Floresan rezonans enerji transferi (FRET), canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Burada, histon modifiye edici enzimlerin, bitki dokularındaki gen ekspresyonunun epigenetik düzenlenmesi için hedef promotörlere onları işe alan transkripsiyon faktörleri ile ilişkisini incelemek için bir FRET protokolü sunulmaktadır.
Gen ekspresyonunun epigenetik regülasyonu, transkripsiyonel baskı veya aktivasyon için sırasıyla heterokromatik veya ekromatik histon işaretleri üreten histon modifiye edici enzimlerden (HME’ler) sıklıkla etkilenir. HME’ler, transkripsiyon faktörleri (TF’ler) tarafından hedef kromatinlerine alınır. Bu nedenle, HME’ler ve TF’ler arasındaki doğrudan etkileşimleri tespit etmek ve karakterize etmek, işlevlerini ve özgüllüklerini daha iyi anlamak için kritik öneme sahiptir. Bu çalışmalar, canlı dokular içinde in vivo olarak gerçekleştirilirse biyolojik olarak daha alakalı olacaktır. Burada, bir bitki histon deubikitinaz ile bir bitki transkripsiyon faktörü arasındaki etkileşimleri, birbirinden <10 nm uzaklıktaki protein molekülleri arasındaki komplekslerin tespit edilmesini sağlayan floresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanarak görselleştirmek için bir protokol açıklanmaktadır. FRET tekniğinin iki varyasyonu sunulmaktadır: SE-FRET (duyarlılaştırılmış emisyon) ve AB-FRET (alıcı ağartma), burada enerji donörden alıcıya radyal olmayan bir şekilde aktarılır veya alıcının fotobeyazlatılması üzerine donör tarafından ışınımsal olarak yayılır. Hem SE-FRET hem de AB-FRET yaklaşımları, muzdaki diğer proteinler arasındaki diğer etkileşimleri keşfetmek için kolayca uyarlanabilir.
Bitki histon deubikitinazları, histonların post-translasyonel modifikasyonuyla, özellikle monoubikitilasyon işaretlerini silerek gen ekspresyonunu kontrol etmede önemli bir rol oynar1. Şimdiye kadar, OTLD1, Arabidopsis 2,3’te moleküler düzeyde karakterize edilen birkaç bitki histon deubikitinazından biridir. OTLD1, monoubikitin gruplarını H2B histon moleküllerinden uzaklaştırır, böylece hedef gen kromatin 4,5’teki H3 histonlarının ekromatik asetilasyon ve metilasyon modifikasyonlarının çıkarılmasını veya eklenmesini teşvik eder. Ayrıca, OTLD1, hedef genlerin transkripsiyonel baskılanmasını etkilemek için başka bir kromatin modifiye edici enzim olan histon lizin demetilaz KDM1C ile etkileşime girer 6,7.
Çoğu histon modifiye edici enzim DNA bağlanma yeteneklerinden yoksundur ve bu nedenle hedef genlerini doğrudan tanıyamazlar. Bir olasılık, bu enzimleri bağlayan ve onları kromatin hedeflerine yönlendiren DNA bağlayıcı transkripsiyon faktörü proteinleriyle işbirliği yapmalarıdır. Spesifik olarak, bitkilerde, birkaç ana histon modifiye edici enzimin (yani, histon metiltransferazlar8,9, histon asetiltransferazlar 10, histon demetilatazlar 11 ve Polycomb baskılayıcı kompleksleri12,13,14) transkripsiyon faktörleri tarafından işe alındığı bilinmektedir. Bu fikirle tutarlı olarak, son zamanlarda, OTLD1’in hedef promotörlere işe alınması için OTLD1’in bir transkripsiyon faktörü LSH1015 ile spesifik protein-protein etkileşimlerine dayanan olası bir mekanizma önerilmiştir.
LSH10, merkezi gelişimsel düzenleyiciler 16,17,18,19,20,21,22 olarak işlev gören bitki ALOG (Arabidopsis LSH1 ve Oryza G1) proteinlerinin bir ailesine aittir. ALOG protein ailesinin üyelerinin DNA bağlayıcı motifler23 içermesi ve transkripsiyonel düzenleme22, nükleer lokalizasyon 19 ve homodimerizasyon24 kapasitelerini sergilemesi,LSH10 da dahil olmak üzere bu proteinlerin transkripsiyonun epigenetik düzenlenmesi sırasında spesifik transkripsiyon faktörleri olarak hareket edebileceği fikrine daha fazla destek vermektedir. LSH10-OTLD1 etkileşimini in vivo olarak karakterize etmek için kullanılan ana deneysel tekniklerden biri floresan rezonans enerji transferidir (FRET)15.
FRET, canlı hücrelerin içinde birbirlerinden25 <10 nm içindeki proteinler arasındaki yakın mesafeli etkileşimleri doğrudan tespit etmek için kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. FRET yaklaşım26’nın iki ana varyasyonu vardır: duyarlılaştırılmış emisyon (SE-FRET) (Şekil 1A) ve alıcı beyazlatma (AB-FRET) (Şekil 1B). SE-FRET’te, biri donör florokrom (örneğin, yeşil floresan proteini, GFP) ve diğeri alıcı florokrom (örneğin, monomerik kırmızı floresan protein, mRFP27,28) ile etiketlenmiş olan etkileşimli proteinler, uyarılmış durum enerjisini radyal olmayan bir şekilde donörden alıcıya aktarır. Bu aktarım sırasında hiçbir foton yayılmadığından, alıcınınkine benzer bir ışınımsal emisyon spektrumuna sahip bir floresan sinyali üretilir. AB-FRET’te, protein etkileşimleri, alıcı fotobeyazlatma ile kalıcı olarak inaktive edildiğinde ve bu nedenle donörden aktarılan ışınımsal olmayan enerjiyi alamadığında donörün yüksek radyasyon emisyonuna dayanarak tespit edilir ve ölçülür (Şekil 1). Önemli olarak, FRET floresansının hücre altı konumu, hücredeki etkileşimli proteinlerin lokalizasyonunun göstergesidir.
FRET’yi canlı dokulara yerleştirme ve etkileşen proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu belirleme yeteneği, bu etkileşimi kendi başına tespit etmekle aynı anda FRET’yi çalışmalar ve protein-protein etkileşimlerinin in vivo olarak ilk karakterizasyonu için tercih edilen teknik haline getirmektedir. Karşılaştırılabilir bir in vivo floresan görüntüleme metodolojisi olan bimoleküler floresan tamamlama (BiFC)29,30,31,32, iyi bir alternatif yaklaşımdır, ancak FRET’in aksine, BiFC, otofloresan BiFC muhabirlerinin spontan montajı nedeniyle yanlış pozitifler üretebilir 33 ve verilerinin nicelleştirilmesi daha az hassastır.
Bu makale, hem SE-FRET hem de AB-FRET tekniklerinin uygulanmasındaki başarılı deneyimi paylaşmakta ve bitki hücrelerinde OTLD1 ve LSH10 arasındaki etkileşimleri araştırmak için konuşlandırılmaları için bir protokol sunmaktadır.
Bu FRET protokolü basit ve yeniden üretilmesi kolaydır; aynı zamanda minimum tedarik yatırımı gerektirir ve birçok modern laboratuvar için standart ekipman kullanır. Spesifik olarak, beş ana teknik özellik bu prosedürün çok yönlülüğünü ayırt eder. İlk olarak, FRET yapıları, kullanımı kolay, doğru sonuçlar üreten ve geleneksel kısıtlama enzimi tabanlı klonlamaya kıyasla zamandan tasarruf sağlayan bir klonlama yaklaşımı olan bölgeye özgü rekombinasyon kullanılarak oluşturulur. İk…
The authors have nothing to disclose.
V.C.’nin laboratuvarındaki çalışmalar, NIH (R35GM144059 ve R01GM50224), NSF (MCB1913165 ve IOS1758046) ve BARD’dan (IS-5276-20) V.C.’ye verilen hibelerle desteklenmektedir.
Acetosyringone (3′,5′-Dimethoxy-4′-hydroxyacetophenone) | Sigma-Aldrich | #D134406-1G | |
Bacto Agar | BD Biosciences | #214010 | |
Bacto trypton | BD Biosciences | #211705 | |
Bacto yeast extract | BD Biosciences | #212750 | |
Confocal laser scanning microscope (CLSM) | Zeiss | LSM900 | Any CLSM with similar capabilities is suitable |
EHA105 | VWR | 104013-310 | We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection |
Gateway BP Clonase II | Invitrogen | #11789100 | |
Gateway LR Clonase II | Invitrogen | #11791020 | |
GV3101 | VWR | 104013-296 | We use the stock in the Citovsky bacterial lab stock collection |
ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
MES | Sigma-Aldrich | #69889-10G | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | #63068-250G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | #S5886-500G | |
Nicotiana benthamiana seeds | Herbalistics Pty | RA4 or LAB | We use the stock in the Citovsky seed lab stock collection |
pDONR207 | Invitrogen | #12213013 | |
pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 | N/A | Refs. 15, 28 | |
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 | N/A | Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (see refs. 15, 28) | |
pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 | N/A | Generated based on the pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct | |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | #R7382-5G | |
Spectinomycin | Sigma-Aldrich | #S4014-5G | |
Syringes without needles | BD | 309659 | |
Zen software for CLSM imaging | Zeiss | ZEN 3.0 version | The software should be compatible with the CLSM used |