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Biology

형광 공명 에너지 전달에 의한 생체 내 히스톤 변형 효소와 전사 인자 간의 상호 작용 조사

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64656
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

Summary

형광 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 감지하기 위한 이미징 기술입니다. 여기에서는 식물 조직에서 유전자 발현의 후성유전학적 조절을 위해 히스톤 변형 효소와 전사 인자를 모집하는 전사 인자의 연관성을 연구하기 위해 FRET 프로토콜이 제시됩니다.

Abstract

유전자 발현의 후성유전학적 조절은 일반적으로 전사 억제 또는 활성화를 위해 각각 이색성 또는 진색소 히스톤 마크를 생성하는 히스톤 변형 효소(HME)의 영향을 받습니다. HME는 전사 인자(TF)에 의해 표적 염색질에 모집됩니다. 따라서 HME와 TF 간의 직접적인 상호 작용을 감지하고 특성화하는 것은 기능과 특이성을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 이러한 연구는 생체 조직 내에서 생체 내에서 수행되는 경우 생물학적으로 더 관련이 있습니다. 여기에서는 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 사용하여 식물 히스톤 데비 퀴티 나제와 식물 전사 인자 사이의 식물 잎에서의 상호 작용을 시각화하기위한 프로토콜이 설명되며,이를 통해 서로 <10nm 이내에있는 단백질 분자 간의 복합체를 검출 할 수 있습니다. FRET 기술의 두 가지 변형이 제시됩니다 : SE-FRET(감작 방출) 및 AB-FRET(수용체 표백), 여기서 에너지는 공여체에서 수용체로 비방사성으로 전달되거나 수용체의 광표백시 공여체에 의해 방사적으로 방출됩니다. SE-FRET와 AB-FRET 접근법 모두 플란타의 다른 단백질 간의 다른 상호 작용을 발견하기 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.

Introduction

식물 히스톤 데유비퀴티나제는 히스톤의 번역 후 변형에 의해, 특히 이들의 모노유비퀴틸화 마크를 삭제함으로써 유전자 발현을 조절하는 데 중요한 역할을 한다1. 지금까지 OTLD1은 애기장대 2,3에서 분자 수준에서 특징 지어지는 몇 안되는 식물 히스톤 데비 키티 나제 중 하나입니다. OTLD1은 H2B 히스톤 분자로부터 모노 유비 퀴틴 그룹을 제거하여 표적 유전자 염색질 4,5에서 H3 히스톤의 유 크로 마틱 아세틸 화 및 메틸화 변형의 제거 또는 첨가를 촉진합니다. 또한, OTLD1은 다른 염색질 변형 효소 인 히스톤 라이신 데 메틸 라제 KDM1C와 상호 작용하여 표적 유전자 6,7의 전사 억제에 영향을 미친다.

대부분의 히스톤 변형 효소는 DNA 결합 능력이 부족하여 표적 유전자를 직접 인식 할 수 없습니다. 한 가지 가능성은 이러한 효소에 결합하여 염색질 표적에 지시하는 DNA 결합 전사 인자 단백질과 협력한다는 것입니다. 구체적으로, 식물에서, 몇몇 주요 히스톤-개질 효소 (즉, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 8,9, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 10, 히스톤 데메틸라제 11, 및 폴리콤 억제 복합체12,13,14)가 전사 인자에 의해 모집되는 것으로 알려져 있다. 이러한 아이디어와 일치하게, 최근에, OTLD1과 전사 인자 LSH1015의 특정 단백질-단백질 상호작용에 기초하는 표적 프로모터로의 OTLD1 모집을 위한 하나의 가능한 메커니즘이 제안되었다.

LSH10은 중앙 발달 조절자 16,17,18,19,20,21,22로 기능하는 식물 ALOG (애기장대 LSH1 및 Oryza G1) 단백질의 계열에 속합니다. ALOG 단백질 패밀리의 구성원이 DNA 결합 모티프(23)를 함유하고, 전사 조절22, 핵 국소화19, 및 동종이량체화(homodimerization)24에 대한 능력을 나타낸다는 사실은 LSH10을 포함하는 이들 단백질이 전사의 후성유전학적 조절 동안 특정 전사 인자로서 작용할 수 있다는 개념을 더욱 뒷받침한다. 생체 내에서 LSH10-OTLD1 상호 작용을 특성화하는 데 사용되는 주요 실험 기술 중 하나는 형광 공명 에너지 전달(FRET)15입니다.

FRET는 살아있는 세포 내에서 서로 <10nm 이내의 단백질25 사이의 근거리 상호 작용을 직접 검출하기위한 이미징 기술입니다. FRET 접근법26에는 감응 방출 (SE-FRET) (도 1A) 및 수용체 표백 (AB-FRET) (도 1B)의 두 가지 주요 변형이 있다. SE-FRET에서, 상호작용 단백질 - 그 중 하나는 공여체 플루오로크롬 (예를 들어, 녹색 형광 단백질, GFP)으로 태그되고 다른 하나는 수용체 형광 색소 (예를 들어, 단량체성 적색 형광 단백질, mRFP27,28)를 갖는 비-공여체로부터 수용체로 여기 상태 에너지를 전달한다. 이 전송 중에 광자가 방출되지 않기 때문에 수용체와 유사한 복사 방출 스펙트럼을 갖는 형광 신호가 생성됩니다. AB-FRET에서 단백질 상호 작용은 수용체가 광퇴색에 의해 영구적으로 비활성화되어 기증자로부터 전달된 비방사성 에너지를 수신할 수 없을 때 기증자의 상승된 복사 방출을 기반으로 검출되고 정량화됩니다(그림 1). 중요하게도, FRET 형광의 세포내 위치는 세포에서 상호작용하는 단백질의 국소화를 나타낸다.

FRET를 생체 조직에 배치하고 이러한 상호 작용 자체를 감지하는 동시에 상호 작용하는 단백질의 세포 내 위치를 결정할 수 있는 능력은 FRET를 생체 내 단백질-단백질 상호 작용의 연구 및 초기 특성화에 선택하는 기술로 만듭니다. 유사한 생체내 형광 이미징 방법론인 이분자 형광 보완(BiFC)29,30,31,32가 좋은 대안적 접근법이지만, FRET와는 달리, BiFC는 자가형광 BiFC 리포터(33)의 자발적 조립으로 인해 위양성을 생성할 수 있고, 그 데이터의 정량화는 덜 정확하다.

이 기사에서는 SE-FRET와 AB-FRET 기술을 모두 구현한 성공적인 경험을 공유하고 식물 세포에서 OTLD1과 LSH10 간의 상호 작용을 조사하기 위한 배포 프로토콜을 제시합니다.

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Protocol

본 연구에는 니코티아나 벤타미아나, 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 EHA105 또는 GV3101이 사용되었다.

1. FRET 벡터 구성

  1. 기증자/수용체 FRET 쌍에 대한 형광 태그를 선택합니다.
    1. pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (재료 표 참조)의 EGFP를 사용하여 공여체 벡터를 생성합니다.
    2. pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 ( 재료 표 참조)의 mRFP를 사용하여 수용체 벡터를 생성합니다.
  2. 게이트웨이 재조합 클로닝 시스템(35)과 같은 부위 특이적 재조합 클로닝 기술(34)을 사용하여 공여체/수용체 FRET 구축물을 생성한다.
    1. 관심 단백질(36 )의 코딩 서열을 증폭합니다(즉, 애기장대 OTLD1 및 LSH10)15.
      참고: 상호 작용하는 단백질 중 하나의 상동체를 나타내지만 상호 작용을 나타내지 않을 것으로 예상되는 음성 대조군을 활용하는 것도 좋은 생각입니다. OTLD1-LSH10 상호작용 연구는 OTLD1을 인식하지 못하는 LSH10, LSH4의 상동체를 사용합니다. OTLD1, LSH10, 및 LSH4 cDNA는 표 1에 열거된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭된다.
    2. OTLD1, LSH10, 및 LSH4를 부위 특이적 재조합 클로닝 기술(34)에 의해 진입 벡터 pDONR207 내로 복제한다.
    3. 게이트웨이 LR 클로나제 II( 재료 표 참조)를 사용하여 LSH10 및 LSH4를 pDONR207에서 이진 대상 벡터 pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1로 전달하여 이원 공여 구축물 p35S:: LSH10-GFP (테스트된 구조체) 및 p35S:: LSH4-GFP (음성 대조군)를 생성합니다.
    4. 동일한 시판되는 효소(단계 1.2.3)를 사용하여 pDONR207에서 OTLD1을 이진 대상 벡터 pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1로 전달하여 이원 수용체 구축물 p35S:: OTLD1-mRFP (시험된 작제물)를 생성합니다.
    5. 표 1에 열거된 프라이머를 사용하여 pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1로부터36 mRFP를 PCR-증폭하고, 재조합 클로닝 기술에 의해 pDONR207로 클로닝한 다음, LR 클로나제 II를 사용하여 mRFP를 pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1로 전달하여 이원 융합 구축물 p35S::mRFP-GFP(양성 대조군)를 생성한다.
  3. 기증자 및 수용체 구조물을 아그로박테리움으로 변형시킨다.
    1. 표준 프로토콜 37을 사용하여 제조하거나 상업적으로 수득한 아그로박테리움 튜메파시엔 스 균주 EHA105 또는 GV3101의 적격 세포 배양액 100μL에 1.2.3-1.2.5단계의 각 플라스미드 1μg을 첨가하고37 °C에서 5분 동안 배양한다.
    2. 1mL의 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물 및 1% NaCl, 재료 표 참조)를 유능한 세포 혼합물에 추가하고 200rpm 및 28°C에서 1.5시간 동안 교반합니다. 실온에서 1 분 동안 3,000×g에서 원심분리하여 세포를 수집한다.
    3. 피펫팅하여 세포를 0.1mL의 LB 배지에 재현탁시키고 적절한 항생제(예: 0.01% 스펙티노마이신 및 0.005% 리팜피신, 재료 표 참조)가 보충된 LB 한천에 뿌립니다. 28 °C에서 2 일 동안 성장합니다.
    4. 개별 콜로니를 선택하고 적절한 항생제가 보충된 LB 국물 1mL에 각각을 개별적으로 접종합니다.
    5. 세포를 28°C에서 24시간 동안 성장시키고 배양물 0.2mL를 새 튜브로 옮깁니다. 실온에서 30 초 동안 10,000×g에서 원심분리하여 세포를 수집합니다.
    6. 아그로박테리움 세포 38로부터 플라스미드를 단리하기 위한 표준 프로토콜에 의해 플라스미드 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를30 μL의 물에 재현탁시킨다. 원하는 플라스미드를 보유하고 있는 콜로니를 식별하려면 표 1에 나열된 유전자 특이적 프라이머와 함께 PCR을 위한 주형으로 2μL의 DNA 제제를 사용합니다. 확인된 배양물 0.7mL를 글리세롤 0.3mL와 혼합하고 -80°C에서 보관합니다.

2. 농업 침투

  1. 니코 티아나 벤타미 아나 식물을 재배하십시오.
    참고 : 전체 실험에서 모든 식물은 건강해야합니다.
    1. N. benthamiana 씨앗을 고밀도의 젖은 토양이 들어있는 화분에 뿌리고 재배하십시오.
    2. 유필의 직경이 0.5cm에 도달 할 때까지 16 시간의 빛과 8 시간의 암주기로 150-170 μmol / m2s의 광도로 23 ° C로 설정된 성장 챔버에 심은 씨앗을 보관하십시오.
    3. 묘목을 더 큰 화분으로 옮기고 동일한 매개 변수로 동일한 챔버에서 자랄 수 있도록하십시오.
      참고 : 식물은 가장 큰 잎의 직경이 5-7cm 일 때 보통 4-5 주 이내에 농 침투 준비가되어 있습니다. 너무 어린 작은 식물에서는 FRET 분석에 너무 심한 농업 침투의 영향이 있습니다.
  2. 농업 침투를 위해 박테리아 세포를 준비하십시오.
    1. FRET 구축물을 함유하는 각각의 아그로박테리움 콜로니를 적절한 항생제(단계 1.3.3) 및 28°C에서 150μM 아세토시링곤이 보충된 5mL의 LB 배지에서 밤새 성장시킨다( 재료 표 참조).
    2. 실온에서 5분 동안 3,000× g 에서 세포를 원심분리합니다.
    3. 세포를 농침윤 완충액(10 mMMgCl2, 10 mM MES pH 5.6, 150 μM 아세토시링온)에OD600 =0.5로 재현탁시킨다.
    4. 적절한 구조를 보유한 세포 사이에 1 : 1 v / v 비율로 재현 된 세포를 결합합니다 (2.2.5 단계).
    5. 이중 구성 농업 침투의 경우 두 문화의 분취량을 혼합하고 단일 구성 농업 침투의 경우 동일한 배양의 분취량을 혼합합니다.
      1. 시험된 단백질: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP(p35S::OTLD1-mRFP 및 p35S::LSH10-GFP 구축물을 보유하는 박테리아).
      2. 음성 대조군 : OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (p35S : : OTLD1-mRFP 및 p35S :: LSH4-GFP 구축물을 보유하고있는 박테리아).
      3. 음성 대조군 : LSH10-GFP + 유리 mRFP (p35S : : LSH10-GFP 및 pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 구축물을 보유하는 박테리아).
      4. 양성 대조군 : mRFP-GFP (p35S :: mRFP-GFP 구조체를 보유하고있는 박테리아).
    6. 세포를 28°C에서 0.5-1시간 동안 배양합니다.
  3. 농업 침투를 수행하십시오.
    1. 박테리아 배양액을 바늘 없는 주사기 1mL에 넣습니다.
    2. 부드럽게 그러나 단단히 주사기의 노즐을 완전히 확장 된 N. benthamiana 잎의 축 방향 쪽에 대고 장갑을 낀 손가락으로 잎을 축 방향으로 잡습니다.
    3. 잎에 최대 4 개의 지점, 식물 당 3 개의 잎, 각 박테리아 배양에 대해 2 개 또는 3 개의 식물에 침투합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 샘플 사이에 장갑을 교체하십시오.
    4. 농윤 식물을 단계 2.1.2에 기재된 바와 같이 동일한 조건하에서 동일한 성장 챔버에서 24 시간 내지 36 시간 동안 유지한다. 농작물 침투 식물을 36 시간 이상 보관하면 형광 신호가 감소하므로 사용하지 마십시오.

3. 컨포칼 현미경

  1. 형광 시각화를 위한 현미경 슬라이드를 준비합니다.
    1. 침투 24-36 시간 후, 면도날을 사용하여 각 농작물 침투 잎을 정맥 사이의 작은 조각 (2mm x 4mm)으로 자릅니다.
    2. 축 방향 잎 표면이 위를 향하도록 유리 슬라이드에 잎 조각을 놓습니다. 잎 조각에 물 한 방울을 놓고 커버 유리로 덮으십시오. 커버 유리를 살짝 두드려 기포를 제거합니다.
    3. 현미경과 레이저를 켭니다( 재료 표 참조). 특정 FRET 매개변수(3.2단계 및 3.3단계)에서 이미징을 위해 슬라이드를 현미경 스테이지 홀더에 놓습니다.
    4. 10x 대물 렌즈를 사용하여 관찰을 시작하여 GFP 및 mRFP 신호를 모두 나타내는 세포를 식별한 다음 후속 세부 관찰을 위해 40x 대물 렌즈를 사용합니다.
      참고: 중요한 것은 SE-FRET와 AB-FRET는 일반적으로 동일한 조직 샘플에서 수행되므로 SE-FRET와 AB-FRET 관찰에 대해 각각 켜짐/꺼짐(단계 3.2.2.3 및 3.3.1단계)을 제외하고 동일한 채널 설정(단계 3.2)을 사용할 수 있다는 것입니다.
  2. SE-FRET에 대한 매개 변수를 설정합니다(그림 1A).
    1. 다차원 수집(MDA) 도구를 엽니다.
    2. 동일한 시야에 3개의 공초점 채널 세트를 설정합니다(보충 그림 1).
      1. 405nm 여기 레이저 및 400-597nm 방출 필터를 사용하여 도너 형광 색소의 여기 및 방출을 위한 도너 채널(GFP 채널)을 설정합니다.
      2. 561nm 여기 레이저 및 400-597nm 방출 필터를 사용하여 수용체 형광 색소의 여기 및 방출을 위한 수용체 채널(mRFP 채널)을 설정합니다.
        참고: mRFP용 방출 필터는 400-597nm로 설정되어 597-617nm의 FRET 신호에서 mRFP 신호를 분리하고(단계 3.2.2.3) FRET 독립적인 mRFP 방출을 줄입니다.
      3. 405nm 여기 레이저 및 597-617nm 방출 필터를 사용하여 공여체의 여기 및 수용체 형광 색소의 방출을위한 FRET 채널을 설정합니다.
    3. 기증자 여기 강도를 최소 수준으로 설정하여 광퇴색을 피하면서 FRET를 관찰하여 SE-FRET 효율을 줄입니다.
      알림: 이 여기 강도는 광퇴색을 피하기 위해 FRET 절차를 수행하기 전에 실험적으로 선택됩니다. 잎의 굵기, 나이, 과발현 후의 시간에 따라 다릅니다.
    4. 기증자를 여기시키고 수용체의 예상 형광 신호가 포함된 세포를 스캔합니다.
    5. 관심 있는 형광 신호가 포함된 영역을 선택합니다.
    6. 스냅 버튼을 눌러 SE-FRET 이미지 시퀀스를 획득합니다.
      1. 이미지 10-15는 mRFP-GFP 구축물 (양성 대조군)을 먼저 발현하는 세포; 초점, 확대/축소 및 스마트 게인 매개변수를 조정하여 캡처할 관심 영역에 초점을 맞춥니다(보충 그림 2).
      2. 동일한 설정을 사용하여, 각각 OTLD1-mRFP, 유리 mRFP, LSH10-GFP, 또는 LSH4-GFP를 개별적으로 발현하는 10-15 세포를 이미지화한다.
        참고 :이 이미지는 수용체와 기증자에 대한 스펙트럼 블리드 스루 (SBT) 값을 결정하기 위해 FRET 데이터 분석 (3.4.1 단계)에 사용 된 ImageJ의 "PixFRET"플러그인 ( 재료 표 참조)에 의해 수집됩니다. 이러한 이미지는 OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP 및 LSH10-GFP + 유리 mRFP 단백질 쌍에 대한 SE-FRET 이미지를 생성하기 위해 소프트웨어에 의해 사용됩니다 (단계 3.2.6.3).
      3. 또한, 동일한 설정을 사용하여, 화상 10-15 세포를 공동 발현하는 OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP, 및 LSH10-GFP+ 유리 mRFP 단백질 쌍을 공동 발현한다.
  3. AB-FRET에 대한 매개 변수를 설정합니다(그림 1B).
    1. SE-FRET에 대해 설정된 도너 및 수용체 채널 매개변수를 활용하되(단계 3.2.2) FRET 채널을 끕니다.
    2. 수용체(mRFP)의 광퇴색에 대한 매개변수를 설정합니다(보충 그림 3).
      1. 5개의 이미지 후에 표백이 시작되는지 확인합니다. 각 영역 표백제에 대해 200회 반복을 허용합니다. 561nm에서 100% 레이저 강도를 유지하십시오.
      2. 45 초의 표백 기간을 유지하십시오. 400Hz에서 512 x 512 픽셀의 스캔 속도를 보장합니다.
    3. 표백 할 세포의 영역을 그립니다. 예를 들어, 핵 상호작용에 대해, 관심 영역은 세포핵(39)의 전체 영역 주위에 그려진다.
    4. 실험 시작 버튼을 눌러 표백을 활성화하십시오. 이 기능을 활성화하면 광퇴색이 수행되고 AB-FRET 이미지 시퀀스가 획득됩니다.
  4. FRET 데이터를 분석합니다.
    1. SE-FRET 데이터를 분석하려면 ImageJ 소프트웨어용 "PixFRET" 플러그인을 사용하여 SBT40 을 뺀 후 SE-FRET 효율의 수정된 이미지를 생성합니다(단계 3.2.6.2).
    2. AB-FRET 데이터를 분석하기 위해, 하기 식41을 사용하여 mRFP 광표백 후 GFP 방출의 백분율 증가로서 %AB-FRET를 계산한다: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre)/GFPpre] x 100, 여기서, GFPpost는 mRFP 광퇴색 후의 GFP 방출이고, GFPpre는 mRFP 광퇴색 전의 GFP 방출이다.
    3. FRET 이미지를 검토할 때 FRET 신호의 세포하 국소화에 주의하십시오.
      참고: 많은 경우에, 이러한 세포 구획(예를 들어, 핵, 엽록체, ER 등)은 쉽게 식별될 수 있고, FRET 기술의 추가적인 이점으로서, 상호작용하는 단백질의 생물학적 기능에 대한 중요한 단서를 제공한다.

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Representative Results

도 2 는 세포핵이 3개의 채널(즉, 공여자 GFP, 수용체 mRFP, 및 SE-FRET)에서 동시에 기록된 SE-FRET 실험의 전형적인 결과를 도시한다. 이러한 데이터는 의사 색상 스케일로 코딩된 SE-FRET 효율의 이미지를 생성하는 데 사용되었습니다. 이 척도에서 파란색에서 빨간색으로의 전환은 0%에서 100%까지의 단백질-단백질 근접성을 측정하는 FRET 효율의 증가에 해당합니다. 본 대표적인 실험에서 SE-FRET 신호는 세포핵에 기록되었으며, LSH10 및 OTLD1의 동시 발현 후 강도는 mRFP-GFP 발현 후 관찰된 강도(즉, 양성 대조군)와 유사하였다. 음성 대조군 (즉, OTLD1-mRFP 및 LSH4-GFP 또는 유리 mRFP 및 LSH10-GFP의 동시 발현)에서는 SE-FRET가 관찰되지 않았다.

LSH10-OTLD1 상호작용은 AB-FRET를 사용하여 정량화하였다. 이를 위해, 공여체 GFP 형광은 공여체 및 수용체 형광 측정의 광퇴색 시계열로서 수용체 mRFP의 광퇴색 전후의 세포핵에 기록되었다(보충 그림 4). 기록된 세포핵의 이미지는 GFP 형광의 변화를 정량화하기 위해 유사색으로 표시되었습니다. 그림 3 은 LSH10-GFP/OTLD1-mRFP 공동 발현이 mRFP 수용체가 광표백되고 형광 능력을 상실한 후 GFP 공여체 형광이 증가했음을 보여줍니다. mRFP-GFP 양성 대조군에서는 유사한 공여체 형광 증가가 관찰되었지만 LSH4-GFP/OTLD1-mRFP 또는 LSH10-GFP/mRFP 공발현의 음성 대조군에서는 관찰되지 않은 반면, 수용체 형광은 모든 광퇴색 실험에서 비활성화되었습니다. 그림 4 는 AB-FRET 데이터의 정량 분석을 보여주며, LSH10과 OTLD1을 동시 발현한 후 약 13%의 공여체 형광(%AB-FRET)이 통계적으로 유의하게 증가했음을 보여줍니다. 양성 mRFP-GFP 대조군은 약 30%의 %AB-FRET를 생성한 반면, 음성 대조군은 %AB-FRET를 생성하지 않았습니다. SE-FRET와 AB-FRET 이미지 모두 세포핵의 FRET 신호를 보여주었으며, 이는 전사 인자-히스톤-변형 효소 복합체 및 GFP/mRFP 단백질34 의 핵세포질 특성에 대해 예상되는 세포내 국소화와 일치합니다(그림 2 및 그림 3).

요약하면, 대표적인 데이터는 이 FRET 프로토콜이 히스톤 변형 효소와 전사 인자 간의 상호작용을 입증 및 정량화하고 살아있는 식물 세포에서 세포내 국소화를 결정하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.

Figure 1
그림 1: SE-FRET 및 AB-FRET 기법의 개략도 . (A) SE-FRET의 기본 원리. 테스트 된 단백질 중 하나는 공여체 형광 색소 역할을하는 GFP로 태그되고 다른 하나는 수용체 형광 색소 역할을하는 mRFP로 태그됩니다. 공여체 분자가 여기되고 수용체 방출이 기록됩니다. 시험된 단백질이 서로 상호작용하여 서로 10nm 내에 위치하는 경우, 여기된 공여체로부터의 에너지는 비방사성으로 수용체로 전달되고, 수용체는 여기되어 FRET 방출 채널에서 형광을 방출한다. 상호 작용이 발생하지 않으면 공여체에서 수용체로 에너지가 전달되지 않으며 수용체에 의한 FRET 방출이 감지되지 않습니다. (B) AB-FRET의 기본 원리. 시험된 단백질은 SE-FRET에 대한 (A)에 기재된 바와 같이 태그된다. 공여체 분자는 여기되고, 테스트 된 단백질 간의 상호 작용이 발생하면 기증자는 비 방사성 방식으로 수용체를 여기시켜 FRET를 초래합니다. 이어서, 수용체는 광퇴색에 의해 영구적으로 불활성화되고, 이에 따라 공여체로부터 비-방사성 에너지를 수용하고 FRET 방출 채널에서 FRET 형광을 방출하는 그의 능력을 상실하고; 반면에 공여체가 방출하는 형광은 공여체가 비 방사성 전달에 의해 더 적은 에너지를 잃기 때문에 증가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: SE-FRET에 의해 검출된 N. 벤타미아나 잎에서 LSH10과 OTLD1의 특정 상호 작용. 표시된 단백질 조합에 대해 3개의 검출 채널(기증자, 수용체 및 SE-FRET)의 이미지가 표시됩니다. SE-FRET 효율 이미지는 스펙트럼 블리드 스루 (SBT)를 빼서 계산되었으며 의사 색상으로 표시되며 빨간색과 파란색은 각각 가장 높은 신호와 가장 낮은 신호를 나타냅니다. (A) mRFP-GFP 양성 대조군에 의해 생성된 높은 SE-FRET 효율 신호. (B) 상호작용하는 LSH10-GFP 및 OTLD1-mRFP 단백질에 의해 생성된 양성 SE-FRET 효율 신호. (c) 음성 대조군 단백질 LSH4-GFP와 OTLD1-mRFP의 동시 발현은 SE-FRET 효율 신호를 생성하지 않았다. (d) 음성 대조군이 없는 mRFP 단백질과 LSH10-GFP의 공발현은 SE-FRET 효율 신호를 생성하지 않았다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: AB-FRET에 의해 검출된 N. 벤타미아나 잎에서 LSH10과 OTLD1의 특이적 상호작용. 광표백 전후의 두 검출 채널(공여체 및 수용체)의 이미지가 표시된 단백질 조합에 대해 표시됩니다. 원은 광표백 영역을 나타냅니다. mRFP 광퇴색 후 GFP 형광의 증가로 시각화된 AB-FRET는 각각 최고 및 최저 신호를 나타내는 빨간색과 파란색의 의사 색상을 사용하여 표시됩니다. (A) mRFP-GFP 양성 대조군에 의해 생성된 GFP 공여체 형광의 증가. (B) 상호작용하는 LSH10-GFP 및 OTLD1-mRFP 단백질에 의해 생성된 GFP 공여체 형광의 증가. (c) 음성 대조군 단백질 LSH4-GFP와 OTLD1-mRFP의 동시 발현은 GFP 공여체 형광에서 무시할 수 있는 변화를 일으켰다. (D) 음성 대조군 유리 mRFP 단백질과 LSH10-GFP의 동시 발현은 GFP 공여체 형광에서 무시할 수 있는 변화를 일으켰다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: AB-FRET의 정량화. mRFP 광표백 후 GFP 공여체 형광의 백분율 증가(%AB-FRET)가 표시된 단백질 조합에 대해 표시됩니다. 오차 막대는 각 측정에 대한 n = 13개 셀의 평균을 나타냅니다. 양측 t-검정은 p-값 *p <0.05, **p < 0.01 및 ***p < 0.001에 대해 평균값 간의 차이가 통계적으로 유의하다는 것을 확인했습니다. p≥ 0.05는 통계적으로 유의하지 않습니다(NS). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

입문서 이름 시퀀스 (5 ∼ 3 ∼) 목적
OTLD1 Fw ggggacaagtttgtacaaagcaggctcaatgactcggattttggttttcaaag cDNA로부터 OTLD1 증폭
OTLD1 Rv ggggaccactttgtacaagaagctgggtgttccgtggctttgcctttgcgtc cDNA로부터 OTLD1 증폭
LSH10 Fw ggggacaagtttgtacaagcaggctcaatgtcctctccaagagaagaagg cDNA에서 LSH10 증폭
LSH10 Rv ggggaccactttacaagaagctgggtgatgtcaacagagactaaagaaaagaaac cDNA에서 LSH10 증폭
LSH4 Fw ggggacaagtttgtacaagcaggctcaatggatcatcggctttttg cDNA에서 LSH4 증폭
LSH4 Rv ggggaccactttacaagaagctgggtgattagggctacttgaaatcgcc cDNA에서 LSH4 증폭
mRFP Fw ggggacaagtttgtacaagcaggctcaatggcctcctccgaggacgt pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1에서 mRFP 증폭
mRFP Rv ggggaccactttacaagaagctgggtgttggagatctgcggccgcgg pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1에서 mRFP 증폭
AttL1 tcgcgttaacgctagcatggatctc PCR 및 DNA 염기서열분석을 통한 pDONR207의 서열 확인
수신L2 GTAACATCAGAGATTTGATTGAGACAC PCR 및 DNA 염기서열분석을 통한 pDONR207의 서열 확인
AttB1 Fw ggggacaagtttgtac aaaaagcaggct PCR 및 DNA 염기서열분석을 통한 표적 벡터의 서열 확인
AttB2 Rv ggggaccactttgta caagaaagctgggt PCR 및 DNA 염기서열분석을 통한 표적 벡터의 서열 확인
35S 프로모터 Fw ctatccttcgcaagacccttc PCR로 목적지 벡터의 서열 확인

표 1: pDONOR207 및 대상 벡터에서 클로닝 및 클로닝된 서열을 확인하기 위한 프라이머. Fw, 순방향 프라이머; Rv, 역 프라이머.

보충 그림 1: 컨포칼 채널에 대한 파라미터 설정. (A) 기증자 채널(GFP)에 대한 여기 및 방출 매개변수 설정을 위한 스크린샷. (B) 수용체 채널 (mRFP)에 대한 여기 및 방출 매개 변수 설정을위한 스크린 샷. (C) FRET 채널의 여기 및 방출 파라미터 설정을 위한 스크린샷. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 관심 샘플의 SE-FRET 이미지 획득을 위한 매개변수 조정. (A) 스캔 영역 매개변수 설정을 위한 스크린샷(예: 이미지 크기, 스캔 속도, 방향 및 평균). (B) GFP 채널 파라미터 설정(예: 레이저, 핀홀, 마스터 게인 및 디지털 게인)을 위한 스크린샷. (C) mRFP 채널 매개변수 설정(예: 레이저, 핀홀, 마스터 게인 및 디지털 게인)을 위한 스크린샷. (D) FRET 채널 파라미터 설정(예: 레이저, 핀홀, 마스터 게인 및 디지털 게인)을 위한 스크린샷. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: 수용체 광퇴색을 위한 매개변수 설정. (A) 스캔 영역 매개변수 설정을 위한 스크린샷(예: 이미지 크기, 스캔 속도, 방향 및 평균). (B) 시계열 및 시간 표백 매개 변수 설정에 대한 스크린 샷. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 4: AP-FRET에서 도너 및 수용체 형광 측정의 시계열. 수용체 (mRFP) 및 공여체 (GFP) 형광의 동역학은 광표백 기간 전, 도중 및 후에 지시된 샘플에 대해 결정되었다. (A) 양성 mRFP-GFP 대조군. (B) LSH10-GFP + OTLD1-mRFP. (C) 음성 LSH4-GFP + OTLD1-mRFP 대조군. (D) 음성 LSH10-GFP + 무료 mRFP 대조군. 노란색 선은 광퇴색 기간을 나타냅니다. 백색 곡선은 형광 동역학의 측정값을 표시합니다. 각 패널에서 상부 및 하부 이미지는 각각 수용체 (mRFP) 및 공여체 (GFP) 형광의 동역학을 보여줍니다. 자연적으로 GFP 형광은 레이저가 GFP 자체를 점차적으로 광표백하기 때문에 시간이 지남에 따라 종종 감소합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 FRET 프로토콜은 간단하고 재현하기 쉽습니다. 또한 최소한의 공급 투자가 필요하며 많은 현대 실험실에 표준 장비를 사용합니다. 특히, 다섯 가지 주요 기술적 특징이이 절차의 다양성을 구별합니다. 첫째, FRET 구축물은 기존의 제한 효소 기반 클로닝에 비해 사용하기 쉽고 정확한 결과를 생성하며 시간을 절약하는 클로닝 접근 방식인 부위 특이적 재조합을 사용하여 생성됩니다. 둘째, N. benthamiana 식물은 재배가 간단하고 비교적 많은 양의 조직을 생산하며 대부분의 실험실에서 사용할 수 있습니다. 셋째, 농 침투는 전달 된 구조물의 일시적인 발현을 초래하고, 따라서 트랜스 제닉 식물을 생산하는 데 필요한 개월에 비해 상대적으로 짧은 기간 (즉, 24-36 시간) 내에 데이터를 생성합니다. 넷째, 공동 농업 침투에 의해 관심있는 구조물의 다양한 조합을 전달하는 능력은 모든 단백질 간의 상호 작용을 테스트 할 수있게합니다. 마지막으로, SE-FRET와 AB-FRET는 레이저 채널 설정 중 하나를 켜거나 끄는 것만으로 동일한 조직 샘플에서 순차적으로 수행할 수 있습니다. 그러나, 미세 폭격 전달(42 )은 농업 침투 대신에 식물 조직으로의 구조물 전달을위한 대안적인 접근법으로서 사용될 수있다; 이 경우, 농업 침투에 필요한 이진 벡터의 사용은 불필요하다.

이 프로토콜의 한 가지 중요한 단계는 FRET 효율을 최적화하기 위해 공여체와 수용체 형광 색소 쌍을 적절하게 선택하는 것입니다. 다음의 세 가지 요소가 고려되어야한다 : (1) 공여체 방출 스펙트럼은 전달 된 에너지의 양을 최대화하기 위해 수용체 흡수 스펙트럼과 최대한 겹칠 필요가있다; (2) 공여체와 수용체의 방출 스펙트럼은 서로 구별되고 현미경으로 검출 된 신호의 SBT를 최소화 할 수있을만큼 충분히 달라야합니다. (3) 수용체는 공여자의 여기 동안 수용체의 흥분을 최소화하기 위해 공여자의 흡광도 최대치에서 최소한의 직접 여기를 가져야합니다. 사용되는 일반적인 공여체/수용체 FRET 쌍은 청록색/노란색 및 녹색/적색 형광 단백질(즉, 각각 CFP/YFP 및 GFP/mRFP)입니다. 이 프로토콜은 라이브 셀 이미징에 적합하고 청록색/노란색 FRET 쌍과 달리 낮은 광독성 및 낮은 광퇴색을 나타내기 때문에 GFP/mRFP 쌍을 활용합니다43. 편리하게는, FRET 쌍 (즉, mRFP-GFP) 사이의 병진 융합은 이상적인 FRET 양성 대조군으로서 작용한다.

또 다른 중요한 단계는 적절한 음성 대조군을 선택하는 것입니다. 예를 들어, LSH10-OTLD1 상호작용의 경우, FRET 분석은 항상 OTLD1 단독, LSH10 단독, 및 상호작용이 예상되지 않는 단백질(즉, 각각 LSH4 및 유리 mRFP)과 OTLD1 및 LSH10의 동시 발현을 포함해야 한다. 음성 대조군의 선택의 관점에서, FRET 실험은 살아있는 식물 세포 29,30,31,32에서 단백질 상호작용의 검출에 적응된 또 다른 형광 이미징 기반 접근법인 BiFC 기술(44)의 사용을 위한 모범 사례에 대한 지침을 따를 수 있다.

마지막으로, FRET 실험에 영향을 미치는 인자는 살아있는 식물 조직에서의 모든 실험에 공통적이며, 이는 식물, 일반적으로, 및 특히 대조군 성장 조건 하에서 유지되는 경우에도 농업 침윤된 형질전환된 세포의 다양한 생리학적 조건으로부터 유래한다. 이러한 생리학적 가변성은 개별 실험, 식물 및 심지어 잎 사이의 FRET 데이터의 특정 가변성에 기여할 수 있습니다. 따라서 각 실험에 대해 식물 당 최소 2 개의 식물과 3 개의 잎을 사용하고 더 나은 이미지를 산출하기 때문에 농업 침투를 위해 성숙하고 완전히 확장 된 잎을 선택하는 것이 중요합니다.

모든 실험 방법론과 마찬가지로 FRET에는 기술 및 사용 기반 한계가 있습니다. 이러한 제한 인자 중 하나는 자가형광 태그의 특성 및 관심 단백질 내에서의 그의 위치(예를 들어, 아미노- 또는 카르복실-말단에서)이며, 이는 세포하 국소화의 그의 고유 패턴 또는 그의 천연 상호작용자를 인식하는 능력과 같은 이 단백질의 생물학적 특성을 방해할 수 있다. 태깅하기 전에 각 관심 단백질은 태깅으로 인해 손상 될 수있는 구조적 특징에 대해 가능한 한 분석되어야합니다. 그러나, 많은 경우에, 태깅 파라미터는 관심있는 단백질의 공지된 활성에 기초하여 경험적으로 결정되어야 한다. 또 다른 주요 한계는 적절한 하드웨어 및 소프트웨어와 함께 컨포칼 현미경을 사용해야 하는 FRET의 상대적인 기술적 정교함입니다. 효모 2-하이브리드 시스템(Y2H)45,46,47과 같은 몇몇 다른 단백질 상호작용 방법과는 달리, FRET는 발현 라이브러리, 특히 고처리량 스크린(48)을 스크리닝함으로써 단백질 상호작용을 확인하는데 부적합하다. 또한, 생체내에서 수행되는 대부분의 분석과 같이, FRET는 생화학적으로 순수한 시스템이 아니며, 따라서, 상호작용에서 다른 알려지지 않은 세포 인자의 잠재적 관여를 검출하지 못한다.

단백질 상호 작용의 다른 분석과 관련하여 FRET의 중요성은 단거리 상호 작용의 검출, 위양성 결과의 가능성 감소, 다양한 세포, 조직 및 유기체(식물 포함)에서의 생체 내 배치에 대한 적용 가능성, 상호 작용하는 단백질의 세포내 국소화 검출에 있습니다. FRET의 이러한 특성의 대부분은 스플릿-루시퍼라아제 49,50 또는 BiFC29,30,31,32,33과 같은 다른 생체내 접근법에서 발견 되며, 그 중 BiFC가 아마도 가장 일반적으로 사용될 것입니다. 널리 사용되는 또 다른 상호 작용 분석은 Y2H45,46,47; 그러나 효모 생물학 연구 외에이 분석은 오 탐지가 발생하기 쉬운 이종 실험 시스템을 사용하며 그 결과는 다른 기술에 의한 확인이 필요합니다. Y2H의 개념적 변형은 막 단백질51,52 사이의 상호작용을 검출하는 데 더 적합하고 Y2H와 유사한 FRET에 비해 한계를 나타내는 분할-유비퀴틴 분석입니다. 마지막으로, 단백질 상호작용은 공동면역침전(co-IP)에 의해 검출될 수 있으며, 이는 세포 추출물의 복잡한 환경에서의 검출뿐만 아니라 정확하게 정의된 시험관내 반응53,54,55; 우리의 경험에 비추어 볼 때, co-IP는 형광 기반 생체 내 접근법을 사용하여 얻은 데이터를 확인하는 대안적이고 독립적 인 방법으로 가장 유용합니다.

이 특정 FRET 프로토콜은 식물 전사 인자와 히스톤 변형 효소 간의 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었지만 다른 많은 종류의 단백질 간의 상호 작용을 발견하고 특성화하는 데 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

이해 상충은 선언되지 않았습니다.

Acknowledgments

V.C. 실험실에서의 작업은 NIH (R35GM144059 및 R01GM50224), NSF (MCB1913165 및 IOS1758046) 및 BARD (IS-5276-20)의 보조금으로 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used

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생물학 이슈 188 히스톤 변형 효소(HME) 전사 인자(TF) 단백질-단백질 상호작용 FRET
형광 공명 에너지 전달에 의한 <em>생체 내</em> 히스톤 변형 효소와 전사 인자 간의 상호 작용 조사
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Vo Phan, M. S., Tran, P. T.,… More

Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).

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