Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Undersøke interaksjoner mellom histonmodifiserende enzymer og transkripsjonsfaktorer in vivo ved fluorescensresonansenergioverføring

Published: October 14, 2022 doi: 10.3791/64656
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Cell Biology, State University of New York

Summary

Fluorescens resonans energioverføring (FRET) er en avbildningsteknikk for å oppdage proteininteraksjoner i levende celler. Her presenteres en FRET-protokoll for å studere assosiasjonen av histonmodifiserende enzymer med transkripsjonsfaktorer som rekrutterer dem til målpromotorene for epigenetisk regulering av genuttrykk i plantevev.

Abstract

Epigenetisk regulering av genuttrykk påvirkes ofte av histonmodifiserende enzymer (HME) som genererer heterokromatiske eller eukromatiske histonmerker for henholdsvis transkripsjonell undertrykkelse eller aktivering. FVV rekrutteres til målkromatin ved transkripsjonsfaktorer (TFs). Å oppdage og karakterisere direkte interaksjoner mellom FVV og TF er derfor avgjørende for å forstå deres funksjon og spesifisitet bedre. Disse studiene vil være mer biologisk relevante hvis de utføres in vivo i levende vev. Her beskrives en protokoll for visualisering av interaksjoner i planteblader mellom en plantehiston deubiquitinase og en plantetranskripsjonsfaktor ved bruk av fluorescensresonansenergioverføring (FRET), som gjør det mulig å oppdage komplekser mellom proteinmolekyler som er innenfor <10 nm fra hverandre. To varianter av FRET-teknikken presenteres: SE-FRET (sensibilisert utslipp) og AB-FRET (akseptorbleking), der energien overføres ikke-radiativt fra giveren til akseptoren eller sendes ut radiativt av giveren ved fotobleking av akseptoren. Både SE-FRET og AB-FRET tilnærminger kan enkelt tilpasses for å oppdage andre interaksjoner mellom andre proteiner i planta.

Introduction

Plante histon deubiquitinases spiller en viktig rolle i å kontrollere genuttrykk ved post-translasjonell modifikasjon av histoner, spesielt ved å slette deres monoubiquitylation merker1. Så langt er OTLD1 en av de få plante histon deubiquitinases karakterisert på molekylært nivå i Arabidopsis 2,3. OTLD1 fjerner monoubiquitingrupper fra H2B-histonmolekylene, og fremmer dermed fjerning eller tilsetning av eukromatisk acetylering og metyleringsmodifikasjoner av H3-histoner i målgenkromatin 4,5. Videre interagerer OTLD1 med et annet kromatinmodifiserende enzym, histonlysin-demetylase KDM1C, for å påvirke transkripsjonell undertrykkelse av målgenene 6,7.

De fleste histonmodifiserende enzymer mangler DNA-bindingsevne, og kan dermed ikke gjenkjenne målgenene direkte. En mulighet er at de samarbeider med DNA-bindende transkripsjonsfaktorproteiner som binder disse enzymene og leder dem til kromatinmålene. Spesielt i planter er flere store histonmodifiserende enzymer (dvs. histonmetyltransferaser 8,9, histon acetyltransferaser 10, histondemetylaser 11 og Polycomb repressive komplekser12,13,14) kjent for å bli rekruttert av transkripsjonsfaktorer. I samsvar med denne ideen ble det nylig foreslått en mulig mekanisme for OTLD1-rekruttering til målpromotorene som er basert på spesifikke protein-protein-interaksjoner av OTLD1 med en transkripsjonsfaktor LSH1015.

LSH10 tilhører en familie av planten ALOG (Arabidopsis LSH1 og Oryza G1) proteiner som fungerer som sentrale utviklingsregulatorer 16,17,18,19,20,21,22. Det faktum at medlemmene av LOG-proteinfamilien inneholder DNA-bindende motiver 23 og viser kapasiteten til transkripsjonsregulering22, nukleær lokalisering19 og homodimerisering24, gir ytterligere støtte til forestillingen om at disse proteinene, inkludert LSH10, kan fungere som spesifikke transkripsjonsfaktorer under epigenetisk regulering av transkripsjon. En av de viktigste eksperimentelle teknikkene som brukes til å karakterisere LSH10-OTLD1-interaksjonen in vivo er fluorescensresonansenergioverføring (FRET)15.

FRET er en avbildningsteknikk for direkte å oppdage nærgående interaksjoner mellom proteiner innen <10 nm fra hverandre25 inne i levende celler. Det er to hovedvarianter av FRET-tilnærmingen26: sensibilisert emisjon (SE-FRET) (figur 1A) og akseptorbleking (AB-FRET) (figur 1B). I SE-FRET er de samvirkende proteinene - hvorav den ene er merket med en donorfluorokrom (f.eks. grønt fluorescerende protein, GFP) og den andre med en akseptorfluorokrom (f.eks. monomert rødt fluorescerende protein, mRFP27,28) - overfører ikke-radiativt den eksiterte tilstandsenergien fra giveren til akseptoren. Fordi ingen fotoner sendes ut under denne overføringen, produseres et fluorescerende signal som har et strålingsemisjonsspekter som ligner på akseptoren. I AB-FRET påvises og kvantifiseres proteininteraksjoner basert på forhøyet strålingsutslipp fra giveren når akseptoren inaktiveres permanent ved fotobleking, og dermed ikke er i stand til å motta den ikke-radiative energien overført fra giveren (figur 1). Det er viktig at den subcellulære plasseringen av FRET-fluorescensen indikerer lokaliseringen av de samvirkende proteinene i cellen.

Evnen til å distribuere FRET i levende vev og bestemme den subcellulære lokaliseringen av de samvirkende proteinene samtidig med å oppdage denne interaksjonen i seg selv, gjør FRET til den valgte teknikken for studier og innledende karakterisering av protein-protein-interaksjoner in vivo. En sammenlignbar in vivo fluorescensavbildningsmetodikk, bimolekylær fluorescenskomplementering (BiFC) 29,30,31,32, er en god alternativ tilnærming, selv om BiFC, i motsetning til FRET, kan produsere falske positiver på grunn av spontan montering av de autofluorescerende BiFC-reporterne 33, og kvantifisering av dataene er mindre presis.

Denne artikkelen deler den vellykkede erfaringen med å implementere både SE-FRET og AB-FRET teknikker og presenterer en protokoll for distribusjon for å undersøke samspillet mellom OTLD1 og LSH10 i planteceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens stamme EHA105 eller GV3101 ble brukt til denne studien.

1. FRET vektor konstruksjon

  1. Velg fluorescerende koder for donor/akseptor FRET-paret.
    1. Bruk EGFP fra pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (se Materialtabell) for å generere donorvektoren.
    2. Bruk mRFP fra pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (se Materialtabell) for å generere akseptorvektoren.
  2. Generer donor/akseptor FRET-konstruksjonene ved hjelp av en stedsspesifikk rekombinasjonskloningsteknikk34, for eksempel Gateway-rekombinasjonskloningssystemet35.
    1. Forsterk kodesekvensene til proteinene av interesse36 (dvs. Arabidopsis OTLD1 og LSH10)15.
      MERK: Det er også en god ide å bruke en negativ kontroll som representerer en homolog av et av de samvirkende proteinene, men forventes ikke å vise interaksjon; OTLD1-LSH10 interaksjonsstudien benytter en homolog av LSH10, LSH4, som ikke gjenkjenner OTLD1. OTLD1, LSH10 og LSH4 cDNAer forsterkes av PCR ved hjelp av primere oppført i tabell 1.
    2. Klon OTLD1, LSH10 og LSH4 inn i inngangsvektoren pDONR207 ved hjelp av den stedsspesifikke rekombinasjonskloningsteknikken34.
    3. Bruk Gateway LR Clonase II (se materialtabell) til å overføre LSH10 og LSH4 fra pDONR207 til den binære destinasjonsvektoren pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 for å generere de binære donorkonstruksjonene p35S::LSH10-GFP (testet konstruksjon) og p35S::LSH4-GFP (negativ kontroll).
    4. Bruk det samme kommersielt tilgjengelige enzymet (trinn 1.2.3) til å overføre OTLD1 fra pDONR207 til den binære destinasjonsvektoren pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 for å generere den binære akseptorkonstruksjonen p35S:: OTLD1-mRFP (testet konstruksjon).
    5. PCR-forsterker36 mRFP fra pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 ved hjelp av primere oppført i tabell 1, kloner den ved rekombinasjonskloningsteknikken til pDONR207, og bruker deretter LR Clonase II til å overføre mRFP til pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 for å generere den binære fusjonskonstruksjonen p35S::mRFP-GFP (positiv kontroll).
  3. Utfør transformasjon av giver- og akseptorkonstruksjoner til Agrobacterium.
    1. Tilsett 1 μg av hvert plasmid fra trinn 1.2.3-1.2.5 til 100 μL av kulturen av kompetente celler av Agrobacterium tumefaciens stamme EHA105 eller GV3101, fremstilt ved bruk av standardprotokoller 37 eller oppnådd kommersielt, og inkuber ved37 ° C i 5 minutter.
    2. Tilsett 1 ml LB-medium (1% trypton, 0,5% gjærekstrakt og 1% NaCl; se materialtabell) til den kompetente celleblandingen og agiter ved 200 o / min og 28 ° C i 1,5 timer. Samle cellene ved sentrifugering ved 3000 × g i 1 minutt ved romtemperatur.
    3. Resuspendere cellene i 0,1 ml LB-medium ved pipettering og spre dem på LB-agar supplert med passende antibiotika (f.eks. 0,01 % spektinomycin og 0,005 % rifampicin; se materialtabell). Vokser ved 28 °C i 2 dager.
    4. Velg individuelle kolonier og inokuler hver av dem separat i 1 ml LB-buljong supplert med passende antibiotika.
    5. Dyrk cellene ved 28 °C i 24 timer og overfør 0,2 ml av kulturen til et nytt rør. Samle cellene ved sentrifugering ved 10.000 × g i 30 s ved romtemperatur.
    6. Utdrag plasmid-DNA ved en standardprotokoll for å isolere plasmider fra Agrobacterium-celler38 og resuspendere det ekstraherte DNA i 30 μL vann. For å identifisere koloniene som inneholder de ønskede plasmidene, bruk 2 μL av DNA-preparatet som en mal for PCR med genspesifikke primere oppført i tabell 1. Bland 0,7 ml av den identifiserte kulturen med 0,3 ml glyserol og oppbevar ved -80 °C.

2. Agroinfiltrasjon

  1. Vokse Nicotiana benthamiana planter.
    MERK: Gjennom hele eksperimentet må alle planter være sunne.
    1. Så og vokse N. benthamiana frø i en gryte som inneholder våt jord med høy tetthet.
    2. Hold de plantede frøene i et vekstkammer satt til 23 ° C med 16 timer lys og 8 timer mørk syklus med 150-170 μmol / m2s lysintensitet til diameteren av eufyllet når 0,5 cm.
    3. Overfør plantene til større potter og la dem vokse i samme kammer med de samme parametrene.
      MERK: Planter er klare for agroinfiltrering når deres største blader er 5-7 cm i diameter, vanligvis innen 4-5 uker. I mindre planter som er for unge, vil effekten av agroinfiltrering være for alvorlig for FRET-analysen.
  2. Forbered bakterieceller for agroinfiltrering.
    1. Dyrk hver Agrobacterium-koloni som inneholder FRET-konstruksjonene over natten i 5 ml LB-medium supplert med passende antibiotika (trinn 1.3.3) og 150 μM acetosyringon ved 28 ° C (se materialtabell).
    2. Sentrifuger cellene ved 3000 × g i 5 minutter ved romtemperatur.
    3. Resuspend cellene i agroinfiltreringsbuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 150 μM acetosyringone) til OD600 = 0,5.
    4. Kombiner de resuspenderte cellene i et 1:1 v/v-forhold mellom celler som inneholder de riktige konstruksjonene (trinn 2.2.5).
    5. For de dobbeltkonstruerte agroinfiltrasjonene, bland aliquotene fra to kulturer og, for enkeltkonstruksjon agroinfiltrasjoner, bland aliquotene i samme kultur:
      1. Testede proteiner: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (bakterier som har p35S::OTLD1-mRFP og p35S::LSH10-GFP konstruksjoner).
      2. Negativ kontroll: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (bakterier som inneholder p35S::OTLD1-mRFP og p35S::LSH4-GFP konstruksjoner).
      3. Negativ kontroll: LSH10-GFP + fri mRFP (bakterier som inneholder p35S::LSH10-GFP og pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 konstruksjoner).
      4. Positiv kontroll: mRFP-GFP (bakterier som har p35S::mRFP-GFP-konstruksjonen).
    6. Inkuber cellene ved 28 °C i 0,5-1 time.
  3. Utfør agroinfiltrasjon.
    1. Legg bakteriekulturen i en 1 ml nålefri sprøyte.
    2. Trykk forsiktig men bestemt sprøytens dyse mot den abaxiale siden av de fullt utvidede N. benthamiana-bladene mens du holder bladet med en hansket finger på adaxialsiden.
    3. Infiltrer opptil fire flekker på et blad, tre blader per plante, to eller tre planter for hver bakteriekultur. Bytt hansker mellom prøvene for å forhindre krysskontaminering.
    4. Oppretthold de agroinfiltrerte plantene i samme vekstkammer under de samme forholdene, som beskrevet i trinn 2.1.2, i 24 timer til 36 timer. Ikke hold de agroinfiltrerte plantene lenger enn 36 timer, da dette vil redusere fluorescenssignalet.

3. Konfokalmikroskopi

  1. Forbered mikroskop lysbilder for fluorescens visualisering.
    1. Etter 24-36 timer av infiltrasjonen, bruk et barberblad til å kutte hvert agroinfiltrert blad i små biter (2 mm x 4 mm) mellom venene.
    2. Plasser bladbitene på et glassglass med den abaxiale bladoverflaten vendt opp. Legg en dråpe vann på bladbitene og dekk dem med dekselglasset. Trykk litt på dekselglasset for å fjerne luftbobler.
    3. Slå på mikroskopet og laseren (se Materialtabell). Plasser lysbildet i mikroskopfaseholderen for avbildning under de spesifikke FRET-parametrene (trinn 3.2 og 3.3).
    4. Begynn observasjonene ved hjelp av en 10x objektivlinse for å identifisere celler som viser både GFP- og mRFP-signalene, og bruk deretter en 40x objektivlinse for påfølgende detaljerte observasjoner.
      MERK: Det er viktig at SE-FRET og AB-FRET vanligvis utføres på samme vevsprøve, slik at du kan bruke de samme kanalinnstillingene (trinn 3.2) bortsett fra FRET-kanalen, som er slått på / av for henholdsvis SE-FRET- og AB-FRET-observasjonene (trinn 3.2.2.3 og 3.3.1).
  2. Sett opp parameterne for SE-FRET (figur 1A).
    1. Åpne verktøyet Multi-Dimensional Acquisition (MDA).
    2. Etabler et sett med tre konfokale kanaler i samme synsfelt (supplerende figur 1).
      1. Still inn donorkanalen (GFP-kanalen) for eksitasjon og utslipp av donorfluorokrom med 405 nm eksitasjonslaser og 400-597 nm utslippsfilter.
      2. Still inn akseptorkanalen (mRFP-kanalen) for eksitasjon og utslipp av akseptorfluorokrom med 561 nm eksitasjonslaser og 400-597 nm utslippsfilter.
        MERK: Utslippsfilteret for mRFP ble satt til 400-597 nm for å skille mRFP-signalet fra FRET-signalet ved 597-617 nm (trinn 3.2.2.3) og derfor redusere FRET-uavhengig mRFP-utslipp.
      3. Still inn FRET-kanalen for eksitasjon av giveren og utslipp av akseptorfluorokromene med 405 nm eksitasjonslaser og 597-617 nm utslippsfilter.
    3. Sett donoreksitasjonsintensiteten på et minimumsnivå for å observere FRET samtidig som du unngår fotobleking, noe som reduserer SE-FRET-effektiviteten.
      MERK: Denne eksitasjonsintensiteten er eksperimentelt valgt før du utfører FRET-prosedyren for å unngå fotobleking. Det varierer avhengig av bladtykkelse, alder og tid etter overuttrykk.
    4. Begeistre donoren og skann etter celler som inneholder akseptorens forventede fluorescenssignal.
    5. Velg regionen som inneholder fluorescenssignalet av interesse.
    6. Skaff deg en SE-FRET-bildesekvens ved å trykke på Snap-knappen .
      1. Bilde 10-15 celler som uttrykker mRFP-GFP-konstruksjonen (positiv kontroll) først; juster fokus-, zoom- og smart forsterkningsparametere for å fokusere på interesseområdet som skal registreres (supplerende figur 2).
      2. Bruk de samme innstillingene, bilde 10-15 celler, som hver uttrykker OTLD1-mRFP, fri mRFP, LSH10-GFP eller LSH4-GFP separat.
        MERK: Disse bildene er anskaffet av "PixFRET" plug-in av ImageJ (se Materialtabell), som ble brukt til FRET-dataanalysene (trinn 3.4.1) for å bestemme spektralblødningsverdiene (SBT) for akseptorene og giverne; disse bildene brukes av programvaren til å generere SE-FRET-bildene for OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP og LSH10-GFP + gratis mRFP-proteinpar (trinn 3.2.6.3).
      3. Også, ved hjelp av de samme innstillingene, bilde 10-15 celler co-uttrykker OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP, og LSH10-GFP + gratis mRFP protein par.
  3. Sett opp parametere for AB-FRET (figur 1B).
    1. Bruk donor- og akseptorkanalparametrene som er angitt for SE-FRET (trinn 3.2.2), men slå av FRET-kanalen.
    2. Angi parametrene for fotobleking av akseptoren (mRFP) (supplerende figur 3).
      1. Sørg for at blekingen starter etter fem bilder. Tillat 200 iterasjoner for hvert område blekemiddel. Hold 100% laserintensitet ved 561 nm.
      2. Oppretthold en blekevarighet på 45 s. Sørg for en skannehastighet på 512 x 512 piksler ved 400 Hz.
    3. Tegn regionen av cellen som skal blekes; For eksempel, for nukleære interaksjoner, trekkes interesseområder rundt hele området av cellekjernen39.
    4. Aktiver bleking ved å trykke på Start eksperiment-knappen ; aktivering av denne funksjonen vil utføre fotoblekingen og skaffe AB-FRET-bildesekvensen.
  4. Analyser FRET-dataene.
    1. For å analysere SE-FRET-data, bruk plugin-modulen "PixFRET" for ImageJ-programvaren for å generere korrigerte bilder av SE-FRET-effektiviteten etter å ha trukket fra SBT40 (trinn 3.2.6.2).
    2. For å analysere AB-FRET-dataene, beregner% AB-FRET som prosentvis økning i GFP-utslipp etter mRFP-fotobleking ved å bruke følgende formel41: % AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, hvor GFPpost er GFP-utslipp etter mRFP-fotobleking, og GFPpre er GFP-utslipp før mRFP-fotobleking.
    3. Når du gjennomgår FRET-bildene, vær oppmerksom på den subcellulære lokaliseringen av FRET-signalet.
      MERK: I mange tilfeller kan disse cellulære rommene (f.eks. Kjerne, kloroplaster, ER, etc.) lett identifiseres og, som en ekstra fordel med FRET-teknikken, gi viktige ledetråder til den biologiske funksjonen til de samvirkende proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 illustrerer de typiske resultatene av et SE-FRET-eksperiment, der cellekjernene samtidig ble registrert i tre kanaler (dvs. donor GFP, akseptor mRFP og SE-FRET). Disse dataene ble brukt til å generere bilder av SE-FRET-effektivitet kodet i en pseudofargeskala. På denne skalaen tilsvarer overgangen fra blått til rødt en økning i FRET-effektiviteten, et mål på protein-protein nærhet fra 0% til 100%. I dette representative eksperimentet ble SE-FRET-signalet registrert i cellekjernen, og intensiteten etter koekspresjonen av LSH10 og OTLD1 var sammenlignbar med den som ble observert etter ekspresjonen av mRFP-GFP (dvs. positiv kontroll). Ingen SE-FRET ble observert i negative kontroller (dvs. koekspresjon av OTLD1-mRFP og LSH4-GFP eller fri mRFP og LSH10-GFP).

LSH10-OTLD1-interaksjonene ble kvantifisert ved bruk av AB-FRET. Til dette formål ble giverens GFP-fluorescens registrert i cellekjernen før og etter fotobleking av akseptoren mRFP som fotoblekingstidsserier av donor- og akseptorfluorescensmålinger (supplerende figur 4). Bildene av de registrerte cellekjernene ble presentert i pseudofarge for å kvantifisere endringen i GFP-fluorescens. Figur 3 viser at LSH10-GFP/OTLD1-mRFP-kouttrykket resulterte i økt GFP-donorfluorescens etter at mRFP-akseptoren ble fotobleket og mistet evnen til fluoresce. En tilsvarende økning i donorfluorescens ble observert i mRFP-GFP positiv kontroll, men ikke i de negative kontrollene av LSH4-GFP/OTLD1-mRFP eller LSH10-GFP/mRFP kouttrykk, mens akseptorfluorescensen ble inaktivert i alle fotoblekingseksperimenter. Figur 4 viser den kvantitative analysen av AB-FRET-dataene, som viser den statistisk signifikante økningen i donorfluorescensen (% AB-FRET) på ca. 13% etter å ha coexpressed LSH10 og OTLD1. Den positive mRFP-GFP-kontrollen ga %AB-FRET på ca. 30%, mens de negative kontrollene ikke ga %AB-FRET. Både SE-FRET- og AB-FRET-bilder viste FRET-signalet i cellekjernen, i samsvar med den subcellulære lokaliseringen som forventes for transkripsjonsfaktor-histon-modifiserende enzymkomplekser, samt for nukleocytoplasmatisk natur av GFP / mRFP-proteinene34 (figur 2 og figur 3).

Oppsummert viser de representative dataene at denne FRET-protokollen kan brukes til å demonstrere og kvantifisere interaksjoner mellom histonmodifiserende enzymer og transkripsjonsfaktorer og bestemme deres subcellulære lokalisering i levende planteceller.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk sammendrag av SE-FRET- og AB-FRET-teknikkene . (A) Det grunnleggende prinsippet i SE-FRET. Et av de testede proteinene er merket med GFP, som fungerer som donorfluorokrom, og det andre med mRFP, som fungerer som en akseptorfluorokrom. Donormolekylet er begeistret, og akseptorutslippet registreres. Hvis de testede proteinene interagerer med hverandre slik at de er plassert innenfor 10 nm fra hverandre, overføres energien fra den eksiterte giveren ikke-radiativt til akseptoren, som deretter blir begeistret og avgir fluorescens i FRET-utslippskanalen. Hvis ingen interaksjon oppstår, overføres ingen energi fra giveren til akseptoren, og ingen FRET-utslipp av akseptoren oppdages. (B) Det grunnleggende prinsippet om AB-FRET. De testede proteinene er merket som beskrevet i (A) for SE-FRET. Donormolekylet er begeistret, og hvis samspillet mellom de testede proteinene oppstår, begeistrer giveren akseptoren på en ikke-radiativ måte, noe som resulterer i FRET. Deretter inaktiveres akseptoren permanent ved fotobleking, og mister dermed evnen til å akseptere ikke-strålingsenergi fra giveren og avgir FRET-fluorescensen i FRET-utslippskanalen; Fluorescensen som sendes ut av giveren, økes derimot fordi giveren mister mindre energi ved ikke-strålingsoverføringen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Spesifikk interaksjon mellom LSH10 og OTLD1 i N. benthamiana-blader oppdaget av SE-FRET. Bilder fra tre deteksjonskanaler (donor, akseptor og SE-FRET) vises for de angitte proteinkombinasjonene. SE-FRET-effektivitetsbildene ble beregnet ved subtraksjon av spektral gjennomblødning (SBT) og er vist i pseudofarge, med fargene rød og blå som betyr henholdsvis høyeste og laveste signal. (A) Høyt SE-FRET effektivitetssignal produsert av mRFP-GFP positiv kontroll. (B) Positivt SE-FRET effektivitetssignal produsert av de samvirkende LSH10-GFP- og OTLD1-mRFP-proteinene. (C) Kopresjon av det negative kontrollproteinet LSH4-GFP og OTLD1-mRFP ga ikke noe SE-FRET effektivitetssignal. (D) Koekspresjon av det negative kontrollfrie mRFP-proteinet og LSH10-GFP ga ikke noe SE-FRET effektivitetssignal. Skala barer = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Spesifikk interaksjon mellom LSH10 og OTLD1 i N. benthamiana-blader påvist av AB-FRET. Bilder fra to deteksjonskanaler (donor og akseptor) før og etter fotobleking vises for de angitte proteinkombinasjonene. Sirkelen indikerer den fotoblekede regionen. AB-FRET, visualisert som en økning i GFP-fluorescens etter mRFP-fotobleking, vises ved hjelp av pseudofarge med fargene rød og blå, som betyr henholdsvis høyeste og laveste signal. (A) En økning i GFP-donorfluorescensen produsert av mRFP-GFP-positiv kontroll. (B) En økning i GFP-donorfluorescensen produsert av de samvirkende LSH10-GFP- og OTLD1-mRFP-proteinene. (C) Kopresjon av det negative kontrollproteinet LSH4-GFP og OTLD1-mRFP ga ubetydelige endringer i GFP-donorfluorescens. (D) Koekspresjon av det negative kontrollfrie mRFP-proteinet og LSH10-GFP ga ubetydelige endringer i GFP-donorfluorescens. Skala barer = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: En kvantifisering av AB-FRET. Den prosentvise økningen i GFP-donorfluorescens etter mRFP-fotobleking (% AB-FRET) er vist for de angitte proteinkombinasjonene. Feilfelt representerer gjennomsnittet for n = 13 celler for hver måling. Den tosidige t-testen fastslo at forskjeller mellom gjennomsnittsverdier er statistisk signifikante for p-verdiene *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001; s≥ 0,05 er ikke statistisk signifikante (ns). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Primer navn Sekvens (5 til 3 ¹) Hensikt
OTLD1 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatgactcggattttggttcaaag Forsterk OTLD1 fra cDNA
OTLD1 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgttccgtgtggctttgcctttgcgtc Forsterk OTLD1 fra cDNA
LSH10 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatgtcctccaagagaaagagg Forsterk LSH10 fra cDNA
LSH10 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgatgtcaacagagactaaagaaac Forsterk LSH10 fra cDNA
LSH4 Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggatcatatcatcggctttatg Forsterk LSH4 fra cDNA
LSH4 Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgattagggctacttgaaatcgcc Forsterk LSH4 fra cDNA
mRFP Fw ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctcaatggcctcctccgaggacgt Forsterk mRFP fra pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
mRFP Rv ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgttggagatctgcggccgcgg Forsterk mRFP fra pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1
AttL1 tcgcgttaacgctagcatggatctc Bekreft sekvenser i pDONR207 ved PCR og DNA-sekvensering
AttL2 GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC Bekreft sekvenser i pDONR207 ved PCR og DNA-sekvensering
AttB1 Fw ggggacaagtttgtac aaaaaagcaggct Bekreft sekvenser i destinasjonsvektorer ved PCR og DNA-sekvensering
AttB2 Rv ggggaccactttgta caagaaagctgggt Bekreft sekvenser i destinasjonsvektorer ved PCR og DNA-sekvensering
35S Arrangør Fw CTATCCTTCGCAAGACCCTTC Bekreft sekvenser i destinasjonsvektorer ved hjelp av PCR

Tabell 1: Primere for kloning og bekreftelse av de klonede sekvensene i pDONOR207 og destinasjonsvektorer. Fw, fremover primere; Rv, omvendt primere.

Supplerende figur 1: Angi parametere for konfokale kanaler. (A) Skjermbilde for oppsett av eksitasjons- og utslippsparameter for donorkanalen (GFP). (B) Skjermbilde for oppsett av eksitasjons- og utslippsparameter for akseptorkanalen (mRFP). (C) Skjermbilde for oppsett av eksitasjons- og utslippsparameter for FRET-kanalen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Justering av parametere for innsamling av SE-FRET-bilder av utvalget av interesse. (A) Skjermbilde for oppsettet av skanneområdet (dvs. bildestørrelse, skannehastighet, retning og gjennomsnitt). (B) Skjermbilde for oppsettet av GFP-kanalparameteren (dvs. laser, pinhole, master gain og digital gain). (C) Skjermbilde for oppsettet av mRFP-kanalparameteren (dvs. laser, pinhole, master gain og digital gain). (D) Skjermbilde for oppsettet av FRET-kanalparameteren (dvs. laser, pinhole, master gain og digital gain). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 3: Angi parametere for akseptorfotobleking. (A) Skjermbilde for oppsettet av skanneområdet (dvs. bildestørrelse, skannehastighet, retning og gjennomsnitt). (B) Skjermbilde for oppsett av tidsserier og tidsblekingsparametere. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 4: Tidsserier for donor- og akseptorfluorescensmålinger under AP-FRET. Kinetikken til akseptoren (mRFP) og donor (GFP) fluorescensen ble bestemt for de angitte prøvene før, under og etter fotoblekingsperioden. (A) Positiv mRFP-GFP-kontroll. (B) LSH10-GFP + OTLD1-mRFP. (C) Negativ LSH4-GFP + OTLD1-mRFP-kontroll. (D) Negativ LSH10-GFP + Gratis mRFP-kontroll. Gule linjer angir tidsperioden for fotobleking. Hvite kurver plotter målingene av fluorescenskinetikken. I hvert panel viser de øvre og nedre bildene kinetikken til henholdsvis akseptoren (mRFP) og donorfluorescensen (GFP). Merk at GFP-fluorescensen naturlig avtar over tid fordi laseren gradvis fotobleaches selve GFP. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne FRET-protokollen er enkel og lett å reprodusere; Det krever også minimal forsyningsinvestering og bruker standardutstyr for mange moderne laboratorier. Spesielt skiller fem hovedtekniske funksjoner allsidigheten til denne prosedyren. For det første genereres FRET-konstruksjonene ved hjelp av stedsspesifikk rekombinasjon, en kloningsmetode som er enkel å bruke, gir nøyaktige resultater og sparer tid sammenlignet med tradisjonell restriksjonsenzymbasert kloning. For det andre er N. benthamiana-planter enkle å dyrke, produserer relativt store mengder vev og er tilgjengelige i de fleste laboratorier. For det tredje resulterer agroinfiltrering i forbigående ekspresjon av de leverte konstruksjonene og genererer dermed data innen relativt kort tid (dvs. 24-36 timer) sammenlignet med månedene som kreves for å produsere transgene planter. For det fjerde tillater evnen til å levere forskjellige kombinasjoner av konstruksjonene av interesse ved co-agroinfiltrering testing av interaksjoner mellom alle proteiner. Til slutt kan både SE-FRET og AB-FRET utføres sekvensielt på samme vevsprøve bare ved å slå på / av en av laserkanalinnstillingene. Det skal imidlertid bemerkes at mikrobombardmentslevering42 kan brukes som en alternativ tilnærming for konstruksjonslevering i plantevevet i stedet for agroinfiltrering; I dette tilfellet er bruk av binære vektorer som kreves for agroinfiltrering unødvendig.

Et kritisk trinn i denne protokollen er riktig valg av donor- og akseptorfluorokrompar for å optimalisere FRET-effektiviteten. Følgende tre faktorer bør vurderes: (1) donorutslippsspekteret må maksimalt overlappe akseptorabsorpsjonsspekteret for å maksimere mengden overført energi; (2) donorens og akseptorens utslippsspektra må være tilstrekkelig forskjellige til å skille seg fra hverandre og for å minimere SBT av signalet oppdaget ved mikroskopi; (3) Akseptoren skal ha minimal direkte eksitasjon ved donorens absorbansmaksimum for å minimere eksitasjon av akseptoren under eksitasjon av giveren. Vanlige donor/akseptor FRET-par som brukes er cyan/gule og grønne/røde fluorescerende proteiner (dvs. henholdsvis CFP/YFP og GFP/mRFP). Denne protokollen bruker GFP / mRFP-paret fordi det er egnet for levende celleavbildning og, i motsetning til cyan / gule FRET-parene, utviser lav fototoksisitet og lav fotobleking43. Praktisk fungerer translasjonsfusjonen mellom FRET-paret (dvs. mRFP-GFP) som en ideell FRET-positiv kontroll.

Et annet kritisk skritt er valg av passende negative kontroller. For eksempel, når det gjelder LSH10-OTLD1-interaksjonen, må FRET-analysen alltid inkludere ekspresjonen av OTLD1 alene, LSH10 alene og koekspresjon av OTLD1 og LSH10 med proteiner der interaksjonen ikke forventes (dvs. LSH4 og fri mRFP, henholdsvis). Når det gjelder de negative kontrollenes valg, kan FRET-eksperimenter følge retningslinjene for beste praksis for bruk av BiFC-teknikken44, en annen fluorescensavbildningsbasert tilnærming tilpasset påvisning av proteininteraksjoner i levende planteceller 29,30,31,32.

Endelig er en faktor som påvirker FRET-eksperimentet felles for alle eksperimenter i levende plantevev, og det stammer fra de varierende fysiologiske forholdene til planten generelt, og de agroinfiltrerte transformerte cellene, spesielt, selv når de opprettholdes under kontrollerte vekstforhold. Denne fysiologiske variasjonen kan bidra til en viss variasjon av FRET-dataene mellom individuelle eksperimenter, planter og til og med blader. Det er derfor viktig å bruke minst to planter og tre blader per plante for hvert eksperiment og å velge modne, fullt utvidede blader for agroinfiltrering, da de gir bedre bilder.

Som med alle eksperimentelle metoder har FRET sine tekniske og bruksbaserte begrensninger. En slik begrensende faktor er arten av den autofluorescerende taggen og dens plassering i proteinet av interesse (f.eks. Ved amino- eller karboksyl-terminalen), som kan forstyrre de biologiske egenskapene til dette proteinet, for eksempel dets opprinnelige mønster av subcellulær lokalisering eller evnen til å gjenkjenne dets naturlige interaksjoner. Før merking må hvert protein av interesse analyseres, i den grad det er mulig, for dets strukturelle egenskaper som kan bli kompromittert av merking. I mange tilfeller må imidlertid merkingsparametrene bestemmes empirisk basert på de kjente aktivitetene til proteinet av interesse. En annen stor begrensning er den relative tekniske raffinement av FRET, som krever bruk av konfokalmikroskopi med riktig maskinvare og programvare. I motsetning til flere andre proteininteraksjonsmetoder, for eksempel gjær-to-hybridsystemet (Y2H) 45,46,47, er FRET uegnet til å identifisere proteininteraksjoner ved å screene ekspresjonsbiblioteker, spesielt skjermer med høy gjennomstrømning 48. I tillegg, som de fleste analyser utført in vivo, er FRET ikke et biokjemisk rent system, og dermed oppdager det ikke potensiell involvering av andre ukjente cellulære faktorer i interaksjonen.

Betydningen av FRET med hensyn til andre analyser av proteininteraksjoner ligger i påvisning av kortdistanseinteraksjoner, noe som reduserer sjansene for falske positive resultater, anvendelighet for distribusjon in vivo i en rekke celler, vev og organismer (inkludert planter) og påvisning av subcellulær lokalisering av de samvirkende proteiner. Mange av disse egenskapene til FRET finnes i andre in vivo tilnærminger, for eksempel split-luciferase 49,50 eller BiFC29,30,31,32,33, blant hvilke BiFC kanskje er den mest brukte. En annen mye brukt interaksjonsanalyse er Y2H45,46,47; Men utenfor gjærbiologiforskning bruker denne analysen et heterologt eksperimentelt system, utsatt for falske positiver, og funnene krever bekreftelse av en annen teknikk. En konseptuell variasjon av Y2H er en split-ubiquitin-analyse som er bedre egnet for å oppdage interaksjoner mellom membranproteiner51,52 og som viser begrensninger i forhold til FRET som ligner på Y2H. Endelig kan proteininteraksjoner detekteres ved co-immunoprecipitation (co-IP), som gjelder deteksjon i et komplekst miljø av celleekstrakter, så vel som i nøyaktig definerte in vitro-reaksjoner 53,54,55; Etter vår erfaring er co-IP mest nyttig som en alternativ og uavhengig metode for å bekrefte data oppnådd ved hjelp av fluorescensbaserte in vivo-tilnærminger.

Mens denne spesifikke FRET-protokollen ble utviklet for å studere samspillet mellom plantetranskripsjonsfaktorer og histonmodifiserende enzymer, kan den brukes til å oppdage og karakterisere interaksjoner mellom mange andre klasser av proteiner inplanta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter ble oppgitt.

Acknowledgments

Arbeidet i V.C.s laboratorium støttes av tilskudd fra NIH (R35GM144059 og R01GM50224), NSF (MCB1913165 og IOS1758046), og BARD (IS-5276-20) til V.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) Sigma-Aldrich #D134406-1G
Bacto Agar BD Biosciences #214010
Bacto trypton BD Biosciences #211705
Bacto yeast extract BD Biosciences #212750 
Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM900 Any CLSM with similar capabilities is suitable
EHA105 VWR 104013-310 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
Gateway BP Clonase II  Invitrogen #11789100
Gateway LR Clonase II Invitrogen #11791020
GV3101 VWR 104013-296 We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection
ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
MES Sigma-Aldrich #69889-10G
MgCl2 Sigma-Aldrich #63068-250G
NaCl Sigma-Aldrich #S5886-500G
Nicotiana benthamiana seeds Herbalistics Pty RA4 or LAB We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection
pDONR207 Invitrogen #12213013
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1  N/A Refs. 15, 28
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28)
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1  N/A Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct
Rifampicin Sigma-Aldrich #R7382-5G
Spectinomycin Sigma-Aldrich #S4014-5G
Syringes without needles BD 309659
Zen software for CLSM imaging Zeiss ZEN 3.0 version The software should be compatible with the CLSM used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274 (2018).
  2. Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes and their emerging role in plant biology. Frontiers in Plant Science. 5, 56 (2014).
  3. Feng, J., Shen, W. H. Dynamic regulation and function of histone monoubiquitination in plants. Frontiers in Plant Science. 5, 83 (2014).
  4. Keren, I., Citovsky, V. Activation of gene expression by histone deubiquitinase OTLD1. Epigenetics. 12 (7), 584-590 (2017).
  5. Keren, I., Citovsky, V. The histone deubiquitinase OTLD1 targets euchromatin to regulate plant growth. Science Signaling. 9 (459), 125 (2016).
  6. Krichevsky, A., Lacroix, B., Zaltsman, A., Citovsky, V. Involvement of KDM1C histone demethylase-OTLD1 otubain-like histone deubiquitinase complexes in plant gene repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (27), 11157-11162 (2011).
  7. Keren, I., Lapidot, M., Citovsky, V. Coordinate activation of a target gene by KDM1C histone demethylase and OTLD1 histone deubiquitinase in Arabidopsis. Epigenetics. 14 (6), 602-610 (2019).
  8. Kim, S. Y., Michaels, S. D. SUPPRESSOR OF FRI 4 encodes a nuclear-localized protein that is required for delayed flowering in winter-annual Arabidopsis. Development. 133 (23), 4699-4707 (2006).
  9. Kim, S., Choi, K., Park, C., Hwang, H. J., Lee, I. SUPPRESSOR OF FRIGIDA4, encoding a C2H2-type zinc finger protein, represses flowering by transcriptional activation of Arabidopsis FLOWERING LOCUS C. The Plant Cell. 18 (11), 2985-2998 (2006).
  10. Sridhar, V. V., Surendrarao, A., Gonzalez, D., Conlan, R. S., Liu, Z. Transcriptional repression of target genes by LEUNIG and SEUSS, two interacting regulatory proteins for Arabidopsis flower development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (31), 11494-11499 (2004).
  11. Ning, Y. Q., et al. Two novel NAC transcription factors regulate gene expression and flowering time by associating with the histone demethylase JMJ14. Nucleic Acids Research. 43 (3), 1469-1484 (2015).
  12. Hecker, A., et al. The Arabidopsis GAGA-binding factor BASIC PENTACYSTEINE6 recruits the POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 component LIKE HETEROCHROMATIN PROTEIN1 to GAGA DNA motifs. Plant Physiology. 168 (3), 1013-1024 (2015).
  13. Xiao, J., et al. Cis and trans determinants of epigenetic silencing by Polycomb repressive complex 2 in Arabidopsis. Nature Genetics. 49 (10), 1546-1552 (2017).
  14. Yuan, W., et al. A cis cold memory element and a trans epigenome reader mediate Polycomb silencing of FLC by vernalization in Arabidopsis. Nature Genetics. 48 (12), 1527-1534 (2016).
  15. Phan, M. S. V., Keren, I., Tran, P. T., Lapidot, M., Citovsky, V. Arabidopsis LSH10 transcription factor interacts with the co-repressor histone deubiquitinase OTLD1 to recruit it to the target promoters. bioRxiv. , (2022).
  16. Zhao, L., et al. Overexpression of LSH1, a member of an uncharacterised gene family, causes enhanced light regulation of seedling development. The Plant Journal. 37 (5), 694-706 (2004).
  17. Lei, Y., Su, S., He, L., Hu, X., Luo, D. A member of the ALOG gene family has a novel role in regulating nodulation in Lotus japonicus. Journal of Integrative Plant Biology. 61 (4), 463-477 (2019).
  18. MacAlister, C. A., et al. Synchronization of the flowering transition by the tomato TERMINATING FLOWER gene. Nature Genetics. 44 (12), 1393-1398 (2012).
  19. Takeda, S., et al. CUP-SHAPED COTYLEDON1 transcription factor activates the expression of LSH4 and LSH3, two members of the ALOG gene family, in shoot organ boundary cells. The Plant Journal. 66 (6), 1066-1077 (2011).
  20. Yan, D., et al. BEAK-SHAPED GRAIN 1/TRIANGULAR HULL 1, a DUF640 gene, is associated with grain shape, size and weight in rice. Science China Life Sciences. 56 (3), 275-283 (2013).
  21. Yoshida, A., et al. TAWAWA1, a regulator of rice inflorescence architecture, functions through the suppression of meristem phase transition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (2), 767-772 (2013).
  22. Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W., Hirano, H. Y. The homeotic gene long sterile lemma (G1) specifies sterile lemma identity in the rice spikelet. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (47), 20103-20108 (2009).
  23. Iyer, L. M., Aravind, L. ALOG domains: provenance of plant homeotic and developmental regulators from the DNA-binding domain of a novel class of DIRS1-type retroposons. Biology Direct. 7, 39 (2012).
  24. Peng, P., et al. The rice TRIANGULAR HULL1 protein acts as a transcriptional repressor in regulating lateral development of spikelet. Scientific Reports. 7 (1), 13712 (2017).
  25. Day, R. N., Periasamy, A., Schaufele, F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus. Methods. 25 (1), 4-18 (2001).
  26. Qian, J., Yao, B., Wu, C. Fluorescence resonance energy transfer detection methods: Sensitized emission and acceptor bleaching. Experimental and Therapeutic. 8 (5), 1375-1380 (2014).
  27. Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (12), 7877-7882 (2004).
  28. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Molecular Biology. 57 (4), 503-516 (2005).
  29. Bracha-Drori, K., et al. Detection of protein-protein interactions in plants using bimolecular fluorescence complementation. The Plant Journal. 40 (3), 419-427 (2004).
  30. Citovsky, V., Gafni, Y., Tzfira, T. Localizing protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation in planta. Methods. 45 (3), 196-206 (2008).
  31. Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. Journal of Molecular Biology. 362 (5), 1120-1131 (2006).
  32. Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein Interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiology. 145 (4), 1090-1099 (2007).
  33. Gookin, T. E., Assmann, S. M. Significant reduction of BiFC non-specific assembly facilitates in planta assessment of heterotrimeric G-protein interactors. The Plant Journal. 80 (3), 553-567 (2014).
  34. Tran, P. T., Citovsky, V. Receptor-like kinase BAM1 facilitates early movement of the Tobacco mosaic virus. Communications Biology. 4 (1), 511 (2021).
  35. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods in Enzymology. 328, 575-592 (2000).
  36. Ashwini, M., Murugan, S. B., Balamurugan, S., Sathishkumar, R. Advances in molecular cloning. Molecular Biology. 50 (1), 1-6 (2016).
  37. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 219-235 (1997).
  38. Wise, A. A., Liu, Z., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods in Molecular Biology. 343, 67-76 (2006).
  39. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. The Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  40. Feige, J. N., Sage, D., Wahli, W., Desvergne, B., Gelman, L. PixFRET, an ImageJ plug-in for FRET calculation that can accommodate variations in spectral bleed-throughs. Microscopy Research & Technique. 68 (1), 51-58 (2005).
  41. Bal, M., Zhang, J., Hernandez, C. C., Zaika, O., Shapiro, M. S. Ca2+/calmodulin disrupts AKAP79/150 interactions with KCNQ (M-Type) K+ channels. Journal of Neuroscience. 30 (6), 2311-2323 (2010).
  42. Taylor, N. J., Fauquet, C. M. Microparticle bombardment as a tool in plant science and agricultural biotechnology. DNA and Cell Biology. 21 (12), 963-977 (2002).
  43. Broussard, J. A., Green, K. J. Research techniques made simple: methodology and applications of Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy. Journal of Investigative Dermatology. 137 (11), 185-191 (2017).
  44. Kudla, J., Bock, R. Lighting the way to protein-protein interactions: recommendations on best practices for bimolecular fluorescence complementation analyses. The Plant Cell. 28 (5), 1002-1008 (2016).
  45. Bartel, P., Chien, C. T., Sternglanz, R., Fields, S. Cellular Interactions in Development: A Practical Approach. Hartley, D. A. , IRL Press. 153-179 (1993).
  46. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  47. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiological Reviews. 59 (1), 94-123 (1995).
  48. Fields, S. High-throughput two-hybrid analysis. The promise and the peril. The FEBS Journal. 272 (21), 5391-5399 (2005).
  49. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  50. Wang, L., Yu, G., Macho, A. P., Lozano-Durán, R. Split-luciferase complementation imaging assay to study protein-protein interactions in Nicotiana benthamiana. Bio-protocol. 11 (23), 4237 (2021).
  51. Grefen, C., Lalonde, S., Obrdlik, P. Split-ubiquitin system for identifying protein-protein interactions in membrane and full-length proteins. Current Protocols in Neuroscience. 41 (1), 5-27 (2007).
  52. Thaminy, S., Miller, J., Stagljar, I. The split-ubiquitin membrane-based yeast two-hybrid system. Methods in Molecular Biology. 261, 297-312 (2004).
  53. Lin, J. S., Lai, E. M. Protein-protein interactions: co-immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 1615, 211-219 (2017).
  54. Jiang, Z., Yang, M., Cao, Q., Zhang, Y., Li, D. A powerful method for studying protein-protein interactions in plants: coimmunoprecipitation (co-IP) assay. Methods in Molecular Biology. 2400, 87-92 (2022).
  55. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Science Signaling. 4 (195), (2011).

Tags

Biologi utgave 188 Histonmodifiserende enzymer (HME) transkripsjonsfaktorer (TFs) protein-protein-interaksjoner FRET
Undersøke interaksjoner mellom histonmodifiserende enzymer og transkripsjonsfaktorer <em>in vivo</em> ved fluorescensresonansenergioverføring
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vo Phan, M. S., Tran, P. T.,… More

Vo Phan, M. S., Tran, P. T., Citovsky, V. Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer. J. Vis. Exp. (188), e64656, doi:10.3791/64656 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter