Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Mekano-node-pore-sensor: En hurtig, etiketfri platform til multi-parameter enkeltcelle viskoelastiske målinger

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64665
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1,3, 1,2
1Graduate Program in Bioengineering, University of California, Berkeley and University of California, San Francisco, 2Department of Mechanical Engineering, University of California, Berkeley, 3Department of Electrical Engineering and Computer Sciences, University of California, Berkeley
* These authors contributed equally

Summary

Præsenteret her er en metode til mekanisk fænotype enkeltceller ved hjælp af en elektronikbaseret mikrofluidisk platform kaldet mekano-node-pore-sensing (mechano-NPS). Denne platform opretholder moderat gennemstrømning på 1-10 celler / s, mens den måler både cellernes elastiske og viskøse biofysiske egenskaber.

Abstract

Cellulære mekaniske egenskaber er involveret i en lang række biologiske processer og sygdomme, lige fra stamcelledifferentiering til kræftmetastase. Konventionelle metoder til måling af disse egenskaber, såsom atomkraftmikroskopi (AFM) og mikropipetteaspiration (MA), fanger rig information, der afspejler en celles fulde viskoelastiske respons; Disse metoder er dog begrænset af meget lav gennemstrømning. Tilgange med høj kapacitet, såsom realtidsdeformerbarhedscytometri (RT-DC), kan kun måle begrænset mekanisk information, da de ofte er begrænset til enkeltparameterudlæsninger, der kun afspejler en celles elastiske egenskaber. I modsætning til disse metoder er mekano-node-pore-sensing (mechano-NPS) en fleksibel, etiketfri mikrofluidisk platform, der bygger bro over kløften for at opnå multiparameter viskoelastiske målinger af en celle med moderat gennemstrømning. En jævnstrømsmåling (DC) bruges til at overvåge celler, når de passerer en mikrofluidisk kanal, og spore deres størrelse og hastighed før, under og efter at de er tvunget gennem en smal indsnævring. Denne information (dvs. størrelse og hastighed) bruges til at kvantificere hver celles tværgående deformation, modstand mod deformation og genopretning fra deformation. Generelt giver denne elektronikbaserede mikrofluidiske platform flere viskoelastiske celleegenskaber og dermed et mere komplet billede af en celles mekaniske tilstand. Fordi det kræver minimal prøveforberedelse, bruger en ligetil elektronisk måling (i modsætning til et højhastighedskamera) og drager fordel af standard blød litografifabrikation, er implementeringen af denne platform enkel, tilgængelig og kan tilpasses til downstream-analyse. Denne platforms fleksibilitet, anvendelighed og følsomhed har givet unik mekanisk information om en bred vifte af celler med potentiale for mange flere applikationer inden for grundvidenskab og klinisk diagnostik.

Introduction

Enkeltceller er dynamiske, viskoelastiske materialer1. En lang række interne og eksterne processer (f.eks. Begyndende mitose eller ombygning af den ekstracellulære matrix [ECM]) påvirker deres struktur og sammensætning 2,3,4, hvilket ofte resulterer i forskellige biofysiske egenskaber, der supplerer deres nuværende tilstand. Især har mekaniske egenskaber vist sig at være vigtige biomarkører for cellulær udvikling, fysiologi og patologi, hvilket giver værdifuld kvantitativ information, der kan supplere kanoniske molekylære og genetiske tilgange 5,6,7. For eksempel beskrev Li et al. for nylig de mekaniske forskelle mellem lægemiddelresistente og lægemiddelresponsive akutte promyelocytiske leukæmiceller, samtidig med at RNA-seq anvendes til at afdække differentielt udtrykte cytoskeletassocierede gener8. Ved at forstå det komplekse samspil mellem enkeltcellemekanik og cellulær funktion har mekanotypning bredere anvendelser til at transformere grundvidenskab og klinisk diagnostik9.

Det mest anvendte værktøj til måling af enkeltcellemekanik er atomkraftmikroskopi (AFM). Mens AFM muliggør en lokaliseret måling af cellulære mekaniske egenskaber med høj opløsning, forbliver den begrænset til en gennemstrømning på <0,01 celler / s10. Alternativt er optiske bårer, der bruger to divergerende laserstråler til at fange og deformere suspenderede enkeltceller11, begrænset til marginalt højere gennemstrømninger på <1 celle / s12. Nylige fremskridt inden for mikrofluidiske teknologier har muliggjort en ny generation af enheder til hurtig, encellet, mekanisk vurdering12,13. Disse teknikker anvender smalle indsnævringskanaler 14,15, forskydningsflow 16 eller hydrodynamisk strækning 17 for hurtigt at deformere celler ved gennemstrømninger på 10-1.000 celler / s 18. Selv om målehastigheden for disse metoder er betydeligt hurtigere end konventionelle teknikker, bytter de ofte kapacitet med høj kapacitet til begrænsede mekaniske aflæsninger (supplerende tabel 1). Alle de førnævnte hurtige mikrofluidiske metoder fokuserer på grundlæggende enkeltparametermålinger, såsom transittid eller deformerbarhedsforhold, der kun afspejler en celles elastiske egenskaber. I betragtning af enkeltcellernes iboende viskoelastiske karakter kræver en robust og grundig mekanisk karakterisering af celler imidlertid ikke kun overvejelse af elastiske komponenter, men også viskøse reaktioner.

Mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)2,8 (figur 1A) er en mikrofluidisk platform, der adresserer eksisterende begrænsninger med enkeltcelle mekanoophenotypning. Denne metode muliggør måling af flere biofysiske parametre samtidigt, herunder cellediameter, relativ deformerbarhed og restitutionstid fra deformation med en moderat gennemstrømning på 1-10 celler / s. Denne teknik er baseret på node-pore sensing (NPS)19,20,21,22,23,24, hvilket indebærer at bruge en firepunktssondemåling til at måle den modulerede strømpuls produceret af en celle, der passerer en mikrofluidisk kanal, der er segmenteret af bredere regioner, kaldet "noder". Den modulerede strømpuls er et resultat af, at cellen delvis blokerer strømmen i segmenterne (dvs. "porer") og knuder, med mere strøm blokeret i førstnævnte end i sidstnævnte. I mekano-NPS er et segment, "sammentrækningskanalen", smallere end en cellediameter; derfor skal en celle deformeres for at passere hele kanalen (figur 1B). Cellediameter kan bestemmes af størrelsen af den subpuls, der produceres, når cellen passerer knudeporerne før sammentrækningskanalen (figur 1B, C). Her |ΔInp|, det aktuelle fald, når cellen er i poren, er proportional med volumenforholdet mellem cellen og poren, V-celle /V-pore 2,8,19. Cellestivhed kan bestemmes af ΔTc, varigheden af den dramatisk større subpuls, der produceres, når cellen passerer sammentrækningskanalen (figur 1B, C). En stivere celle vil tage længere tid at passere kanalen end en blødere 2,8. Endelig kan celle "genopretning", cellens evne til at vende tilbage til sin oprindelige størrelse og form efter deformation, bestemmes af den serie af subpulser, der produceres, når cellen passerer knudeporerne efter sammentrækningskanalen (figur 1B, C). Gendannelsestiden, ΔTr, er den tid, det tager for de aktuelle subpulser at vende tilbage til størrelsen af de tidligere subpulser, før cellen presses. Samlet set registreres og analyseres de modulerede strømimpulser, der produceres som en celle, der passerer den mikrofluidiske kanal, for at ekstrahere de relevante enkeltcellemekaniske parametre (figur 1D)2,8.

Reproducerbarheden og brugervenligheden af denne elektronikbaserede mikrofluidiske platform er tidligere blevet demonstreret25. Derudover præsenterer platformen en lav adgangsbarriere for encellet mekanotypning. Standard blød litografi anvendes til fremstilling af mikrofluidiske enheder. Målehardwaren består af billige komponenter, herunder et simpelt printkort (PCB), strømforsyning, forforstærker, dataopsamlingskort (DAQ) og computer. Endelig er brugervenlig kode tilgængelig til dataindsamling og analyse, hvilket muliggør enkel implementering. Denne mekanofysningsteknik kan skelne populationer af ikke-maligne og ondartede bryst- og lungeepitelcellelinjer, skelne mellem underlinjer i primære humane brystepitelceller og karakterisere virkningerne af cytoskeletale forstyrrelser og andre farmakologiske midler 2,8. Samlet set er denne platform en effektiv tilgang til mekanoophenotypning af enkeltceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design enhedens geometri

  1. Vælg bredden af størrelses- og gendannelsessegmenterne, så den er bredere end diameteren på de største celler, der skal måles, men også opretholder et tilstrækkeligt signal-støj-forhold (SNR). Se supplerende tabel 2 for eksempler på forskellige størrelses- og gendannelsessegmentbredder for forskellige cellelinjer.
  2. Vælg sammentrækningssegmentbredden for at anvende en 30% -40% belastning på den gennemsnitlige størrelse af de celler, der skal gennemgå mekanotypning. Stamme defineres som Equation 1, hvor d er cellediameter og wc er sammentrækningskanalbredden 2,8. Se supplerende tabel 2 for forskellige sammentrækningssegmentbredder for forskellige cellelinjer.
    BEMÆRK: Hvis man ønsker at sammenligne celletyper eller tilstande med væsentligt forskellige diametre, skal der anvendes separate enhedsdesign med sammentrækningssegmentbredder, der er specifikke for hver celletype / tilstand.
  3. Design en referenceenhed for hver unik enhedsgeometri. Dette er nødvendigt for at bestemme De, den effektive diameter af størrelsesporesegmentet i den mikrofluidiske kanal.
    BEMÆRK: Referenceenheden bruger den samme geometri som den primære enhed. Den eneste ændring er, at sammentrækningssegmentet skal være lige bredt til størrelsesporesegmentet for at muliggøre kalibrering med polystyrenperler af en kendt størrelse. Udvidelse af sammentrækningen forhindrer polystyrenperlerne i at tilstoppe sammentrækningskanalen under kalibrering. Kalibreringsprocessen er nærmere beskrevet i trin 4.1 og 5.3.1. Kalibrering kan også opnås ved hjælp af en kommercielt tilgængelig celletæller, i hvilket tilfælde der ikke er behov for nogen referenceenhed. Denne proces er beskrevet i trin 4.2.
  4. Vælg kanalhøjden, så de største celler af interesse kan forlænges fuldt ud uden begrænsning inden for sammentrækningssegmentet2. Sørg for, at kanalhøjden er større end hmin Equation 2 (dette forudsætter, at cellen er sfærisk prædeformation, og at isometrisk deformation forekommer langs kanallængden og højden under deformation).
    BEMÆRK: I betragtning af størrelsen af en strømsubpuls, jo større hmin er, Equation 3jo lavere vil den samlede SNR være.
  5. Design og opret en fotomaske ved hjælp af computerstøttet designsoftware med de valgte kanalbredder. En eksempelfil findes i supplerende fil 1. Skaler det mikrofluidiske maskedesign med 1,5% for at tage højde for polydimethylsiloxan (PDMS) krympning efter skrælning fra den negative master.
    BEMÆRK: En række enheder kan inkluderes på en enkelt maske, så længe det samlede array ikke overstiger waferens størrelse (supplerende figur 1A).
  6. Design og opret en fotomaske med elektroder, der vil blive brugt til at udføre en firepunktssondemåling af den mikrofluidiske enhedsstrøm (figur 1D). En eksempelfil findes i supplerende fil 1.
    BEMÆRK: En række elektroder kan inkluderes på en enkelt maske, så længe arrayet ikke overstiger glasdiasets størrelse (supplerende figur 1B).

2. Fabrikerbare anordninger (figur 2)

  1. Forbered elektrodemønstre på et glassubstrat.
    1. Spin coat, mønster og proces en positiv fotoresist på et almindeligt glas dias i henhold til produktdatabladet. Et eksempel på denne procedure er skitseret i supplerende fil 2.
    2. Udfør metalaflejring, lift-off og guldætsning.
      1. Udfør tyndfilmaflejring af 75 Å Ti, 250 Å Pt og 250 Å Au på rutsjebanen. Et eksempel på denne procedure ved hjælp af elektronpistolfordampning er skitseret i supplerende fil 3.
      2. Nedsænk diaset i acetone i 15 minutter for at udføre en løft af overskydende metal.
      3. I en røghætte skal du bruge en engangspipette til at droppe støbt guldetchant på det område af elektroder, der vil blive udsat for den mikrofluidiske kanal, som vist i supplerende figur 2. Vær forsigtig med at undgå at tabe ætsning andre steder på diaset.
        FORSIGTIG: Guldfortryllelse kan forårsage hud- og øjenirritation. Indånd ikke dampe, og indtag ikke. Håndter med omhu, brug passende personlige værnemidler (PPE), og kassér affald i henhold til lokale bortskaffelsesbestemmelser.
      4. Skyl diaset med deioniseret (DI) vand og tør det med tørt nitrogen (N2).
    3. Hvis der udskrives flere elektroder på det samme glasglas, skal du skære diaset i individuelle chips.
      1. Brug et glasskæreværktøj til at score diaset langs de mønstrede elektrodegrænser.
      2. Bryd glasset langs partituret for at opdele diaset i individuelle chips.
    4. Visuelt inspicere elektroderne under et mikroskop. Sørg for, at individuelle elektroder ikke er elektrisk åbne, eller at elektroder ikke kortsluttes sammen.
  2. Fabriker en negativ masterform til kanaler.
    1. Spin coat, mønster og proces en SU-8 epoxy modstand på en poleret silicium wafer i henhold til produktdatabladet. Et eksempel på denne procedure er skitseret i supplerende fil 2.
    2. Mål funktionshøjder ved hjælp af et profilometer, og inspicer visuelt funktionerne under et mikroskop (supplerende figur 3). Sørg for, at de ønskede geometrier er veldefinerede.
  3. Form PDMS kanaler med blød litografi.
    1. Forbered PDMS ved at veje en elastomer og en tværbinding i et masseforhold på 10: 1 i en engangskop.
      BEMÆRK: For en wafer med en diameter på 3 er 30 g PDMS tilstrækkelig.
    2. Bland PDMS kraftigt i 30 s med en engangsgaffel, indtil PDMS er uigennemsigtig med bobler.
    3. Afgasning af PDMS i et vakuumkammer i ca. 30-90 minutter, eller indtil PDMS er gennemsigtig uden synlige bobler.
    4. Placer waferen med SU-8-masterformen i en engangs petriskål og hæld PDMS over midten af waferen.
    5. Anbring petriskålen indeholdende PDMS og wafer i et vakuumkammer og afgas i ca. 30 minutter, eller indtil der ikke er bobler tilbage i PDMS.
    6. Bag PDMS ved 80 °C i 2 timer i en ovn eller på en kogeplade.
    7. Med et skarpt blad skal du skære og fjerne PDMS fra SU-8 negativ master.
    8. Skær den støbte PDMS-plade i individuelle forme ved hjælp af et skarpt blad
    9. Kerne indløbs- og udløbsadgangshullerne ved hjælp af en engangsbiopsistans. For at opnå de bedste resultater skal du bruge et nyt slag til hver PDMS-plade. Et skarpere slag producerer glatkantede huller, hvilket minimerer partikler, der kan blokere sammentrækningskanalen.
      BEMÆRK: Adgangshullernes diameter skal være lidt mindre end slangens ydre diameter. For eksempel, hvis du bruger polytetrafluorethylen (PTFE) rør med en ydre diameter på 1/32 tommer, skal der stanses et 1,5 mm hul.
  4. Bond et glas/ elektrodesubstrat til PDMS-kanalerne.
    1. Rengør elektrodeglasgliderne med methanol (≥99,8%). Tør med tør N2.
    2. Rengør PDMS-enheden med scotch tape efterfulgt af en skylning med isopropylalkohol (IPA) og deioniseret vand (DI; 18 MΩ/cm2). Tør med tør N2. Rengør derefter med scotch tape igen.
    3. Placer glassubstratet med præfabrikerede elektroder og den forberedte PDMS-form (funktionssiden opad) i en plasmarenser.
    4. Udsæt begge for iltplasma i 2 minutter (100-300 mTorr, 30 W).
    5. Juster og placer PDMS-formen med funktionssiden nedad på glasunderlaget med præfabrikerede elektroder.
      BEMÆRK: Binding er øjeblikkelig, når den plasmabehandlede PDMS og glas kommer i kontakt; Det vil derfor ikke være muligt at foretage yderligere ændringer af tilpasningen. For at lette justeringen kan 20 μL af en 2:1 fortynding af methanol i DI-vand pipetteres på den plasmabehandlede glasoverflade. Methanolopløsningen fungerer som en fysisk barriere mellem det behandlede glas og PDMS, hvilket giver mulighed for justeringsjusteringer. Hvis du bruger methanol, bages den justerede og parrede enhed ved 50 °C i 2 timer for at fordampe opløsningen og fuldføre bindingsprocessen.
    6. Visuelt inspicere den bundne enhed under et mikroskop. Sørg for, at elektroderne og kanalgeometrierne er korrekt justeret.

3. Mål celler (figur 1D)

  1. Forbered trykkilden, printkort, stationær hardware, og dataindsamlingssoftware.
    1. Tilslut den mikrofluidiske enhed til printkortet ved hjælp af klemmen. Et eksempel på printkortet findes i supplerende fil 4 (GERBER-filer) og supplerende fil 5 (skematiske, kort-, kort- og PCB-delelistefiler).
      1. Juster klemmens fjederbelastede stifter med elektrodekontaktpuderne på den mikrofluidiske enhed, og juster klemmens overskriftsstifter med hullerne på printkortet.
      2. Indsæt klemmens hovedstifter fast i PCB-hullerne, og sørg for, at de fjederbelastede stifter forbliver på linje med elektrodekontaktpuderne.
    2. Konfigurer og tilslut den elektroniske hardware.
      1. Tilslut to af strømforsyningens udgangsporte til printkortets forsyningsspændingsport med en dobbelt bananstik til Bayonet Neill-Concelman (BNC) kvindelig adapter og et BNC-kabel.
      2. Tænd for strømforsyningen. Indstil udgangen, der er tilsluttet BNC's indre leder, til +15 V, og indstil den anden udgang til -15 V. Aktivér begge udgange til at drive kredsløbet.
      3. Tilslut den tredje af strømforsyningens udgangsporte til printkortets indgangsspændingsport med et BNC-kabel. Indstil output til den ønskede påførte spænding, men aktiver det ikke, før eksperimentet startes.
      4. Tilslut printkortets udgangsstrømsport til indgangen til den aktuelle forforstærker med et BNC-kabel.
      5. Tilslut udgangen fra den aktuelle forforstærker til en analog indgang på BNC-terminalblokken i dataindsamlingssystemet med et BNC-kabel. Tilslut eventuelt et analogt lavpasfilter på linje med BNC-kablet for at filtrere højfrekvent interferens fra.
        BEMÆRK: For at forbedre SNR, printkortet og enheden kan være anbragt i et tykt metalkabinet. Alle BNC-kabler og væskeslanger kan føres gennem huller, der er boret ind i kabinettet.
    3. Installer og opsæt den nødvendige software på pc'en
      1. Tænd og tilslut trykregulatoren til pc'en. Installer den nødvendige trykreguleringssoftware i henhold til producentens anvisninger.
      2. Installer MATLAB og dataindsamlingsværktøjskassen på pc'en. Sørg for, at de nødvendige drivere til dataindsamlingssystemet er installeret, så MATLAB Data Acquisition Toolbox-grænsefladen kan registrere det.
      3. Download det medfølgende dataindsamlingsscript, "NPS.m", fra https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public.
    4. Åbn og konfigurer dataindsamlingsscriptet.
      1. Angiv de korrekte værdier for at initialisere dataindsamlingssessionen, som omfatter leverandør-id'et, DAQ'ens enheds-id og det analoge inputkanalnummer (linje 34-36 i det medfølgende script).
        BEMÆRK: Enheds-id'et kan findes ved hjælp af funktionen "daq.getDevices" eller "daqlist".
      2. Angiv den ønskede prøvehastighed for anskaffelsen (linje 23 i det medfølgende script). For optimale resultater skal den indstilles til mindst 10 kHz.
  2. Forbered cellesuspensionen.
    1. Der fremstilles en opløsning af 2% føtalt bovint serum (FBS) i 1x fosfatbufferet saltvand (PBS), og filtreres med et 0,22 μm filter.
    2. Kultur og forbered cellerne i henhold til den relevante cellekulturprotokol for den valgte cellelinje. Cellerne i den fremstillede opløsning af 2% FBS i 1x PBS suspenderes i en koncentration på 1-5 x 105 celler/ml. Hold cellerne på is i løbet af eksperimenterne.
  3. Mål cellernes fysiske egenskaber.
    1. Læg celleprøven i slangen, og tilslut den til enhedens indløb.
      1. Skær 30 cm PTFE-slange med et barberblad eller en skarp kniv.
      2. Fastgør den ene ende af slangen til en luerlåssprøjte. Brug sprøjten til at trække celleprøven op i den anden ende af slangen.
      3. Indsæt forsigtigt slangen i enhedens indløb.
      4. Tilslut den modsatte ende af slangen til den mikrofluidiske trykregulator.
        BEMÆRK: Der kan tilføjes et filter mellem den mikrofluidiske trykregulator og slangen for at forhindre væsketilbagestrømning i trykregulatoren.
    2. Kør eksperimentet.
      1. Indstil det ønskede konstante kørselstryk på trykregulatorsoftwaren, og lad prøven fylde enheden.
        BEMÆRK: Trykket er typisk 2-21 kPa. Strømningshastigheden skal være langsom nok til at muliggøre klart definerede impulser, men hurtig nok til at muliggøre tilstrækkelig gennemstrømning.
        1. Hvis der dannes bobler i de mikrofluidiske kanaler, skal du bruge blindgydefyldning: Tilslut enhedens stikkontakt og påfør et lavt tryk på indløbet for at tvinge luft ud gennem det gasgennemtrængelige PDMS. Hvis du efterlader bobler i kanalen, vil det føre til en ustabil aktuel basislinje og forhindre nøjagtige målinger.
        2. Hvis snavs tilstopper den mikrofluidiske kanal, skal du løsne den ved let at trykke på toppen af PDMS-enheden, mens du anvender køretrykket, "pulserer" et højere tryk ved at slå trykket til og fra eller fjerne slangen og indsætte den igen. Hvis affaldet forbliver, kan det være nødvendigt at skifte til en ny enhed.
      2. Indstil den ønskede spænding ved at dreje spændingsknappen på strømforsyningen og aktiver spændingen ved at trykke på Til-knappen .
        BEMÆRK: Spænding er typisk 1-5 V. Vælg den laveste spænding, der er nødvendig for en passende SNR. Den samme spænding skal bruges på tværs af alle forhold, der skal sammenlignes.
      3. Tænd for den aktuelle forforstærker, og indstil følsomheden (A / V) så lavt som muligt; alternativt kan du indstille forstærkningen (V / A) så højt som muligt uden at overbelaste forforstærkeren eller overskride den maksimale analoge indgangsspænding for DAQ. I denne undersøgelse blev følsomheden sat til 10-7 A / V.
        BEMÆRK: Den korrekte følsomhed / forstærkningsværdi afhænger af både den påførte spænding såvel som den mikrofluidiske kanals basislinjemodstand.
      4. Tryk på den grønne Kør-knap i MATLAB-båndmenuen for at starte dataindsamlingsscriptet NPS.m og begynde at prøve og gemme dataene.
      5. For at afslutte eksperimentet skal du trykke på knappen Stop i nederste venstre hjørne af figurvinduet for at stoppe dataindsamlingsscriptet. Deaktiver strømforsyningsudgangen ved at trykke på Til-knappen . Indstil trykkilden til nul tryk i trykregulatorsoftwaren.
      6. På dette tidspunkt kan eksperimentet sættes på pause for at gøre et eller flere af følgende:
        1. Udskift den aktuelle enhed med en ny.
        2. Genindlæs slangen med flere celleprøver.
          BEMÆRK: For at undgå krydskontaminering af prøver skal du bruge nye enheder til at måle celler af forskellige typer eller tilstande.
        3. Frigør enheden fra printkortet, og undersøg kanalens tilstand under et mikroskop. For at genstarte eksperimentet ved hjælp af den samme enhed skal man passe på ikke at indføre luftbobler. Det kan være nødvendigt at lægge et let tryk på sprøjtestemplet for at holde celleprøven helt i enden af slangen, mens den indsættes i enhedens indløb.

4. Kalibrer den mikrofluidiske enhed

  1. Mulighed 1: Mål polystyrenperlerne i referenceenheder.
    1. Vælg en polystyrenperlestørrelse, der er mindre end størrelseskanalen.
    2. Der tilsættes 1,5 % Tween- og polystyrenperler til den filtrerede PBS- og FBS-opløsning, der anvendes under celleforsøgene, i en koncentration på 1-3 x 105 perler/ml.
    3. Eksperimentet fortsættes som beskrevet i afsnit 3 ved hjælp af referenceanordningen beskrevet i trin 1.3, og anvend den samme spænding, der blev brugt under forsøget. Brug den gennemsnitlige størrelse af det aktuelle fald, der produceres, når perler passerer størrelsesporerne og perlernes kendte diameter, til at beregne De, som beskrevet i afsnit 5.
  2. Mulighed 2: Mål cellestørrelsen uafhængigt med en separat måleenhed.
    1. I stedet for at følge protokollen i trin 4.1 skal du bruge et kommercielt tilgængeligt cellestørrelsesmåleinstrument til at måle den gennemsnitlige størrelse af celler i prøven. I dette tilfælde er der ikke behov for nogen referenceenhed. Brug det gennemsnitlige aktuelle fald, der produceres, når celler passerer størrelsesporen, og den målte gennemsnitlige cellediameter til at beregne De som beskrevet i afsnit 5.

5. Analyser data for at udtrække cellefænotyper

BEMÆRK: Databehandling kan udføres ved hjælp af MATLAB-kommandolinjegrænsefladeprogramfilen mNPS_procJOVE.m på https://github.com/sohnlab/NPS-analysis-JOVE. Se supplerende fil 6 for flere instruktioner.

  1. Forbehandle dataene (figur 3A).
    1. Beregn den målte elektriske strøm ved at anvende den forstærkningsværdi, der anvendes i strøm-til-spænding-forforstærkeren, på de rå data, der er erhvervet af DAQ.
    2. Fjern højfrekvent støj ved at anvende en rektangulær udjævningsfunktion og/eller et lavpasfilter på råstrømsmålingen. Derefter skal du prøve de filtrerede data igen til en lavere prøvehastighed. Beregn også de tilsvarende tidsstempeldata med denne lavere prøvehastighed.
    3. Beregn et monteret basisstrømsignal ved at anvende en metode som asymmetrisk mindste kvadrater, der udjævner26.
    4. Beregn det omtrentlige første derivat (forskelssignal) af de forbehandlede aktuelle data ved at tage forskellen mellem efterfølgende datapunkter.
  2. Identificer cellehændelser, og udtræk subpulsdata (figur 3B).
    1. Søg efter kandidatcellehændelser ved at undersøge de forbehandlede data. Afvis cellehændelser, der overlapper andre cellehændelser (dvs. tilfældighedshændelser) (supplerende figur 4), udviser en dårlig baseline-pasform eller har en uventet eller fejlagtig pulsform (f.eks. hvor en tilstopning kan have været til stede i kanalen).
    2. Uddrag subpulsdata for hver cellehændelse.
      1. Hvert node-pore-segment vises som en tilsvarende subpuls inden for den samlede signalpuls (figur 1B, C). Identificer starten på hver subpuls ved at beregne det tidspunkt, hvor forskelssignalet når en lokal minimumsværdi. Identificer slutningen af hver subpulse ved at beregne tidspunktet, når forskelssignalet når en lokal maksimal værdi.
      2. Bestem bredden af hver subpuls som den forløbne tid mellem start- og sluttidspunkterne. Amplituden af hver subpuls bestemmes ved at beregne gennemsnittet af forskellen mellem den målte strøm og basisstrømmen for alle datapunkter mellem start- og sluttidspunkterne.
  3. Bestem cellemekanoplastotypen for hver cellehændelse baseret på subpulsdata.
    1. Bestem cellediameteren d baseret på ligningen defineret af Deblois og Bean24:
      Equation 4
      hvor ΔI/I er middelforholdet mellem subpulsamplitude og baselinestrøm i dimensioneringssubpulserne, De er kanalens effektive diameter (målt i trin 4), og L er den samlede længde af node-porekanalen.
      1. D e bestemmes ved at beregne den gennemsnitlige ΔI/I produceret af et sæt partikler med en kendt diameter (enten celler eller perler, se trin 4) ved hjælp af den kendte diameter som d og løse Eq. 1 for De.
    2. Kvantificer cellens modstand mod deformation.
      1. Væskehastigheden U-flowet bestemmes ved at beregne den gennemsnitlige cellehastighed i dimensioneringssubpulserne ved hjælp af de kendte segmentlængder og den målte varighed af hver subpuls.
      2. Bestem helcelledeformerbarhedsindekset (wCDI), defineret af Kim et al.2 som:
        Equation 5
        hvor L c er længden af sammentrækningssegmentet, h-kanal er kanalhøjden, og ΔTc er varigheden af sammentrækningssubpulsen.
    3. Identificer cellens restitutionstid fra deformation, defineret som den første genopretningssubpuls med en amplitude inden for 8% af den gennemsnitlige amplitude fra dimensioneringssubpulsen2.
    4. Beregn cellens tværgående deformation inden for sammentrækningssegmentet.
      1. Beregn den effektive diameter af sammentrækningssegmentet (De,c) som defineret af Kim et al.2: Equation 6, hvor w c er bredden af sammentrækningssegmentet og wnp er bredden af alle andre segmenter.
      2. Beregn den ækvivalente sfæriske diameter dc af cellen i sammentrækningen ved igen at bruge ligningen defineret af Deblois og Bean24:
        Equation 7
        hvor ΔI c/I c er forholdet mellem subpulsamplitude og baselinestrøm i sammentrækningssubpulsen, og Lc er længden af sammentrækningssegmentet.
      3. Beregn cellens forlængelseslængde Ldeformeres som beskrevet af Kim et al.2:
        Equation 8
      4. Endelig beregnes cellens tværgående deformation δdeformeres, som er defineret af Kim et al.2 til at være Equation 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mekanophenotypningsplatformen, der præsenteres her, er en enkel og alsidig tilgang til måling af de biofysiske egenskaber hos enkeltceller med moderat gennemstrømning. Celler strømmes gennem den mikrofluidiske kanal (figur 1A) ved hjælp af konstant trykdrevet strømning. Når cellerne passerer, registreres længden af den mikrofluidiske kanal og de producerede strømimpulser ved hjælp af dataindsamlingshardwaren. Det erhvervede signal (figur 1B, C) behandles derefter ved hjælp af brugerdefineret software på MATLAB for at udtrække de relevante encellede mekaniske egenskaber. Figur 1D viser en grafisk oversigt over forsøgsprotokollen.

For at fremstille enheder oprettes en negativ masterform oprindeligt og bruges til at støbe PDMS (figur 2). Vellykkede masterforme, vist i supplerende figur 3, indeholder glatte, lodrette sidevægge og ingen defekter i den mikrofluidiske kanal (figur 4Ai). Der skal udvises forsigtighed ved fremstilling af denne indledende masterform, fordi eventuelle defekter i dårligt fremstillede wafere (supplerende figur 3) overføres til alle efterfølgende PDMS-afstøbninger (figur 4Aii), hvilket gør dem ubrugelige. Vellykkede PDMS-afstøbninger plasmabindes derefter til glasglas med mønstrede elektroder (figur 1A).

Til eksperimenter, en enheds elektrodepuder er forbundet til printkortet (figur 1D) for at muliggøre strømmåling. Slanger, der indeholder en celleprøve, indsættes derefter i enhedens indløb og forbindes til en mikrofluidisk strømningsregulator, hvilket muliggør en trykdrevet strøm af celler gennem den mikrofluidiske kanal. Det er vigtigt, at der vises en live aflæsning af den aktuelle måling under et eksperiment. Dette gør det muligt for brugerne at sikre, at deres enhed fungerer efter hensigten. Vellykkede celletransithændelser består af let skelnelige subpulser (figur 4Bi). Komplikationer, såsom tilstopning, kan forekomme under eksperimentering og kan identificeres ved live aflæsning af begivenheder med unormale pulsformer (figur 4Bii).

Til dataanalyse er de kritiske signalparametre, der skal ekstraheres for hver celletransithændelse, beskrevet i figur 1B og beskrevet i trin 5.2.2. Det rå signal skal have en tilstrækkelig SNR til at filtrere støjen fra og udtrække de væsentlige komponenter (figur 3A). Kritisk set bør den aktuelle signalstigning fra hver knude være robust nok til, at subpulser let kan identificeres ud fra forskelssignalet ∂ I/∂t (figur 3B).

De målte wCDI- og gendannelsestider kan bruges til at foretage direkte sammenligninger mellem celler eller tilstande. Specifikt er wCDI en relativ indikator for cellestivhed, der er omvendt proportional med det elastiske modul (supplerende figur 5); således svarer en større værdi af wCDI til en blødere mekanisk fænotype. For eksempel har maligne MCF-7-celler i figur 5A en større wCDI-fordeling end ikke-maligne MCF-10A-celler, hvilket indikerer, at de ondartede MCF-7-celler er blødere end deres ikke-maligne MCF-10A-modstykker. Dette er i overensstemmelse med adskillige empiriske undersøgelser, der har vist, at kræftceller er blødere end deres ikke-ondartede modstykker27. Ligeledes viser MCF-10A- og MCF-7-celler behandlet med latrunculin i figur 5B en stigning i wCDI. Latrunculin er et potent farmakologisk middel, der forstyrrer actincytoskelettet28. Derfor er det konsekvent at observere en større wCDI og dermed en blødere fænotype i celler behandlet med dette lægemiddel. Endelig sammenlignes wCDI i figur 5C mellem to humane brystepitelcelleunderlinjer, luminal epitel (LEP) og myoepitelial (MEP). I denne sammenligning er der igen en tydelig wCDI-fordeling, der adskiller de to primære celletyper, hvilket indikerer, at LEP-celler er blødere end MEP-celler. Ud over wCDI kan restitutionstider også kvantificeres for at give en relativ indikator for celleviskositet. En længere restitutionstid indikerer en mere tyktflydende fænotype. Figur 5D viser restitutionstiderne, opdelt i tre forskellige kategorier, for hver af betingelserne i figur 5A-C. Ubehandlede MCF-10A'er og MCF-7'er har en større andel af celler, der genvinder øjeblikkeligt (ΔTr = 0), hvilket indikerer en lavere viskositet end deres latrunculinbehandlede modstykke.

wCDI og gendannelsestid er relative målinger af enkeltcelleelasticitet og viskositet. Derfor er den metode, der præsenteres her, bedst egnet til at karakterisere differentialresponset mellem flere prøver af interesse. I sin nuværende form giver protokollen, der præsenteres her, ikke absolutte kvantificeringer af definerede mekaniske parametre, såsom Youngs modul.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over mekanotypningsplatformen. (A) Billede af den mikrofluidiske enhed. (B) Kanalgeometri med en repræsentativ strømpuls fra en enkelt celletransithændelse. Δ Inp repræsenterer den aktuelle dråbe fra cellen, der kommer ind i poren, og ΔIc repræsenterer den aktuelle dråbe fra cellen, der kommer ind i sammentrækningen. Δ T p repræsenterer den tid, der er nødvendig for, at cellen kan passere poren, Δ Tc repræsenterer den tid, der er nødvendig for, at cellen kan passere sammentrækningskanalen, og ΔTr repræsenterer den tid, der er nødvendig for, at cellen kan komme sig. (C) Reel strømpuls fra en celletransithændelse. (D) Eksperimentel arbejdsgang: (1) celler suspenderes i PBS og (2) drives gennem den mikrofluidiske enhed med konstant tryk. Når cellerne passerer den mikrofluidiske kanal, måles (3) strømimpulser ved hjælp af dataindsamlingshardware. (4) De aktuelle impulser analyseres for at ekstrahere flere enkeltcellede mekaniske egenskaber. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Oversigt over enhedsfabrikation . (A) Negative masterforme er (1) fremstillet ved hjælp af fotolitografi. (2) PDMS støbes derefter på de negative masterforme. (3) De støbte anordninger er terninger, med indløbs- og udløbshuller stanset. (B) Samtidig er glasglas (1) mønstret til fremstilling af metalelektroder. (2) E-strålefordampning bruges til at aflejre metal på diaset efterfulgt af en (3) løfteproces for at fjerne overskydende metal og efterlade de ønskede metalelektroder. (C) PDMS-anordningen og glas med metalelektroder bindes derefter sammen ved hjælp af iltplasma for at fuldføre fremstillingsprocessen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Databehandling og analyse . (A) Råstrømsdata (venstre) forbehandles (højre) ved at anvende en rektangulær udjævningsfunktion og lavpasfilter efterfulgt af gensampling til en lavere prøvehastighed. Basisstrømsignalet udstyres efterfølgende med asymmetriske mindste kvadrater, der udjævner26. (B) Tidspunkterne ved starten og slutningen af hver subpuls identificeres som henholdsvis lokale minimum og maksimum i forskelssignalet ∂ I/∂t (venstre). For hver subpuls bestemmes bredden Δt af den forløbne tid mellem start og slut, og amplituden ΔI bestemmes af den gennemsnitlige forskel mellem den målte strøm og basisstrømmen. De ekstraherede subpulsdata kan repræsenteres som et rektangulært signal (højre); Hver subpuls svarer til et segment i enhedens geometri. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Eksempler på vellykkede og fejlbehæftede resultater under fabrikation og eksperimentering . (A) Billeder af PDMS-afstøbninger af sammentrækningssegmenter taget fra to forskellige negative masterforme. (i) er et eksempel på en velfremstillet kanal med glatte sidevægge, veldefineret geometri og ingen mærkbare defekter. ii) er et eksempel på en dårligt fremstillet kanal med betydelige defekter i sammentrækningskanalen (skitseret i røde rektangler), som enten helt eller delvist ville hindre partikelstrømmen (skalastænger = 150 μm). (B) Eksempler på filtrerede strømimpulser genereret af "NPS.m" under dataindsamling. i) Eksempel på en vellykket cellehændelse, hvor en celle passerer kanalen efter hensigten. ii) Eksempel på aktuelle impulser, der produceres, når enheden er "tilstoppet". I dette tilfælde forhindrer snavs cellestrømmen i kanalens anden pore. Dette fører til cellehændelser, der vises "afskåret" (angivet med den røde linje) midtvejs gennem den anden dimensioneringspuls. Faldet i strømmen (angivet med de blå linjer) efter "afskæringen" er forårsaget af partikler (snavs eller celler), der opbygges omkring blokeringen og derfor blokerer en større del af strømstrømmen. En skarp nedadgående spids i strømmen (angivet med det grønne rektangel) afspejler en partikel, der er i stand til at passere rundt om blokeringen og derfor kun midlertidigt blokere en større del af strømmen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Eksempler på wCDI og cellegendannelse mellem forskellige tilstande. (A) wCDI-fordeling mellem to brystepitelcellelinjer, ikke-ondartet MCF-10A og ondartet MCF-7. (B) wCDI af MCF-10A eller MCF-7, hvor hver celletype var ubehandlet, behandlet med Lat-A og behandlet med Lat-B. (C) wCDI-fordeling mellem to primære humane brystepitel-underlinjer: myoepitelceller (MEP) og luminale epitelceller (LEP). (D) Gendannelsestider svarende til de fire forhold mellem A, B og C. Gendannelsestider blev kasseret for at lette visningen. Alle betingelser havde en prøvestørrelse på n = 99 celler. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Kim et al.2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Eksempler på enhederarrays til både mikrofluidiske kanaler og elektroder. Begge billeder, repræsenteret som gennemsigtighedsmaskerne, skal være designet med hvid (repræsenterer gennemsigtig) i de områder, hvor fotoresisten vil blive udsat for UV og sort i de områder, hvor den vil blive blokeret for UV-eksponering. (A) En række mikrofluidiske kanaler med to parallelle kanaler pr. "enhed" (rektangel), arrangeret på en 3 i Si-wafer. Enheden yderst til højre er mærket som "ref" og er designet, som beskrevet i trin 1.3, til brug ved kalibrering. (B) En række elektroder med to elektroder pr. anordning, således at begge kanaler i en enhed fra (A) vil justere over hvert elektrodedesign fra (B). Dette array blev arrangeret til en 2 i x 3 i glasrutschebane. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Skemaer, der illustrerer områder af elektrodedesignet, og hvordan man ætser guld korrekt væk (trin 2.1.2.3). Det øverste lag af guld skal fjernes fra måleelektroderne, ellers vil biofouling og elektrolyse forekomme under målingen. Guld skal dog forblive på kontaktpuderne, fordi det bløde guld giver en overlegen elektrisk forbindelse med stifterne på pogo pin-stikket. (A) Skematisk, der viser, hvordan den mikrofluidiske kanal (i blåt) skærer det mønstrede metal (sort). Som angivet er metallet vinkelret på den mikrofluidiske kanal og direkte under det måleelektroderne, hvor guld skal ætses, mens de store metalrektangler til siden af kanalen er kontaktpuderne, hvor guld skal forblive. (B) Skematisk, der viser, hvor guldetchant skal påføres det mønstrede metal, samt hvor det ikke skal. Det grønne område angiver, hvor ætsning er nødvendig, det gule område angiver, hvor ætsning kan forekomme og ikke vil påvirke enhedens effektivitet, og det røde område angiver, hvor guld ikke må ætses. (C) Skematisk, der viser en typisk, vellykket ætset enhed. Gul angiver områder, hvor guld stadig er til stede, og grå angiver områder, hvor platinlaget er blevet eksponeret. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Billeder af vellykkede og dårligt fremstillede sammentrækningskanaler. (A) Billeder af sammentrækningskanaler på negative masterforme fra to individuelle Si-wafere. (i) Et eksempel på en velfremstillet masterform, der ville producere en ideel PDMS-kanal som den, der er vist i figur 4Ai. (ii) Et eksempel på en dårligt fremstillet masterform, som blev brugt til at oprette PDMS-kanalen vist i figur 4Aii. De regioner, der er skitseret i røde rektangler, svarer til de defekter, der er angivet i figur 4Aii, hvilket viser overførslen af defekter fra masterformen til PDMS-mikrokanalerne (skalastænger = 150 μm). (B) Billeder af tværsnittet af PDMS-sammentrækningskanaler, der viser højden og bredden af forskellige forme. Disse tværsnit blev erhvervet ved at skære PDMS-kontraktionskanalen vinkelret på strømningsretningen. (i) Et eksempel på en velfremstillet PDMS-form skabt ved hjælp af waferen vist i (Ai), der demonstrerer glatte lodrette sidevægge. (ii) Et eksempel på en dårligt fremstillet PDMS-form skabt ved hjælp af waferen vist i (Aii), der demonstrerer skrå sidevægge (skalastænger = 20 μm). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: Eksempel på en sammenfaldende cellehændelse (fremstillet, når mere end én celle passerer kanalen på én gang). Signalet blev behandlet i henhold til trin 5.1.1-5.1.3 i afsnit 5 i protokollen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 5: Forholdet mellem wCDI og det elastiske modul 20,29,30,31,32,33,34,35. (A) Sammenligning af Jurkat-, MCF7- og MCF10A-celler målt ved denne teknik versus mikropipetteaspiration. wCDI er omvendt proportional med kortikal spænding. (B) Sammenligning af MCF7- og MCF10A-celler målt ved denne teknik versus offentliggjorte AFM-data. (C) Sammenligning af A549- og BEAS-2B-celler målt ved denne teknik versus offentliggjorte AFM-data. Over flere celletyper er wCDI omvendt proportional med elastisk modul. Denne figur er gengivet med tilladelse fra Kim et al.2. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 1: Eksempler på enkeltcellede mekanophenotypningsteknikker, og hvordan de sammenlignes med mekano-NPS. Teknikker er angivet i rækkefølge efter stigende gennemstrømning 12,2,36,37. Mekanisk information refererer til, om enheden kan måle både de elastiske og viskøse mekaniske egenskaber i hver celle. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 2: Eksempel på størrelses-, sammentræknings- og genfindingssegmentbredder for forskellige cellelinjer. MEP og LEP henviser til to linjer af primære humane brystepitelceller, hvor MEP refererer til myoepitelceller og LEP refererer til luminale epitelceller 2,8. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende fil 1: Eksempel på AutoCAD-design. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Eksempelprotokol til fotolitografibehandling. To eksempler på protokoller er skitseret til mønsterning og behandling af fotoresist eller SU-8 epoxy. Den første beskriver anvendelsen af positiv fotoresist på et glasglas for at fungere som et offerlag til elektrodefremstilling. Den anden beskriver anvendelsen af SU-8 epoxy på en siliciumskive for at skabe reliefstrukturer til støbning af PDMS mikrofluidiske kanaler. Disse protokoller blev tilpasset fra MF-321 og SU8 3000 datablade fra producenten. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: Eksempelprotokol for tyndfilmsaflejring af 75 Å Ti, 250 Å Pt og 250 Å Au ved hjælp af elektronstrålefordampning. Et eksempel på protokol til udførelse af tyndfilmsaflejring af 75 Å Ti, 250 Å Pt og 250 Å Au ved hjælp af en elektronstrålefordamper er skitseret. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4: GERBER-filer Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 5: Skematiske, kort-, og PCB-delelistefiler Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 6: MATLAB kommandolinjegrænseflade. Denne fil indeholder detaljerede instruktioner til databehandling ved hjælp af MATLAB kommandolinjegrænseflade26. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Måling af de mekaniske egenskaber ved enkeltceller ved hjælp af denne mekanotypningsteknik består af tre faser: enhedsfremstilling, dataindsamling og dataanalyse. Inden for hvert trin er der bemærkelsesværdige aspekter, der kan påvirke de eksperimentelle resultater betydeligt. Under enhedsfremstilling er ensartede kanalgeometrier og enhed-til-enhed-ensartethed afgørende for nøjagtige og repeterbare resultater. Specifikt skal sidevæggene på hver enhed være relativt glatte (figur 4Ai), og kanalhøjderne på tværs af replikerede enheder skal være sammenlignelige. Alle enheder med defekter, der delvist forhindrer cellestrømmen, især i sammentrækningskanalen (figur 4Aii), skal kasseres. Brug af enheder med mærkbare defekter i kanalgeometrien vil resultere i unøjagtige og ikke-reproducerbare resultater. Under dataindsamling er det vigtigt, at brugeren kan genkende tilstedeværelsen af en tilstopning i kanalen under dataindsamling. Et eksempelscript, "NPS.m" (tilgængelig på https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public), viser aktuelle målinger, så brugeren kan overvåge kanaltilstanden og celletransithændelser i realtid. Pulser, der er karakteristiske for en tilstopning, er vist i figur 4B. En tilstopning i sammentrækningskanalen, der stadig tillader nogle celler at strømme, er særlig vigtig at adressere, da celler vil opleve øget belastning på stedet for obstruktionen, hvilket resulterer i unøjagtige wCDI-s. Endelig skal brugerne under dataanalyse være omhyggelige med at vælge nøjagtige tærskler som input til analysealgoritmen. Hvis tærsklerne er sat for højt, identificerer programmet ikke begivenheder produceret af mindre celler, skævvrider resultater og giver et forkert billede af den målte cellepopulation.

Ud over disse kritiske faser er der yderligere aspekter af protokollen, der kan kræve justering, når man studerer forskellige celletyper eller tilstande. For eksempel kræver anvendelse af denne teknik på prøver, der er signifikant mindre end de tidligere undersøgte, smallere sammentrækningskanaler. Fremstilling af smallere kanaler kan kræve dyrere fabrikationsmetoder, såsom elektronstrålelitografi38. Derudover, fordi Δ I / I ~ Δ V-celle / Δ V-sammentrækning (hvorV-celle ogV-sammentrækning er volumenerne af henholdsvis den deformerede celle og kanal), resulterer smallere kanaler i størrebaseline-modstande og faldt SNR19. Endelig kan smalle kanaler øge risikoen for tilstopning, hvilket gør eksperimentel udførelse mere udfordrende. Dette særlige problem kan potentielt afhjælpes ved at bruge flere indløbsfiltre.

En begrænsning af denne teknik er den statiske sammentrækningskanal, som kun kan anvende en enkelt gennemsnitlig stamme på en population af celler. For at sammenligne deformerbarheden af celler med forskellige størrelser eller for at undersøge en enkelt cellepopulation ved forskellige påførte stammer, skal der anvendes flere enheder med varierende sammentrækningskanalbredder. Platformen er også begrænset af dens PDMS-vægge, som begrænser rækkevidden af stivheder, den kan måle. For eksempel er nogle meget stive planteceller stivere end PDMS-væggene, der forventes at deformere dem 39,40. Desuden kan det tryk, der kræves for at skubbe sådanne stive partikler gennem sammentrækningskanalen, overvinde styrken af bindingen mellem PDMS og glasglas, hvilket fører til delaminering. Man kunne dog fremstille mikrofluidiske kanaler til stivere materialer som glas eller silicium for dermed at overvinde disse begrænsninger. På trods af disse mindre begrænsninger forbliver denne platform ideel til mekanisk måling af celler med moderat gennemstrømning. Sammenlignet med andre metoder, såsom optiske bårer eller AFM, muliggør denne teknik højere gennemstrømning. Sammenlignet med andre mikrofluidiske teknologier med moderat til høj kapacitet, såsom RT-DC, er denne teknik i stand til at undersøge mere biofysiske egenskaber ved at måle både de tyktflydende og elastiske egenskaber ved enkeltceller. Endelig gør den enkle eksperimentelle opsætning, der bruger billig elektronik i modsætning til kompleks optik, denne teknik til en meget tilgængelig teknologi.

Samlet set har denne mekanoplastraf enormt løfte som et værktøj til adskillige potentielle undersøgelser og applikationer. Det er tidligere blevet anvendt på et forskelligt sæt celletyper, herunder primære prøver, og har vist dets effektivitet til at måle virkningen af cytoskeletale og nukleare komponenter på cellulære viskoelastiske egenskaber 2,8. Desuden, fordi celler forbliver levedygtige efter screening med denne platform2, har forskere mulighed for at udføre downstream-analyse. Denne platform er også ideel til kobling med opstrøms mikrofluidisk cellesortering, der låner sig til applikationer såsom måling af cirkulerende tumorceller. Fremadrettet forbliver denne platform et konkurrencedygtigt og alsidigt værktøj til multivariable mekaniske målinger af enkeltceller med applikationer til forståelse af celleadfærd41, bestemmelse af sygdomsprogression 42 og overvågning af lægemiddelrespons43. Ud over grundlæggende videnskabelig forskning har denne teknik også et stort løfte som et klinisk værktøj, specifikt en billig, stationær platform til hurtig diagnostisk screening. I betragtning af de lave effektkrav og det minimale behov for prøveforberedelse inden måling er denne teknik desuden særligt velegnet til miljøer med lav ressource, hvor der er hårdt brug for tilgængelige diagnostiske instrumenter44.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L. L. S har amerikansk patent nr. 11.383.241: "Mechano-node-pore sensing", J. Kim, S. Han og L. L. Sohn, udstedt 12. juli 2022.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af tilskud fra NIBIB 1R01EB024989-01 og NCI 1R01CA190843-01. A. L. og R. R. blev støttet af et H2H8 Association Graduate Research Fellowship. K. L. C. blev støttet af et National Science Foundation Graduate Research Fellowship og et Siebel Scholar Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone J.T. Baker 5356-05 Purity (GC)  ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker)
Aluminum Foil n/a n/a
Analog Low-Pass Filter ThorLabs EF504 ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0)
Biopsy Punch Integra Miltex 33-31AA-P/25 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25)
Blade n/a n/a
BNC Cable Pomona Electronics 2249-C-12 https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_
medium=cpc&utm_campaign=
Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term=
&utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ
pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx
mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs
w-EALw_wcB
Cleanroom Polyester Swab Thermo Fisher Scientific 18383 https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383
Current Preamplifier DL Instruments 1211 https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_
id=1419
Custom PCB (w/ components) n/a n/a see Supplemental files 4 and 5
DAQ Terminal Block National Instruments BNC-2120 https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html
DAQ to BNC-2110 cable  National Instruments SHC68-68-EPM https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html
Data Acquisition Board (DAQ) National Instruments PCI-6251 https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html
Dessicator Thermo Fisher Scientific 5311-0250 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250
Female BNC To Banana Plug Adapter Pomona Electronics 72909 https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 89510-186 https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs
Glass Cutter Chemglass CG-1179-21 https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips
Gold Etchant TFA Transene NC0977944 https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944
Hot Plate Thermo Fisher Scientific SP131825 
Isopropyl Alcohol Spectrum Chemical I1056-4LTPL Purity (GC)  ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056)
Metal Hardware Enclosure Hammond Manufacturing EJ12126 https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Purity (GC)  ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561)
MF-321 Developer Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/mf-321/
MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist DuPont n/a https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049
Photomask Fineline Imaging n/a Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/)
Plain Glass Microscope Slide Fisher Scientific 12-553-5B Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm 
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001 https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/
Plastic Petri Dish Thermo Fisher Scientific FB0875712 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712)
Pressure Controller Fluigent MFCS-EZ https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/
Pressure Controller Software Fluigent MAESFLO
Programming & Computation Software MATLAB R2021b for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html)
PTFE Tubing Cole Parmer 06417-31 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731)
Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter Millapore Sigma PHCC20060 https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060
Silicon Wafer Wafer World 2885 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885)
Spin Coater n/a n/a
SU-8 3025 Negative Photoresist Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/su-8-2000/
SU8 Developer Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/su-8-developer/
Sygard 184 Polydimethlysiloxane Dow Chemical 4019862 https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Tape Scotch 810-341296 https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid=
Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO
2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm
vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH
VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB
Titanium, Platinum, Gold n/a n/a
Triple Output Power Supply Keysight E36311A https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653
UV Mask Aligner Karl Suss America MJB3 Mask Aligner 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pegoraro, A. F., Janmey, P., Weitz, D. A. Mechanical properties of the cytoskeleton and cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (11), 022038 (2017).
  2. Kim, J., et al. Characterizing cellular mechanical phenotypes with mechano-node-pore sensing. Microsystems & Nanoengineering. 4, 17091 (2018).
  3. Mierke, C. T. Bidirectional mechanical response between cells and their microenvironment. Frontiers in Physics. 9, 619 (2021).
  4. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, and metastasis: The force journey of a tumor cell. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1), 113-127 (2009).
  5. Nia, H. T., Munn, L. L., Jain, R. K. Physical traits of cancer. Science. 370 (6516), (2020).
  6. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  7. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  8. Li, B., et al. Mechanical phenotyping reveals unique biomechanical responses in retinoic acid-resistant acute promyelocytic leukemia. iScience. 25 (2), 103772 (2022).
  9. Kozminsky, M., Sohn, L. L. The promise of single-cell mechanophenotyping for clinical applications. Biomicrofluidics. 14 (3), 031301 (2020).
  10. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  11. Wottawah, F., et al. Optical rheology of biological cells. Physical Review Letters. 94 (9), 1-4 (2005).
  12. Darling, E. M., Di Carlo, D. High-throughput assessment of cellular mechanical properties. Annual Review of Biomedical Engineering. 17 (1), 35-62 (2015).
  13. Carey, T. R., Cotner, K. L., Li, B., Sohn, L. L. Developments in label-free microfluidic methods for single-cell analysis and sorting. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 11 (1), 1529 (2019).
  14. Bagnall, J. S., et al. Deformability of tumor cells versus blood cells. Scientific Reports. 5, 18542 (2015).
  15. Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
  16. Otto, O., et al. Real-time deformability cytometry: On-the-fly cell mechanical phenotyping. Nature Methods. 12 (3), 199-202 (2015).
  17. Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (20), 7630-7635 (2012).
  18. Guck, J., Chilvers, E. R. Mechanics meets medicine. Science Translational Medicine. 5 (212), 3-6 (2013).
  19. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: A robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab on a Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
  20. Carbonaro, A., Sohn, L. L. A resistive-pulse sensor chip for multianalyte immunoassays. Lab on a Chip. 5 (10), 1155-1160 (2005).
  21. Saleh, O. A., Sohn, L. L. Direct detection of antibody-antigen binding using an on-chip artificial pore. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (3), 820-824 (2003).
  22. Saleh, O. A., Sohn, L. L. An artificial nanopore for molecular sensing. Nano Letters. 3 (1), 37-38 (2003).
  23. Saleh, O. A., Sohn, L. L. Quantitative sensing of nanoscale colloids using a microchip Coulter counter. Review of Scientific Instruments. 72 (12), 4449-4451 (2001).
  24. DeBlois, R. W., Bean, C. P. Counting and sizing of submicron particles by the resistive pulse technique. Review of Scientific Instruments. 41 (7), 909-916 (1970).
  25. Li, B., et al. Evaluating sources of technical variability in the mechano-node-pore sensing pipeline and their effect on the reproducibility of single-cell mechanical phenotyping. PLoS ONE. 16 (10), 0258982 (2021).
  26. Zhang, Z. M., Chen, S., Liang, Y. Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. Analyst. 135 (5), 1138-1146 (2010).
  27. Alibert, C., Goud, B., Manneville, J. B. Are cancer cells really softer than normal cells. Biology of the Cell. 109 (5), 167-189 (2017).
  28. Fujiwara, I., Zweifel, M. E., Courtemanche, N., Pollard, T. D. Latrunculin A accelerates actin filament depolymerization in addition to sequestering actin monomers. Current Biology. 28 (19), 3183-3192 (2018).
  29. Saleh, O. A. A novel resistive pulse sensor for biological measurements. , Princeton University. Princeton. PhD Thesis (2003).
  30. Dokukin, M. E., Guz, N. V., Sokolov, I. Quantitative study of the elastic modulus of loosely attached cells in AFM indentation experiments. Biophysical Journal. 104 (10), 2123-2131 (2013).
  31. Li, Q., et al. Probing the elasticity of breast cancer cells using AFM. 13th International Conference on Biomedical Engineering. IFMBE Proceedings. Lim, C. T., Goh, J. C. H. 23, Springer. Berlin, Heidelberg. 2122-2125 (2009).
  32. Rother, J., et al. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046 (2014).
  33. Li, Q., et al. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (4), 609-613 (2008).
  34. Xu, C., et al. Elasticity measurement of breast cancer cells by atomic force microscopy. Proc. SPIE 9230. Twelfth International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine. (PIBM 2014). 92300, (2014).
  35. Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 84 (3), 2071-2079 (2003).
  36. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  37. Urbanska, M., et al. A comparison of microfluidic methods for high-throughput cell deformability measurements. Nature Methods. 17, 587-593 (2020).
  38. Hill, R. T., Chilkoti, A. Surface Patterning. Biomaterials Science: An Introduction to Materials: Third Edition. , Elsevier Academic Press. NY. 276-301 (2013).
  39. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. Journal of Applied Polymer Science. 131 (22), 41050 (2014).
  40. Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  41. Stephens, A. D., Banigan, E. J., Adam, S. A., Goldman, R. D., Marko, J. F. Chromatin and lamin a determine two different mechanical response regimes of the cell nucleus. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1984-1996 (2017).
  42. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force microscopy of nonadherent cells: A comparison of leukemia cell deformability. Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
  43. Evers, T. M. J., Holt, L. J., Alberti, S., Mashaghi, A. Reciprocal regulation of cellular mechanics and metabolism. Nature Metabolism. 3 (4), 456-468 (2021).
  44. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing enables label-free surface-marker profiling of single cells. Analytical Chemistry. 87 (5), 2988-2995 (2015).

Tags

Bioengineering udgave 190
Mekano-node-pore-sensor: En hurtig, etiketfri platform til multi-parameter enkeltcelle viskoelastiske målinger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lai, A., Rex, R., Cotner, K. L.,… More

Lai, A., Rex, R., Cotner, K. L., Dong, A., Lustig, M., Sohn, L. L. Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements. J. Vis. Exp. (190), e64665, doi:10.3791/64665 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter