למשל, חלבון פלואורסצנטי אדום מונומרי, mRFP27,28) - מעבירים באופן לא רדיאטיבי את אנרגיית המצב הנרגש מהתורם למקבל. מאחר שלא נפלטים פוטונים במהלך העברה זו, נוצר אות פלואורסצנטי בעל ספקטרום פליטה רדיאטיבי הדומה לזה של המקבל. ב-AB-FRET, אינטראקציות חלבונים מזוהות ומכומתות על סמך פליטה רדיאטיבית מוגברת של התורם כאשר המקבל מושתק לצמיתות על ידי פוטו-הלבנה, ולכן אינו מסוגל לקבל את האנרגיה הלא-רדיאטיבית המועברת מהתורם (איור 1). חשוב לציין שהמיקום התת-תאי של פלואורסצנציה FRET מעיד על לוקליזציה של החלבונים המקיימים אינטראקציה בתא.

היכולת לפרוס FRET ברקמות חיות ולקבוע את הלוקליזציה התת-תאית של החלבונים המקיימים אינטראקציה בו זמנית עם גילוי אינטראקציה זו כשלעצמה, הופכת את FRET לטכניקה המועדפת למחקרים ולאפיון ראשוני של אינטראקציות חלבון-חלבון in vivo. מתודולוגיית הדמיה פלואורסצנטית דומה in vivo, השלמה פלואורסצנטית דו-מולקולרית (BiFC)29,30,31,32, היא גישה חלופית טובה, אם כי, בניגוד ל- FRET, BiFC עשויה לייצר תוצאות חיוביות כוזבות עקב הרכבה ספונטנית של כתבי BiFCהאוטומטיים 33, וכימות הנתונים שלה פחות מדויק.

מאמר זה משתף את הניסיון המוצלח ביישום טכניקות SE-FRET ו- AB-FRET ומציג פרוטוקול לפריסתן כדי לחקור את האינטראקציות בין OTLD1 ו- LSH10 בתאי צמחים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ניקוטיאנה בנתמיאנה, זן אגרובקטריום טומפצ'ינס EHA105, או GV3101 שימשו למחקר הנוכחי.

1. בניית וקטור FRET

  1. בחר תגי פלואורסצנט עבור זוג FRET התורם/מקבל.
    1. השתמש ב-EGFP מ-pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (ראה טבלת חומרים) כדי ליצור את וקטור התורם.
    2. השתמש ב-mRFP מ-pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (ראה טבלת חומרים) כדי ליצור את וקטור המקבל.
  2. צור את מבני FRET של התורם/מקבל באמצעות טכניקת שיבוט רקומבינציהספציפית לאתר 34, כגון מערכת שיבוט רקומבינציה של שער35.
    1. הגבר את רצפי הקידוד של החלבונים המעניינים36 (כלומר, Arabidopsis OTLD1 ו- LSH10)15.
      הערה: מומלץ גם להשתמש בבקרה שלילית המייצגת הומולוג של אחד החלבונים המקיימים אינטראקציה, אך אינה צפויה להפגין אינטראקציה; מחקר האינטראקציה OTLD1-LSH10 משתמש בהומולוג של LSH10, LSH4, שאינו מזהה OTLD1. ה-cDNAs OTLD1, LSH10 ו-LSH4 מוגברים על-ידי PCR באמצעות פריימרים המפורטים בטבלה 1.
    2. שיבוט OTLD1, LSH10 ו - LSH4 לתוך וקטור הכניסה pDONR207 על ידי טכניקת שיבוט רקומבינציה ספציפית לאתר34.
    3. השתמש בשער LR Clonase II (ראה טבלת חומרים) כדי להעביר את LSH10 ו- LSH4 מ- pDONR207 לווקטור היעד הבינארי pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 כדי ליצור את מבני התורם הבינאריים p35S::LSH10-GFP (מבנה נבדק) ו- p35S::LSH4-GFP (בקרה שלילית).
    4. השתמש באותו אנזים זמין מסחרית (שלב 1.2.3) כדי להעביר את OTLD1 מ- pDONR207 לווקטור היעד הבינארי pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 כדי ליצור את מבנה המקבל הבינארי p35S:: OTLD1-mRFP (מבנה שנבדק).
    5. PCR-הגבר36 mRFP מ- pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 באמצעות פריימרים המפורטים בטבלה 1, שכפל אותו על ידי טכניקת שיבוט רקומבינציה ל- pDONR207, ולאחר מכן השתמש ב- LR Clonase II כדי להעביר mRFP ל- pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 כדי ליצור את מבנה ההיתוך הבינארי p35S::mRFP-GFP (בקרה חיובית).
  3. לבצע טרנספורמציה של התורם ומקבל מבנים לתוך אגרובקטריום.
    1. יש להוסיף 1 מיקרוגרם מכל פלסמיד משלבים 1.2.3-1.2.5 עד 100 μL של תרבית התאים המוסמכים של זן אגרובקטריום טומפצ'ינס EHA105 או GV3101, שהוכן באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים 37 או הושג באופן מסחרי, ודגירה בטמפרטורה של37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    2. הוסיפו 1 מ"ל של LB בינוני (1% טריפטון, 0.5% תמצית שמרים ו-1% NaCl; ראו טבלת חומרים) לתערובת התאים המתאימה, והתסיסו ב-200 סל"ד ו-28 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 3,000 × גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
    3. החזירו את התאים למדיום LB של 0.1 מ"ל על ידי פיפטינג והפיכתם על גבי LB agar בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה (למשל, 0.01% ספקטינומיצין ו-0.005% ריפאמפיצין; ראו טבלת חומרים). לגדול ב 28 °C במשך 2 ימים.
    4. בחרו מושבות בודדות וחסנו כל אחת מהן בנפרד ל-1 מ"ל של מרק LB בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה.
    5. לגדל את התאים ב 28 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ולהעביר 0.2 מ"ל של התרבית לתוך צינור חדש. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 10,000 × גרם במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.
    6. חלצו דנ"א פלסמיד על פי פרוטוקול סטנדרטי לבידוד פלסמידים מתאי אגרובקטריום 38 והחזירו את הדנ"א שחולץב-30 מיקרון מים. כדי לזהות את המושבות שבהן נמצאים הפלסמידים הרצויים, השתמש ב-2 μL של הכנת הדנ"א כתבנית ל-PCR עם פריימרים ספציפיים לגנים המפורטים בטבלה 1. מערבבים 0.7 מ"ל של התרבות המזוהה עם 0.3 מ"ל של גליצרול ומאחסנים ב-80 מעלות צלזיוס.

2. הסתננות אגרואינפורמציה

  1. לגדל צמחי ניקוטיאנה בנתמיאנה .
    הערה: לאורך כל הניסוי, כל הצמחים חייבים להיות בריאים.
    1. לזרוע ולגדל זרעי N. benthamiana בעציץ המכיל אדמה רטובה בצפיפות גבוהה.
    2. שמור את הזרעים הנטועים בתא גידול שנקבע על 23 מעלות צלזיוס עם 16 שעות של אור ו 8 שעות של מחזור כהה עם 150-170 μmol/m2שניות עוצמת אור עד קוטר של euphyll מגיע 0.5 ס"מ.
    3. מעבירים את השתילים לעציצים גדולים יותר ומאפשרים להם לגדול באותו תא עם אותם פרמטרים.
      הערה: צמחים מוכנים לחדירה חקלאית כאשר העלים הגדולים ביותר שלהם הם בקוטר 5-7 ס"מ, בדרך כלל תוך 4-5 שבועות. בצמחים קטנים יותר שהם צעירים מדי, ההשפעות של חדירת אגרואינפורמציה יהיו חמורות מדי לניתוח FRET.
  2. הכן תאי חיידקים עבור agroinfiltration.
    1. לגדל כל מושבת אגרובקטריום המכילה את מבני FRET למשך הלילה ב-5 מ"ל של מדיום LB בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה (שלב 1.3.3) ו-150 μM אצטומסירינגטון בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס (ראו טבלת חומרים).
    2. צנטריפוגה של התאים ב 3,000 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. השהה את התאים במאגר חדירת אגרואינפורמציה (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5.6, 150 μM acetosyringone) ל- OD600 = 0.5.
    4. שלב את התאים המחודשים ביחס V/V של 1:1 בין תאים בעלי המבנים המתאימים (שלב 2.2.5).
    5. עבור חדירות אגרו-קונסטרוקטיביות כפולות, ערבבו את האליקוטים של שתי תרבויות, ועבור חדירות אגרו-חדירות חד-מבנה, ערבבו את האליקוטים של אותה תרבות:
      1. חלבונים שנבדקו: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (חיידקים המאחסנים את מבני p35S::OTLD1-mRFP ו-p35S::LSH10-GFP).
      2. בקרה שלילית: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (חיידקים המאחסנים את מבנה p35S::OTLD1-mRFP ו-p35S::LSH4-GFP).
      3. בקרה שלילית: LSH10-GFP + mRFP חופשי (חיידקים המאחסנים את מבני p35S::LSH10-GFP ו-pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1).
      4. בקרה חיובית: mRFP-GFP (חיידקים הנושאים את מבנה p35S::mRFP-GFP).
    6. דגירה של התאים ב 28 מעלות צלזיוס במשך 0.5-1 שעות.
  3. בצע אגרואינפורמציה.
    1. טען את תרבית החיידקים לתוך מזרק 1 מ"ל ללא מחט.
    2. לחץ בעדינות אך בחוזקה על פיית המזרק כנגד הצד האבקסיאלי של עלי N. benthamiana המורחבים במלואם תוך החזקת העלה עם אצבע כפפות בצד האדאקסיאלי.
    3. מסתננים עד ארבעה כתמים על עלה, שלושה עלים לצמח, שניים או שלושה צמחים לכל תרבית חיידקים. החלף כפפות בין דגימות כדי למנוע זיהום צולב.
    4. שמור על הצמחים האגרו-חדורים באותו תא גידול באותם תנאים, כמתואר בשלב 2.1.2, למשך 24 שעות עד 36 שעות. אין לשמור את הצמחים האגרו-חדורים למשך יותר מ-36 שעות, מכיוון שהדבר יפחית את אות הפלואורסצנציה.

3. מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. הכן שקופיות מיקרוסקופ להדמיה פלואורסצנטית.
    1. לאחר 24-36 שעות של חדירה, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך כל עלה אגרו-חדור לחתיכות קטנות (2 מ"מ x 4 מ"מ) בין הוורידים.
    2. הניחו את חתיכות העלים על מגלשת זכוכית כשמשטח העלה האבקסיאלי פונה כלפי מעלה. מניחים טיפת מים על חתיכות העלים ומכסים אותם בכוס הכיסוי. הקישו קלות על הכיסוי כדי להסיר בועות אוויר.
    3. הפעל את המיקרוסקופ והלייזר (ראה טבלת חומרים). מקם את השקופית במחזיק שלב המיקרוסקופ לצורך הדמיה תחת הפרמטרים הספציפיים של FRET (שלבים 3.2 ו-3.3).
    4. התחל את התצפיות באמצעות עדשת מטרה של פי 10 כדי לזהות תאים המציגים הן את אותות ה-GFP והן את אותות ה-mRFP, ולאחר מכן השתמש בעדשה אובייקטיבית של פי 40 לתצפיות מפורטות לאחר מכן.
      הערה: חשוב לציין, SE-FRET ו-AB-FRET מבוצעים בדרך כלל על אותה דגימת רקמה, ומאפשרים שימוש באותן הגדרות ערוץ (שלב 3.2) למעט ערוץ FRET, אשר מופעל/כבוי עבור תצפיות SE-FRET ו-AB-FRET, בהתאמה (שלבים 3.2.2.3 ו-3.3.1).
  2. הגדר את הפרמטרים עבור SE-FRET (איור 1A).
    1. פתח את הכלי רכישה רב-ממדית (MDA).
    2. צרו קבוצה של שלושה ערוצים קונפוקליים באותו שדה ראייה (איור משלים 1).
      1. הגדר את ערוץ התורם (ערוץ GFP) לעירור ופליטה של פלואורוכרום התורם באמצעות לייזר עירור של 405 ננומטר ומסנן פליטה של 400-597 ננומטר.
      2. הגדר את ערוץ המקבל (ערוץ mRFP) לעירור ופליטה של הפלואורוכרום המקבל באמצעות לייזר עירור של 561 ננומטר ומסנן פליטה של 400-597 ננומטר.
        הערה: מסנן הפליטה עבור mRFP נקבע על 400-597 ננומטר כדי להפריד את אות ה-mRFP מהאות FRET ב-597-617 ננומטר (שלב 3.2.2.3), ולכן להפחית את פליטת ה-mRFP שאינה תלויה ב-FRET.
      3. הגדר את ערוץ FRET לעירור התורם והפליטה של הפלואורוכרומים המקבלים באמצעות לייזר עירור של 405 ננומטר ומסנן פליטה של 597-617 ננומטר.
    3. הגדר את עוצמת העירור של התורם ברמה מינימלית כדי לצפות ב- FRET תוך הימנעות מהלבנת תמונות, תוך הפחתת יעילות SE-FRET.
      הערה: עוצמת עירור זו נבחרת בניסוי לפני ביצוע הליך FRET כדי למנוע הלבנת תמונות. הוא משתנה בהתאם לעובי העלה, לגיל ולזמן שלאחר ביטוי יתר.
    4. לעורר את התורם ולסרוק אחר תאים המכילים את האות הפלואורסצנטי הצפוי של המקבל.
    5. בחר את האזור המכיל את אות העניין הפלואורסצנטי.
    6. רכוש רצף תמונות SE-FRET על-ידי לחיצה על לחצן הצמדה .
      1. תמונה 10-15 תאים המבטאים תחילה את מבנה mRFP-GFP (בקרה חיובית); התאימו את הפרמטרים של המיקוד, הזום והרווח החכם כדי להתמקד באזור העניין שיש ללכוד (איור משלים 2).
      2. באמצעות אותן הגדרות, תמונה 10-15 תאים, כל אחד מבטא OTLD1-mRFP, mRFP חינם, LSH10-GFP, או LSH4-GFP בנפרד.
        הערה: תמונות אלה נרכשות על-ידי התוסף "PixFRET" של ImageJ (ראה טבלת חומרים), ששימש לניתוחי הנתונים של FRET (שלב 3.4.1) כדי לקבוע את ערכי הגלישה הספקטרלית (SBT) עבור המקבלים והתורמים; תמונות אלה משמשות את התוכנה ליצירת תמונות SE-FRET עבור OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP, ו- LSH10-GFP + זוגות חלבוני mRFP חופשיים (שלב 3.2.6.3).
      3. כמו כן, באמצעות אותן הגדרות, תמונה 10-15 תאים המבטאים במשותף OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP, ו- LSH10-GFP + זוגות חלבוני mRFP חופשיים.
  3. הגדר פרמטרים עבור AB-FRET (איור 1B).
    1. השתמש בפרמטרים של ערוץ התורם ומקבל שהוגדרו עבור SE-FRET (שלב 3.2.2) אך כבה את ערוץ FRET.
    2. הגדר את הפרמטרים להלבנת תמונות של המקבל (mRFP) (איור משלים 3).
      1. ודאו שההלבנה מתחילה אחרי חמש תמונות. אפשר 200 איטרציות לכל אזור אקונומיקה. שמור על עוצמת לייזר של 100% ב-561 ננומטר.
      2. לשמור על משך הלבנה של 45 שניות. הבטח מהירות סריקה של 512 x 512 פיקסלים ב- 400 הרץ.
    3. צייר את האזור של התא להיות מולבן; לדוגמה, עבור אינטראקציות גרעיניות, אזורי עניין נמשכים סביב כל האזור של גרעין התא39.
    4. הפעל הלבנה על ידי לחיצה על לחצן התחל ניסוי ; הפעלת פונקציה זו תבצע את ההלבנה ולרכוש את רצף התמונות AB-FRET.
  4. נתח את נתוני FRET.
    1. לניתוח נתוני SE-FRET, השתמש בתוסף "PixFRET" עבור תוכנת ImageJ כדי ליצור תמונות מתוקנות של יעילות SE-FRET לאחר הפחתת SBT40 (שלב 3.2.6.2).
    2. לניתוח נתוני AB-FRET, חשב את %AB-FRET כעלייה באחוזים בפליטת GFP לאחר הלבנת תמונות mRFP באמצעות הנוסחההבאה 41: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, כאשר GFPpost הוא פליטת GFP לאחר הלבנת תמונות mRFP, ו- GFPpre הוא פליטת GFP לפני הלבנת תמונות mRFP.
    3. בעת סקירת תמונות FRET, שים לב ללוקליזציה התת-תאית של אות FRET.
      הערה: במקרים רבים, ניתן לזהות בקלות את התאים הללו (למשל, גרעין, כלורופלסטים, ER וכו'), וכיתרון נוסף של טכניקת FRET, הם מספקים רמזים חשובים לתפקוד הביולוגי של החלבונים המקיימים אינטראקציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 2 ממחיש את התוצאות האופייניות של ניסוי SE-FRET, שבו גרעיני התא תועדו בו-זמנית בשלושה ערוצים (כלומר, תורם GFP, mRFP מקבל ו-SE-FRET). נתונים אלה שימשו ליצירת תמונות של יעילות SE-FRET המקודדות בסולם צבעים מדומה. בסולם זה, המעבר מכחול לאדום מתאים לעלייה ביעילות FRET, מדד של קרבה חלבון-חלבון מ -0% ל -100%. בניסוי מייצג זה, אות SE-FRET נרשם בגרעין התא, ועוצמתו לאחר הביטוי של LSH10 ו- OTLD1 הייתה דומה לזו שנצפתה לאחר הביטוי של mRFP-GFP (כלומר, בקרה חיובית). לא נצפתה SE-FRET בבקרות שליליות (כלומר, קו-ביטוי של OTLD1-mRFP ו-LSH4-GFP או mRFP חופשי ו-LSH10-GFP).

האינטראקציות LSH10-OTLD1 כומתו באמצעות AB-FRET. לשם כך, הפלואורסצנציה של GFP התורם נרשמה בגרעין התא לפני ואחרי ההלבנה של ה-mRFP המקבל כסדרת זמן פוטו-הלבנה של מדידות פלואורסצנטיות של תורמים ומקבלים (איור משלים 4). התמונות של גרעיני התא שנרשמו הוצגו בצבע פסאודו כדי לכמת את השינוי בפלואורסצנציה של GFP. איור 3 מראה שהקו-ביטוי LSH10-GFP/OTLD1-mRFP הביא לפלואורסצנטיות מוגברת של תורם GFP לאחר שמקבל ה-mRFP עבר פוטו-אקונומיקה ואיבד את יכולתו לפלואורסצנטיות. עלייה דומה בפלואורסצנציה של התורם נצפתה בבקרה החיובית mRFP-GFP, אך לא בבקרות השליליות של הקו-פרובינציה LSH4-GFP/OTLD1-mRFP או LSH10-GFP/mRFP, בעוד שהפלואורסצנציה המקבלת הושבתה בכל ניסויי הפוטו-הלבנה. איור 4 מציג את הניתוח הכמותי של נתוני AB-FRET, המדגים את העלייה המובהקת סטטיסטית בפלואורסצנציה של התורם (%AB-FRET) של כ-13% לאחר ביטוי משותף של LSH10 ו-OTLD1. הבקרה החיובית mRFP-GFP ייצרה %AB-FRET של כ-30%, ואילו הבקרות השליליות לא ייצרו %AB-FRET. שתי התמונות SE-FRET ו-AB-FRET הראו את אות ה-FRET בגרעין התא, בהתאם ללוקליזציה התת-תאית הצפויה עבור קומפלקסים של אנזימים המשנים את גורם השעתוק, כמו גם עבור האופי הנוקלאוציטופלסמי של חלבוני GFP/mRFP34 (איור 2 ואיור 3).

לסיכום, הנתונים המייצגים מראים כי פרוטוקול FRET זה יכול לשמש כדי להדגים ולכמת אינטראקציות בין אנזימים משנים היסטון וגורמי שעתוק ולקבוע את הלוקליזציה התת-תאית שלהם בתאי צמחים חיים.

Figure 1
איור 1: סיכום סכמטי של טכניקות SE-FRET ו-AB-FRET. (A) העיקרון הבסיסי של SE-FRET. אחד החלבונים שנבדקו מתויג עם GFP, הפועל כפלואורוכרום תורם, והשני עם mRFP, הפועל כפלואורוכרום מקבל. המולקולה התורמת נרגשת, והפליטה המקבלת נרשמת. אם החלבונים שנבדקו מתקשרים זה עם זה כך שהם ממוקמים במרחק של 10 ננומטר זה מזה, האנרגיה מהתורם הנרגש מועברת באופן לא רדיאטיבי למקבל, אשר לאחר מכן הופך נרגש ופולט פלואורסצנטיות בערוץ הפליטה FRET. אם לא מתרחשת אינטראקציה, לא מועברת אנרגיה מהתורם למקבל, ולא מזוהה פליטת FRET על ידי המקבל. (B) העיקרון הבסיסי של AB-FRET. החלבונים שנבדקו מתויגים כמתואר ב-(A) עבור SE-FRET. המולקולה התורמת נרגשת, ואם מתרחשת האינטראקציה בין החלבונים שנבדקו, התורם מרגש את המקבל באופן שאינו קורן, וכתוצאה מכך FRET. לאחר מכן, המקבל מושתק לצמיתות על ידי הלבנת פוטו, ובכך מאבד את יכולתו לקבל אנרגיה לא רדיאטיבית מהתורם ולפלוט את פלואורסצנטיות FRET בערוץ הפליטה FRET; הפלואורסצנציה הנפלטת על ידי התורם, לעומת זאת, מוגברת מכיוון שהתורם מאבד פחות אנרגיה על ידי ההעברה הלא רדיאטיבית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: אינטראקציה ספציפית של LSH10 עם OTLD1 בעלים של N. benthamiana שזוהו על-ידי SE-FRET. תמונות משלושה ערוצי זיהוי (תורם, מקבל ו- SE-FRET) מוצגות עבור שילובי החלבונים שצוינו. תמונות היעילות של SE-FRET חושבו על ידי חיסור של בליד ספקטרלי (SBT) והן מוצגות בפסאודו-צבע, כאשר הצבעים אדום וכחול מסמנים את האות הגבוה ביותר ואת האות הנמוך ביותר, בהתאמה. (A) אות יעילות SE-FRET גבוה המיוצר על ידי הבקרה החיובית mRFP-GFP. (B) אות יעילות SE-FRET חיובי המיוצר על ידי החלבונים LSH10-GFP ו-OTLD1-mRFP המקיימים אינטראקציה. (C) ביטוי משותף של חלבון הבקרה השלילית LSH4-GFP ו-OTLD1-mRFP לא הפיק אות יעילות SE-FRET. (D) ביטוי משותף של חלבון mRFP ללא בקרה שלילית ו-LSH10-GFP לא הפיק אות יעילות SE-FRET. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: אינטראקציה ספציפית של LSH10 עם OTLD1 בעלי N. benthamiana שזוהו על-ידי AB-FRET. תמונות משני ערוצי זיהוי (תורם ומקבל) לפני ואחרי הלבנת תמונות מוצגות עבור שילובי החלבונים שצוינו. העיגול מציין את האזור הפוטו-אקונומי. AB-FRET, המוצג כעלייה בפלואורסצנציה של GFP לאחר הלבנת תמונות mRFP, מוצג באמצעות פסאודו-צבע עם הצבעים אדום וכחול, המסמלים את האות הגבוה ביותר והנמוך ביותר, בהתאמה. (A) עלייה בפלואורסצנציה של תורם GFP המיוצרת על ידי הבקרה החיובית mRFP-GFP. (B) עלייה בפלואורסצנציה של תורם GFP המיוצרת על ידי החלבונים LSH10-GFP ו-OTLD1-mRFP המקיימים אינטראקציה. (C) קו-ביטוי של חלבון הבקרה השלילית LSH4-GFP ו-OTLD1-mRFP יצר שינויים זניחים בפלואורסצנציה של תורם GFP. (D) קו-ביטוי של חלבון mRFP נטול בקרה שלילית ו-LSH10-GFP יצר שינויים זניחים בפלואורסצנציה של תורם GFP. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: כימות של AB-FRET. העלייה באחוזים בפלואורסצנציה של תורם GFP לאחר הלבנת פוטו-אקונומיקה של mRFP (%AB-FRET) מוצגת עבור שילובי החלבונים שצוינו. קווי שגיאה מייצגים את הממוצע עבור n = 13 תאים עבור כל מדידה. מבחן t דו-זנבי קבע כי ההבדלים בין ערכים ממוצעים מובהקים סטטיסטית עבור ערכי p *p < 0.05, **p < 0.01 ו- ***p < 0.001; p≥ 0.05 אינם מובהקים סטטיסטית (NS). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שם פריימר רצף (5ʹ עד 3ʹ) תכלית
OTLD1 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatgactcggattttggttcaaag הגבר את OTLD1 מ- cDNA
OTLD1 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggttccgtgtgggctttgcctgcgtc הגבר את OTLD1 מ- cDNA
LSH10 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatgtcctccaagagaaagagg הגבר את LSH10 מ-cDNA
LSH10 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcaacagagactaaagaaac הגבר את LSH10 מ-cDNA
LSH4 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggatcatcatcggcttttg הגבר את LSH4 מ-cDNA
LSH4 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgattagggctacttgaaatcgcc הגבר את LSH4 מ-cDNA
mRFP Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggccctccgaggacgt הגבר את mRFP מ-pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
mRFP Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggttgggatgcggcgcgg הגבר את mRFP מ-pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
AttL1 tcgcgttaacgctagcatggatctc אשר רצפים ב-pDONR207 על-ידי ריצוף PCR ו-DNA
AttL2 gtaacatcagagattttgagacac אשר רצפים ב-pDONR207 על-ידי ריצוף PCR ו-DNA
AttB1 Fw ggggacaagtttgtac aaaaagcaggct אשר רצפים בווקטורים של יעד על ידי PCR וריצוף DNA
AttB2 Rv ggggaccactttgta caagaaagctgggt אשר רצפים בווקטורים של יעד על ידי PCR וריצוף DNA
מקדם 35S Fw ctatccttcgcaagacccttc אישור רצפים בווקטורים של יעד על-ידי PCR

טבלה 1: פריימרים לשיבוט ואישור הרצפים המשובטים ב-pDONOR207 ובקטרי היעד. Fw, פריימרים קדמיים; Rv, פריימרים הפוכים.

איור משלים 1: הגדרת פרמטרים לתעלות קונפוקליות. (A) צילום מסך להגדרת פרמטר העירור והפליטה עבור ערוץ התורם (GFP). (B) צילום מסך עבור הגדרת פרמטר העירור והפליטה עבור הערוץ המקבל (mRFP). (C) צילום מסך עבור הגדרת פרמטר העירור והפליטה עבור ערוץ FRET. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: התאמת פרמטרים לרכישת תמונות SE-FRET של מדגם העניין. (A) צילום מסך עבור הגדרת פרמטר אזור הסריקה (כלומר, גודל תמונה, מהירות סריקה, כיוון וממוצע). (B) צילום מסך עבור הגדרת פרמטר ערוץ GFP (כלומר, לייזר, חור סיכה, רווח ראשי ורווח דיגיטלי). (C) צילום מסך להגדרת פרמטר ערוץ mRFP (כלומר, לייזר, חור סיכה, רווח ראשי ורווח דיגיטלי). (D) צילום מסך עבור הגדרת פרמטר ערוץ FRET (כלומר, לייזר, חור סיכה, רווח ראשי ורווח דיגיטלי). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: הגדרת פרמטרים לצילום המקבל. (A) צילום מסך עבור הגדרת פרמטר אזור הסריקה (כלומר, גודל תמונה, מהירות סריקה, כיוון וממוצע). (B) צילום מסך עבור הגדרת סדרת הזמן ופרמטר הלבנת הזמן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 4: סדרות זמן של מדידות פלואורסצנטיות של התורם והמקבל במהלך AP-FRET. הקינטיקה של הפלואורסצנציה המקבלת (mRFP) והתורם (GFP) נקבעה עבור הדגימות שצוינו לפני, במהלך ואחרי תקופת ההלבנת הצילום. (A) בקרת mRFP-GFP חיובית. (B) LSH10-GFP + OTLD1-mRFP. (C) בקרת LSH4-GFP שלילית + OTLD1-mRFP. (D) שלילי LSH10-GFP + בקרת mRFP חינם. קווים צהובים מציינים את פרק הזמן של הצילום. עקומות לבנות משרטטות את המדידות של הקינטיקה הפלואורסצנטית. בכל פאנל, התמונות העליונות והתחתונות מציגות את הקינטיקה של הפלואורסצנציה המקבלת (mRFP) והתורם (GFP), בהתאמה. שים לב, באופן טבעי, הפלואורסצנציה של GFP פוחתת לעתים קרובות עם הזמן מכיוון שהלייזר מצלם בהדרגה את ה- GFP עצמו. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול FRET זה פשוט וקל לשחזור; זה גם דורש השקעת אספקה מינימלית ומנצל ציוד סטנדרטי עבור מעבדות מודרניות רבות. באופן ספציפי, חמש תכונות טכניות עיקריות מבדילות את הרבגוניות של הליך זה. ראשית, מבני FRET נוצרים באמצעות רקומבינציה ספציפית לאתר, גישת שיבוט קלה לשימוש, מפיקה תוצאות מדויקות וחוסכת זמן בהשוואה לשיבוט מסורתי המבוסס על אנזימי הגבלה. שנית, צמחי N. benthamiana פשוטים לגידול, מייצרים כמויות גדולות יחסית של רקמות וזמינים ברוב המעבדות. שלישית, חדירת אגרואינפורמציה גורמת לביטוי חולף של המבנים הנמסרים, ולכן מייצרת נתונים תוך פרק זמן קצר יחסית (כלומר, 24-36 שעות) בהשוואה לחודשים הנדרשים לייצור צמחים מהונדסים. רביעית, היכולת לספק שילובים שונים של מבני העניין על ידי סינון משותף מאפשרת בדיקה של אינטראקציות בין חלבונים כלשהם. לבסוף, ניתן לבצע הן SE-FRET והן AB-FRET ברצף על אותה דגימת רקמה רק על ידי הפעלה/כיבוי של אחת מהגדרות ערוץ הלייזר. יש לציין, עם זאת, כי משלוח microbombardment42 יכול לשמש כגישה חלופית לבניית משלוח לתוך רקמות הצמח במקום agroinfiltration; במקרה זה, השימוש בווקטורים בינאריים הנדרשים לחדירה אגרואינפורמציה הוא מיותר.

שלב קריטי אחד בפרוטוקול זה הוא בחירה נכונה של זוג הפלואורוכרום התורם והמקבל כדי לייעל את יעילות FRET. יש לקחת בחשבון את שלושת הגורמים הבאים: (1) ספקטרום הפליטה של התורם צריך לחפוף באופן מרבי את ספקטרום הקליטה המקבל כדי למקסם את כמות האנרגיה המועברת; (2) ספקטרום הפליטה של התורם והמקבל חייב להיות שונה במידה מספקת כדי להיות מובחן זה מזה וכדי למזער את ה-SBT של האות שזוהה על ידי מיקרוסקופיה; (3) על המקבל להיות בעל עירור ישיר מינימלי במקסימום הקליטה של התורם כדי למזער את העירור של המקבל במהלך עירור התורם. זוגות FRET תורמים/מקבלים נפוצים המשמשים הם חלבונים פלואורסצנטיים ציאן/צהוב וירוק/אדום (כלומר, CFP/YFP ו-GFP/mRFP, בהתאמה). פרוטוקול זה משתמש בזוג GFP/mRFP מכיוון שהוא מתאים להדמיית תאים חיים, ובניגוד לזוגות FRET ציאן/צהוב, הוא מפגין פוטוטוקסיות נמוכה ופוטו-הלבנת43 נמוכה. באופן נוח, המיזוג התרגומי בין זוג FRET (כלומר, mRFP-GFP) משמש כבקרה חיובית אידיאלית של FRET.

צעד קריטי נוסף הוא בחירת הבקרות השליליות המתאימות. לדוגמה, במקרה של אינטראקציה LSH10-OTLD1, ניתוח FRET חייב תמיד לכלול את הביטוי של OTLD1 בלבד, LSH10 בלבד, וקו-ביטוי של OTLD1 ו- LSH10 עם חלבונים שעבורם האינטראקציה אינה צפויה (כלומר, LSH4 ו- mRFP חופשי, בהתאמה). מבחינת הבחירה של הבקרות השליליות, ניסויי FRET יכולים לעקוב אחר ההנחיות לגבי שיטות עבודה מומלצות לשימוש בטכניקת BiFC44, גישה נוספת המבוססת על הדמיה פלואורסצנטית המותאמת לזיהוי אינטראקציות של חלבונים בתאי צמחים חיים 29,30,31,32.

לבסוף, גורם המשפיע על ניסויי FRET משותף לכל הניסויים ברקמות צמחים חיות, והוא נובע מהתנאים הפיזיולוגיים המשתנים של הצמח, בכלל, והתאים המותמרים האגרו-חדירים, בפרט, גם כאשר הם נשמרים בתנאי גידול מבוקרים. שונות פיזיולוגית זו יכולה לתרום לשונות מסוימת של נתוני FRET בין ניסויים בודדים, צמחים ואפילו עלים. לכן, חשוב להשתמש לפחות בשני צמחים ושלושה עלים לכל צמח לכל ניסוי ולבחור עלים בוגרים ומורחבים לחלוטין לסינון אגרואינפורמציה, מכיוון שהם מניבים תמונות טובות יותר.

כמו בכל מתודולוגיות הניסוי, ל- FRET יש מגבלות טכניות ומבוססות שימוש. גורם מגביל אחד כזה הוא אופיו של התג האוטופלואורסצנטי ומיקומו בתוך החלבון המעניין (למשל, במסוף האמינו או קרבוקסיל), מה שעלול להפריע לתכונות הביולוגיות של חלבון זה, כגון התבנית הטבעית של לוקליזציה תת-תאית או היכולת לזהות את האינטראקטורים הטבעיים שלו. לפני התיוג, יש לנתח כל חלבון בעל עניין, ככל הניתן, אחר התכונות המבניות שלו שעלולות להיפגע על ידי תיוג. עם זאת, במקרים רבים יש לקבוע את פרמטרי התיוג באופן אמפירי על סמך הפעילויות הידועות של החלבון המעניין. מגבלה מרכזית נוספת היא התחכום הטכני היחסי של FRET, המחייב שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית עם החומרה והתוכנה המתאימות. בניגוד למספר שיטות אחרות של אינטראקציה עם חלבונים, כגון מערכת השמרים הדו-היברידית (Y2H)45,46,47, FRET אינו מתאים לזיהוי אינטראקציות חלבונים על ידי סינון ספריות ביטויים, במיוחד מסכי תפוקה גבוהה 48. בנוסף, כמו רוב הבדיקות המבוצעות in vivo, FRET אינה מערכת טהורה מבחינה ביוכימית, ולכן היא אינה מזהה את המעורבות הפוטנציאלית של גורמים תאיים לא ידועים אחרים באינטראקציה.

המשמעות של FRET ביחס למבחנים אחרים של אינטראקציות חלבונים טמונה בזיהוי אינטראקציות למרחקים קצרים, הפחתת הסיכויים לתוצאות חיוביות שגויות, ישימות לפריסה in vivo במגוון תאים, רקמות ואורגניזמים (כולל צמחים), וזיהוי לוקליזציה תת-תאית של החלבונים המקיימים אינטראקציה. רבים ממאפיינים אלה של FRET נמצאים בגישות in vivo אחרות, כגון מפוצל-לוציפראז 49,50 או BiFC 29,30,31,32,33, ביניהם BiFC הוא אולי הנפוץ ביותר. מבחן אינטראקציה נפוץ נוסף הואY2H 45,46,47; עם זאת, מחוץ למחקר בביולוגיה של שמרים, בדיקה זו משתמשת במערכת ניסויית הטרולוגית, המועדת לתוצאות חיוביות שגויות, וממצאיה דורשים אישור בטכניקה אחרת. וריאציה מושגית של Y2H היא בדיקת ספליט-יוביקוויטין המתאימה יותר לאיתור אינטראקציות בין חלבוני ממברנה51,52 ואשר מציגה מגבלות ביחס ל-FRET הדומה ל-Y2H. לבסוף, אינטראקציות חלבון יכולות להיות מזוהות על ידי co-immunoprecipitation (co-IP), אשר חל על זיהוי בסביבה מורכבת של תמציות תאים, כמו גם בתגובות מוגדרות במדויק במבחנה 53,54,55; מניסיוננו, Co-IP שימושי ביותר כשיטה חלופית ובלתי תלויה לאישור נתונים המתקבלים באמצעות גישות in vivo מבוססות פלואורסצנטיות.

בעוד שפרוטוקול FRET ספציפי זה פותח כדי לחקור את יחסי הגומלין בין גורמי שעתוק צמחיים לבין אנזימים המשנים היסטון, ניתן להשתמש בו כדי לגלות ולאפיין אינטראקציות בין סוגים רבים אחרים של חלבונים אינפלנטה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי עניינים.

Acknowledgments

העבודה במעבדה של V.C. נתמכת על ידי מענקים מ- NIH (R35GM144059 ו- R01GM50224), NSF (MCB1913165 ו- IOS1758046) ו- BARD (IS-5276-20) ל- V.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274 (2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56 (2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83 (2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125 (2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39 (2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712 (2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511 (2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S. Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. Hartley, D. A. , IRL Press. 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237 (2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

Tags

ביולוגיה גיליון 188 היסטון שינוי אנזימים (HMEs) גורמי שעתוק (TFs) אינטראקציות חלבון-חלבון FRET
חקירת אינטראקציות בין אנזימים המשנים היסטון לבין גורמי שעתוק <em>in vivo</em> על ידי העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vo Phan, M. S., Tran, P. T.,… More

Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter