Summary
ここでは、メカノノード細孔センシング(mechano-NPS)と呼ばれるエレクトロニクスベースのマイクロ流体プラットフォームを使用して、単一細胞を機械的に表現型化する方法を示します。このプラットフォームは、細胞の弾性と粘性の両方の生物物理学的特性を測定しながら、1〜10細胞/秒の中程度のスループットを維持します。
Abstract
細胞の機械的特性は、幹細胞の分化から癌の転移に至るまで、さまざまな生物学的プロセスや疾患に関与しています。原子間力顕微鏡(AFM)やマイクロピペット吸引(MA)など、これらの特性を測定する従来の方法は、細胞の完全な粘弾性応答を反映した豊富な情報をキャプチャします。ただし、これらの方法は非常に低いスループットによって制限されます。リアルタイム変形能サイトメトリー(RT-DC)などのハイスループットアプローチは、細胞の弾性特性のみを反映する単一パラメータ読み出しに制限されることが多いため、限られた機械的情報しか測定できません。これらの方法とは対照的に、メカノノードポアセンシング(mechano-NPS)は、中程度のスループットでセルのマルチパラメータ粘弾性測定を達成するためのギャップを埋める、柔軟でラベルフリーのマイクロ流体プラットフォームです。直流(DC)測定は、マイクロ流体チャネルを通過する細胞を監視し、狭い狭窄を通過する前、最中、および後に細胞のサイズと速度を追跡するために使用されます。この情報(サイズと速度)は、各セルの横方向の変形、変形に対する抵抗、および変形からの回復を定量化するために使用されます。一般に、このエレクトロニクスベースのマイクロ流体プラットフォームは、複数の粘弾性セル特性を提供し、したがって細胞の機械的状態のより完全な全体像を提供します。最小限のサンプル調製で済み、(高速カメラとは対照的に)簡単な電子測定を利用し、標準的なソフトリソグラフィ製造を利用するため、このプラットフォームの実装はシンプルでアクセスしやすく、ダウンストリーム分析に適応できます。このプラットフォームの柔軟性、有用性、感度は、多様な細胞に関する独自の機械的情報を提供し、基礎科学や臨床診断においてさらに多くのアプリケーションの可能性を秘めています。
Introduction
単一セルは動的な粘弾性材料です1。多数の内部および外部プロセス(例えば、有糸分裂の開始または細胞外マトリックス[ECM]のリモデリング)は、それらの構造および組成2,3,4に影響を与え、しばしばそれらの現在の状態を補完する明確な生物物理学的特性をもたらす。特に、機械的特性は、細胞の発生、生理学、および病理学の重要なバイオマーカーであることが示されており、標準的な分子的および遺伝的アプローチを補完できる貴重な定量的情報を生み出しています5、6、7。例えば、Liらは最近、薬剤耐性と薬剤応答性の急性前骨髄球性白血病細胞の機械的な違いを説明し、RNA-seqを使用して発現差のある細胞骨格関連遺伝子を明らかにしました8。単一細胞力学と細胞機能の間の複雑な相互作用を理解することにより、メカノフェノタイピングは基礎科学と臨床診断の変革においてより広い用途を持っています9。
単一細胞の力学を測定するために最も広く採用されているツールは、原子間力顕微鏡(AFM)です。AFMは、細胞の機械的特性の高分解能の局所的な測定を可能にしますが、スループットは<0.01細胞/秒10に制限されています。あるいは、2つの発散レーザービームを使用して吊り下げられた単一細胞11をトラップおよび変形させる光学ストレッチャーは、<1細胞/秒12のわずかに高いスループットに制限される。マイクロ流体技術の最近の進歩により、迅速な単一セルの機械的評価のための新世代のデバイスが可能になりました12,13。これらの技術は、狭い狭窄チャネル14、15、せん断流16、または流体力学的伸張17を使用して、10〜1,000セル/秒18のスループットで細胞を迅速に変形させる。これらのアプローチの測定速度は従来の技術よりもかなり高速ですが、限られた機械的読み出しのために高スループット能力と引き換えによく見られます(補足表1)。前述の迅速なマイクロ流体法はすべて、通過時間や変形可能性比など、細胞の弾性特性のみを反映する基本的な単一パラメータのメトリックに焦点を当てています。しかし、単一細胞の固有の粘弾性性を考えると、細胞の堅牢で徹底的な機械的特性評価には、弾性成分だけでなく粘性応答も考慮する必要があります。
メカノノードポアセンシング(mechano-NPS)2,8(図1A)は、シングルセルメカノフェノタイピングの既存の制限に対処するマイクロ流体プラットフォームです。この方法では、細胞径、相対変形能、変形からの回復時間など、複数の生物物理学的パラメータを同時に測定でき、1〜10細胞/秒の中程度のスループットが得られます。この手法は、ノード細孔センシング(NPS)19,20,21,22,23,24に基づいており、4点プローブ測定を使用して、「ノード」と呼ばれるより広い領域によってセグメント化されたマイクロ流体チャネルを通過するセルによって生成される変調電流パルスを測定します。変調された電流パルスは、セルがセグメント(すなわち「細孔」)およびノード内の電流の流れを部分的に遮断した結果であり、前者では後者よりも多くの電流が遮断される。メカノNPSでは、1つのセグメントである「収縮チャネル」はセル直径よりも狭くなります。したがって、チャネル全体を通過するには、セルが変形する必要があります(図1B)。細胞直径は、細胞が収縮チャネルの前にノード孔を通過するときに生成されるサブパルスの大きさによって決定できます(図1B、C)。ここで、|ΔYnp|は、セルが細孔内にあるときの電流降下であり、細孔に対するセルの体積比、Vセル/V細孔2,8,19に比例します。細胞の剛性は、細胞が収縮チャネルを通過するときに生成される劇的に大きなサブパルスの持続時間であるΔTcによって決定できます(図1B、C)。硬いセルは、柔らかいセルよりもチャネルを通過するのに時間がかかります2,8。最後に、細胞の「回復」、つまり変形後に元のサイズと形状に戻る細胞の能力は、細胞が収縮チャネルの後に節孔を通過するときに生成される一連のサブパルスによって決定できます(図1B、C)。回復時間ΔTrは、セルが圧迫される前に、現在のサブパルスが前のサブパルスの大きさに戻るのにかかる時間です。全体として、セルがマイクロ流体チャネルを通過するときに生成される変調電流パルスが記録され、分析されて、関連する単一セルの機械的パラメータが抽出されます(図1D)2,8。
このエレクトロニクスベースのマイクロ流体プラットフォームの再現性と使いやすさは、以前に実証されています25。さらに、このプラットフォームは、シングルセルメカノフェノタイピングの参入障壁が低い。標準的なソフトリソグラフィは、マイクロ流体デバイスの作製に採用されています。計測ハードウェアは、シンプルなプリント回路基板(PCB)、電源、プリアンプ、データ集録ボード(DAQ)、コンピュータなどの安価なコンポーネントで構成されています。最後に、データの取得と分析にユーザーフレンドリーなコードが用意されているため、簡単に実装できます。このメカノフェノタイピング技術は、非悪性および悪性の乳腺および肺上皮細胞株の集団を区別し、初代ヒト乳腺上皮細胞におけるサブ系統を区別し、細胞骨格摂動および他の薬理学的物質の影響を特徴付けることができる2,8。全体として、このプラットフォームは、単一細胞のメカノフェノタイピングに効果的なアプローチです。
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Protocol
1. デバイス形状の設計
- サイジングセグメントとリカバリセグメントの幅を選択して、測定する最大のセルの直径よりも広く、十分な信号対雑音比(SNR)を維持します。さまざまな細胞株の異なるサイジングおよび回収セグメント幅の例については、 補足表2 を参照してください。
- 収縮セグメント幅を選択して、メカノフェノタイピングを受ける細胞の平均サイズに30%〜40%のひずみを適用します。ひずみは次のように
定義されます。ここで、dはセル直径、wcは収縮チャネル幅2,8です。さまざまな細胞株のさまざまな収縮セグメント幅については、補足表2を参照してください。
注:直径が大きく異なる細胞の種類または条件を比較する場合は、各細胞の種類/条件に固有の収縮セグメント幅で個別のデバイス設計を使用する必要があります。 - 一意のデバイス ジオメトリごとに参照デバイスを設計します。これは、De、マイクロ流体チャネルのサイジング細孔セグメントの有効直径を決定するために必要である。
メモ: 参照デバイスは、プライマリデバイスと同じジオメトリを使用します。唯一の変更は、既知のサイズのポリスチレンビーズによるキャリブレーションを可能にするために、収縮セグメントの幅がサイジング細孔セグメントと等しくなければならないことです。収縮を広げることで、キャリブレーション中にポリスチレンビーズが収縮チャネルを詰まらせるのを防ぎます。キャリブレーションプロセスは、ステップ4.1および5.3.1でさらに説明されています。較正は、市販のセルカウンターを用いても達成することができ、その場合、参照装置は必要ない。このプロセスについては、ステップ 4.2 で説明します。 - 目的の最大のセルが収縮セグメント2内で制限なく完全に伸長できるようにチャネルの高さを選択します。チャネルの高さが hmin
より大きいことを確認します(これは、セルが球面の事前変形であり、変形中にチャネルの長さと高さに沿って等角変形が発生することを前提としています)。
注:電流サブパルスの大きさを考えると、hminが大きいほど、
全体的なSNRは低くなります。 - 選択したチャネル幅のコンピューター支援設計ソフトウェアを使用して、フォトマスクを設計および作成します。サンプル・ファイルは、 補足ファイル 1 にあります。マイクロ流体マスクの設計を1.5%拡大して、ネガマスターから剥離した後のポリジメチルシロキサン(PDMS)収縮を考慮します。
注:アレイ全体がウェーハのサイズを超えない限り、デバイスのアレイを1つのマスクに含めることができます(補足図1A)。 - マイクロ流体デバイス電流の4点プローブ測定を実行するために使用される電極を備えたフォトマスクを設計および作成します(図1D)。サンプル・ファイルは、 補足ファイル 1 にあります。
注意: 電極のアレイは、アレイがスライドガラスのサイズを超えない限り、単一のマスクに含めることができます(補足図1B)。
定義されます。ここで、dはセル直径、wcは収縮チャネル幅2,8です。さまざまな細胞株のさまざまな収縮セグメント幅については、補足表2を参照してください。
より大きいことを確認します(これは、セルが球面の事前変形であり、変形中にチャネルの長さと高さに沿って等角変形が発生することを前提としています)。
全体的なSNRは低くなります。2. デバイスの作製(図2)
- ガラス基板上に電極パターンを作製する。
- 製品データシートに従って、ポジ型フォトレジストを無地のスライドガラスにスピンコート、パターン化、および処理します。この手順の例については、 補足ファイル 2 を参照してください。
- 金属蒸着、リフトオフ、および金エッチングを実行します。
- スライド上に75 Å Ti、250 Å Pt、および250 Å Auの薄膜堆積を行います。電子銃蒸発を使用したこの手順の例は、 補足ファイル3に概説されています。
- スライドをアセトンに15分間浸して、余分な金属をリフトオフします。
- ドラフト内で、補足 図2に示すように、使い捨てピペットを使用して、マイクロ流体チャネルにさらされる電極の領域に金エッチング液をドロップキャストします。スライドの他の場所にエッチング液を落とさないように注意してください。
注意: 金のエッチング液は、皮膚や目の炎症を引き起こす可能性があります。蒸気を吸い込んだり、摂取したりしないでください。取り扱いには注意し、適切な個人用保護具(PPE)を着用し、地域の廃棄規制に従って廃棄物を廃棄してください。 - スライドを脱イオン(DI)水ですすぎ、乾燥窒素(N2)で乾燥させます。
- 同じスライドガラスに複数の電極が印刷されている場合は、スライドを個々のチップにダイスします。
- ガラス切削工具を使用して、パターン化された電極境界に沿ってスライドにスコアを付けます。
- スコアに沿ってガラスを割って、スライドを個々のチップに分割します。
- 顕微鏡で電極を目視検査します。個々の電極が電気的に開いていないこと、または電極が互いに短絡していないことを確認してください。
- チャネル用のネガティブマスターモールドを製作します。
- 製品データシートに従って、研磨されたシリコンウェーハ上にSU-8エポキシレジストをスピンコート、パターン化、および処理します。この手順の例については、 補足ファイル 2 を参照してください。
- プロファイラー(表面形状測定機)を使用して特徴の高さを測定し、顕微鏡下で特徴を視覚的に検査します(補足図3)。目的のジオメトリが適切に定義されていることを確認します。
- ソフトリソグラフィでPDMSチャンネルを成形します。
- 使い捨てカップでエラストマーと架橋剤を10:1の質量比で計量してPDMSを調製します。
注:直径3のウェーハの場合、30gのPDMSで十分です。 - PDMSが気泡で不透明になるまで、使い捨てフォークでPDMSを30秒間激しく混合します。
- 真空チャンバー内でPDMSを約30〜90分間、またはPDMSが透明になり、気泡が見えなくなるまで脱ガスします。
- SU-8マスターモールドを備えたウェーハを使い捨てのペトリ皿に入れ、ウェーハの中央にPDMSを注ぎます。
- PDMSとウェーハが入ったペトリ皿を真空チャンバーに入れ、約30分間、またはPDMSに気泡がなくなるまで脱ガスします。
- PDMSを80°Cでオーブンまたはホットプレートで2時間焼きます。
- 鋭利な刃で、PDMSを切り取り、SU-8ネガティブマスターから取り外します。
- 成形されたPDMSスラブを鋭利な刃を使用して個々の金型にダイスします
- 使い捨ての生検パンチを使用して、入口と出口のアクセス穴をコアします。最良の結果を得るには、PDMSスラブごとに新しいパンチを使用します。より鋭いパンチは滑らかなエッジの穴を生成し、収縮チャネルを塞ぐ可能性のある粒子を最小限に抑えます。
注意: アクセス穴の直径は、チューブの外径よりわずかに小さくする必要があります。たとえば、外径が1/32インチのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)チューブを使用する場合は、1.5mmの穴を開ける必要があります。
- 使い捨てカップでエラストマーと架橋剤を10:1の質量比で計量してPDMSを調製します。
- ガラス/電極基板をPDMSチャネルに接着します。
- 電極ガラススライドをメタノール(≥99.8%)で洗浄します。乾燥N2で乾燥させる。
- PDMSデバイスをスコッチテープで洗浄し、イソプロピルアルコール(IPA)と脱イオン水(DI; 18 MΩ / cm2)ですすいでください。乾燥N2で乾燥させる。次に、もう一度スコッチテープで拭きます。
- プレハブ電極を備えたガラス基板と準備したPDMSモールド(フィーチャー面を上にして)をプラズマクリーナーに入れます。
- 両方を酸素プラズマに2分間さらします(100〜300 mTorr、30 W)。
- PDMSモールドを、フィーチャー側を下向きにして、プレハブ電極を備えたガラス基板上に位置合わせして配置します。
注:プラズマ処理されたPDMSとガラスが接触すると、接合は瞬時に行われます。したがって、それ以上のアライメントの変更はできません。アライメントを容易にするために、DI水中のメタノールの2:1希釈の20 μLをプラズマ処理ガラス表面にピペットで移すことができます。メタノール溶液は、処理されたガラスとPDMSの間の物理的バリアとして機能し、アライメント調整を可能にします。メタノールを使用する場合は、整列して嵌合したデバイスを50°Cで2時間ベークして溶液を蒸発させ、接着プロセスを完了します。 - 接着したデバイスを顕微鏡で目視検査します。電極とチャネルの形状が正しく位置合わせされていることを確認します。
3. 細胞を測定する(図1D)
- 圧力源、PCB、ベンチトップハードウェア、およびデータ収集ソフトウェアを準備します。
- クランプを使用してマイクロ流体デバイスをPCBに接続します。PCBの例は、補足ファイル4(ガーバーファイル)および補足ファイル5(回路図、ボード、およびPCB部品リストファイル)に記載されています。
- クランプのバネ仕掛けのピンをマイクロ流体デバイスの電極コンタクトパッドに合わせ、クランプのヘッダーピンをPCBの穴に合わせます。
- clをしっかりと挿入しますamp のヘッダーピンをPCBの穴に、バネ仕掛けのピンが電極コンタクトパッドと位置合わせされていることを確認します。
- 電子ハードウェアをセットアップして接続します。
- 電源の2つの出力ポートを、ダブルバナナプラグ-バヨネットニールコンセルマン(BNC)メスアダプタとBNCケーブルを使用してPCBの電源電圧ポートに接続します。
- 電源をオンにします。BNCの内部導体に接続されている出力を+15 Vに設定し、もう一方の出力を-15 Vに設定します。
- 電源の出力ポートの3番目をPCBの入力電圧ポートにBNCケーブルで接続します。出力を希望の印加電圧に設定しますが、実験を開始するまで有効にしないでください。
- PCBの出力電流ポートをBNCケーブルで電流プリアンプの入力に接続します。
- 電流プリアンプの出力を、BNCケーブルでデータ集録システムのBNC端子台の1つのアナログ入力に接続します。オプションで、アナログローパスフィルタをBNCケーブルに沿って接続して、高周波干渉を除去します。
メモ: SNR を改善するために、PCB とデバイスは厚い金属製の筐体に収納できます。すべてのBNCケーブルと流体チューブは、エンクロージャにドリルで開けられた穴に通すことができます。
- 必要なソフトウェアをパーソナルコンピュータ(PC)にインストールしてセットアップする
- 電源を入れ、圧力コントローラーをPCに接続します。製造元の指示に従って、必要な圧力コントローラソフトウェアをインストールします。
- MATLABとデータ収集ツールボックスをPCにインストールします。MATLABデータ収集ツールボックスインターフェイスがそれを検出できるように、データ収集システムに必要なドライバがインストールされていることを確認してください。
- 付属のデータ収集スクリプト「NPS.m」を https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public からダウンロードします。
- データ集録スクリプトを開いて設定します。
- 正しい値を設定して、ベンダーID、DAQのデバイスID、アナログ入力チャンネル番号(付属のスクリプトの34〜36行目)を含むデータ集録セッションを初期化します。
注: デバイス ID は、関数 "daq.getDevices" または "daqlist" を使用して見つけることができます。 - 集録に必要なサンプルレートを設定します(付属のスクリプトの23行目)。最適な結果を得るには、少なくとも10kHzに設定する必要があります。
- 正しい値を設定して、ベンダーID、DAQのデバイスID、アナログ入力チャンネル番号(付属のスクリプトの34〜36行目)を含むデータ集録セッションを初期化します。
- クランプを使用してマイクロ流体デバイスをPCBに接続します。PCBの例は、補足ファイル4(ガーバーファイル)および補足ファイル5(回路図、ボード、およびPCB部品リストファイル)に記載されています。
- 細胞懸濁液を調製する。
- 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の2%ウシ胎児血清(FBS)の溶液を調製し、0.22 μmフィルターでろ過します。
- 培養し、選択した細胞株の適切な細胞培養プロトコルに従って細胞を調製する。細胞を1x PBS中の2%FBSの調製溶液に1-5 x 105 細胞/ mLの濃度で懸濁します。実験期間中、細胞を氷上に置いておきます。
- 細胞の物性を測定します。
- セルサンプルをチューブにロードし、デバイスのインレットに接続します。
- かみそりの刃または鋭利なナイフで30cmのPTFEチューブを切ります。
- チューブの一方の端をルアーロックシリンジに取り付けます。シリンジを使用して、細胞サンプルをチューブのもう一方の端に引き込みます。
- チューブをデバイスの入口に慎重に挿入します。
- チューブの反対側の端をマイクロ流体圧力コントローラーに接続します。
注意: マイクロ流体圧力コントローラーとチューブの間にフィルターを追加して、圧力コントローラーへの液体の逆流を防ぐことができます。
- 実験を実行します。
- 圧力コントローラソフトウェアで希望の一定の駆動圧力を設定し、サンプルがデバイスを満たすようにします。
注意: 圧力は通常2〜21 kPaです。流速は、明確に定義されたパルスを可能にするのに十分遅く、適切なスループットを可能にするのに十分な速さでなければなりません。- マイクロ流体チャネルに気泡が形成された場合は、行き止まりの充填を使用します:デバイスの出口を塞ぎ、入口に低圧を加えて、気体透過性PDMSから空気を強制的に排出します。チャネルに気泡を残すと、電流ベースラインが不安定になり、正確な測定が妨げられます。
- 破片がマイクロ流体チャネルを詰まらせた場合は、駆動圧力をかけながらPDMSデバイスの上部を軽く押すか、圧力のオンとオフを切り替えてより高い圧力を「パルス」するか、チューブを取り外して再挿入して、マイクロ流体チャネルを取り除きます。破片が残っている場合は、新しいデバイスに切り替える必要がある場合があります。
- 電圧を回して目的の電圧を設定します ボリューム 電源のノブとボリュームを有効にしますtageを押して オン ボタン。
注意: 電圧は通常1〜5 Vです。 適切なSNRに必要な最低電圧を選択してください。比較するすべての条件で同じ電圧を使用する必要があります。 - 電流プリアンプをオンにし、感度(A / V)をできるだけ低く設定します。あるいは、プリアンプに過負荷をかけたり、DAQの最大アナログ入力電圧を超えたりすることなく、ゲイン(V/A)をできるだけ高く設定することもできます。この研究では、感度を10-7 A / Vに設定しました。
注意: 適切な感度/ゲイン値は、印加電圧とマイクロ流体チャネルのベースライン抵抗の両方に依存します。 - MATLABリボンメニューの緑色の [実行 ]ボタンを押して、データ集録スクリプト NPS.m を開始し、データのサンプリングと保存を開始します。
- 実験を終了するには、図ウィンドウの左下隅にある [停止 ]ボタンを押して、データ集録スクリプトを停止します。Onボタンを押して、電源出力を無効に します 。圧力コントローラソフトウェアで圧力源をゼロ圧力に設定します。
- この時点で、実験を一時停止して、次の 1 つ以上の操作を実行できます。
- 現在のデバイスを新しいデバイスと交換します。
- より多くの細胞サンプルでチューブをリロードします。
注:サンプルの相互汚染を避けるために、新しいデバイスを使用してさまざまなタイプまたは条件のセルを測定します。 - PCBからデバイスのクランプを外し、顕微鏡でチャネルの状態を調べます。同じ装置を使用して実験を再開するには、気泡が発生しないように注意する必要があります。シリンジプランジャーに穏やかな圧力を加えて、細胞サンプルをデバイスの入口に挿入しながらチューブの一番端に保つ必要がある場合があります。
- 圧力コントローラソフトウェアで希望の一定の駆動圧力を設定し、サンプルがデバイスを満たすようにします。
- セルサンプルをチューブにロードし、デバイスのインレットに接続します。
4.マイクロ流体デバイスのキャリブレーション
- オプション1:参照デバイスのポリスチレンビーズを測定します。
- サイジングチャネルよりも小さいポリスチレンビーズサイズを選択してください。
- 細胞実験中に使用したろ過したPBSおよびFBS溶液に、1.5%トゥイーンビーズおよびポリスチレンビーズを1〜3 x 105 ビーズ/mLの濃度で添加します。
- ステップ1.3で説明した参照デバイスを使用して、セクション3で概説されているように実験を進め、実験中に使用したのと同じ電圧を印加します。セクション5で説明したように、ビーズがサイジング細孔を通過するときに生成される電流液滴の平均の大きさとビーズの既知の直径を使用して、 Deを計算します。
- オプション2:別の測定装置でセルサイズを個別に測定します。
- ステップ4.1のプロトコルに従う代わりに、市販の細胞サイズ測定装置を使用して、サンプル中の細胞の平均サイズを測定します。この場合、参照デバイスは必要ありません。セルがサイジング孔を通過するときに生成される平均電流降下と測定された平均セル直径を使用して、セクション5で説明したようにDesを計算します。
5.データを分析して細胞表現型を抽出する
注 : データ処理は、https://github.com/sohnlab/NPS-analysis-JOVE の MATLAB コマンド ライン インターフェイス プログラム ファイル mNPS_procJOVE.m を使用して実行できます。詳細については、補足ファイル 6 を参照してください。
- データを前処理します(図3A)。
- 電流/電圧プリアンプで使用されるゲイン値をDAQによって集録された生データに適用することにより、測定電流を計算します。
- 生電流測定に矩形平滑化機能やローパスフィルタを適用して、高周波ノイズを除去します。次に、フィルタリングされたデータをより低いサンプルレートにリサンプリングします。また、この低いサンプルレートで対応するタイムスタンプデータを計算します。
- 非対称最小二乗平滑化26などの方法を適用して、適合ベースライン電流信号を計算する。
- 後続のデータポイント間の差を取ることにより、前処理された現在のデータの近似一次導関数(差分信号)を計算します。
- セルイベントを特定し、サブパルスデータを抽出します(図3B)。
- 前処理されたデータを調べて、候補セル イベントを検索します。他の細胞イベントと重複する細胞イベント(すなわち、一致イベント)をリジェクトする(補足図4)、ベースライン適合度が低い、または予期しないまたは誤ったパルス形状を有する(例えば、チャネルに詰まりが存在していた可能性がある)。
- 各セルイベントのサブパルスデータを抽出します。
- 各ノードポアセグメントは、信号パルス全体に対応するサブパルスとして表示されます(図1B、C)。差分信号が極小値に達する時点を計算することにより、各サブパルスの開始を特定します。差分信号がローカル最大値に達する時点を計算することにより、各サブパルスの終わりを特定します。
- 各サブパルスの幅を、開始時点と終了時点の間の経過時間として決定します。開始時点と終了時点の間のすべてのデータポイントについて、測定電流とベースライン電流の差の平均を計算することにより、各サブパルスの振幅を決定します。
- サブパルスデータに基づいて、各細胞イベントの細胞メカノフェノタイプを決定します。
- DebloisとBean24によって定義された式に基づいてセル直径dを決定します。
ここで、ΔI/Iはサイジングサブパルスのベースライン電流に対するサブパルス振幅の平均比、Deはチャネルの有効直径(ステップ4で測定)、Lはノードポアチャネルの全長です。- Dleは、既知の直径の粒子のセット(セルまたはビーズのいずれか、ステップ4を参照)によって生成される平均ΔI/Iを計算し、その既知の直径をdとして使用し、Deの式1を解くことによって決定されます。
- 変形に対するセルの抵抗を定量化します。
- 既知のセグメント長と各サブパルスの測定された持続時間を使用して、サイジングサブパルスの平均セル速度を計算することにより、流体速度 Uフロー を決定します。
- Kimら2によって次のように定義された全細胞変形能指数(wCDI)を決定します。
ここで、Lcは収縮セグメントの長さ、hチャネルはチャネルの高さ、ΔTcは収縮サブパルスの持続時間です。
- サイジングサブパルス2からの平均振幅の8%以内の振幅を有する第1の回復サブパルスとして定義される、変形からの細胞の回復時間を特定する。
- 収縮セグメント内のセルの横方向の変形を計算します。
- Kimら2で定義されている収縮セグメントの有効直径(De,c)を計算します:
ここで、w cは収縮セグメントの幅、wnpは他のすべてのセグメントの幅です。 - DebloisとBean24で定義された式を再度使用して、収縮内のセルの等価球直径dcを計算します。
ここで、ΔIc /Icは、収縮サブパルスのベースライン電流に対するサブパルス振幅の比であり、Lcは収縮セグメントの長さです。 - Kimら2で説明されているように、セルの伸長L変形を計算します。
- 最後に、Kim et al.2
によって定義されている変形δセルの横方向の変形を計算します。
- Kimら2で定義されている収縮セグメントの有効直径(De,c)を計算します:
- DebloisとBean24によって定義された式に基づいてセル直径dを決定します。
ここで、w cは収縮セグメントの幅、wnpは他のすべてのセグメントの幅です。
によって定義されている変形δセルの横方向の変形を計算します。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ここで紹介するメカノフェノタイピングプラットフォームは、単一細胞の生物物理学的特性を中程度のスループットで測定するためのシンプルで汎用性の高いアプローチです。細胞は、一定の圧力駆動の流れを使用してマイクロ流体チャネル(図1A)を通って流れます。細胞が通過すると、マイクロ流体チャネルの長さと生成される電流パルスがデータ収集ハードウェアを使用して記録されます。取得した信号(図1B、C)は、MATLABのカスタムソフトウェアを使用して処理され、関連するシングルセルの機械的特性が抽出されます。 図1D は、実験プロトコルのグラフィカルな概要を示しています。
デバイスを製造するために、最初に負のマスターモールドが作成され、PDMSの鋳造に使用されます(図2)。 補足図3に示す成功したマスターモールドには、滑らかな垂直側壁が含まれ、マイクロ流体チャネルに欠陥がありません(図4Ai)。この最初のマスターモールドの製造には、製造が不十分なウェーハ(補足図3)では、欠陥が後続のすべてのPDMSキャスト(図4Aii)に移り、使用できなくなるため、注意が必要です。PDMSキャストが成功すると、パターン化された電極を備えたスライドガラスにプラズマボンディングされます(図1A)。
実験では、デバイスの電極パッドをPCBに接続して(図1D)、電流測定を可能にします。次に、細胞サンプルを含むチューブをデバイスの入口に挿入し、マイクロ流体フローコントローラーに接続して、マイクロ流体チャネルを通る細胞の圧力駆動の流れを可能にします。重要なのは、実験中に現在の測定値のライブ読み出しが表示されることです。これにより、ユーザーはデバイスが意図したとおりに動作していることを確認できます。成功した細胞通過イベントは、簡単に区別できるサブパルスで構成されます(図4Bi)。目詰まりなどの合併症は実験中に発生する可能性があり、異常なパルス形状のイベントのライブ読み出しによって識別できます(図4Bii)。
データ解析のために、各セルトランジットイベントについて抽出する必要がある重要なシグナルパラメータを 図1B に詳述し、ステップ5.2.2で説明します。生の信号は、ノイズを除去して重要な成分を抽出するのに十分なSNRを備えている必要があります(図3A)。重要なのは、各ノードからの電流信号の立ち上がりは、差動信号 ∂I/∂t からサブパルスを簡単に識別できるように十分に堅牢である必要があります(図3B)。
測定された wCDI と回復時間を使用して、細胞または条件を直接比較できます。具体的には、 wCDI は弾性率に反比例するセル剛性の相対的な指標です(補足図5)。したがって、 wCDI のより大きな値は、より柔らかい機械的表現型に対応する。例えば、 図5Aにおいて、悪性MCF-7細胞は、非悪性MCF-10A細胞よりも大きな wCDI 分布を有し、悪性MCF-7細胞がそれらの非悪性MCF-10A対応物よりも柔らかいことを示す。これは、癌細胞が非悪性の対応物よりも柔らかいことを示した多くの実証的研究と一致しています27。同様に、 図5Bにおいて、ラトランクリンで処理したMCF-10AおよびMCF-7細胞は、 wCDIの増加を示す。ラトランクリンは、アクチン細胞骨格を破壊する強力な薬理学的物質である28。その結果、この薬物で処理された細胞において、より大きな wCDI、 したがってより柔らかい表現型を観察することは一貫している。最後に、 図5Cにおいて、wCDI は、2つのヒト乳腺上皮細胞サブ系統、管腔上皮(LEP)および筋上皮(MEP)の間で比較される。この比較では、2つの初代細胞タイプを区別する明確な wCDI 分布が再びあり、LEP細胞がMEP細胞よりも柔らかいことを示しています。 wCDI以外にも、回収時間を定量化して、細胞粘度の相対的な指標を提供することもできます。回復時間が長いほど、表現型がより粘性が高いことを示します。図 5D は、図 5A-C の各条件の回復時間を 3 つの異なるカテゴリに分類して示しています。未処理のMCF-10AおよびMCF-7は、即座に回復する細胞の割合が高く(ΔTr = 0)、ラトランクリン処理された細胞よりも粘度が低いことを示しています。
wCDI と回復時間は、単一細胞の弾力性と粘度の相対的な指標です。したがって、ここで紹介する方法は、関心のある複数のサンプル間の差動応答の特性評価に最も適しています。現在の形式では、ここで提示されたプロトコルは、ヤング率などの定義された機械的パラメータの絶対的な定量化を提供しません。
図1:メカノフェノタイピングプラットフォームの概要。 (A)マイクロ流体デバイスの画像。(B)単一セル通過事象からの代表的な電流パルスを有するチャネル形状。ΔYnpは細孔に入る細胞からの電流降下を表し、ΔIcは収縮に入る細胞からの電流滴を表す。ΔTpは、細胞が細孔を通過するのに必要な時間を表し、ΔTcは、細胞が収縮チャネルを通過するのに必要な時間を表し、ΔTrは、細胞が回復するのに必要な時間を表す。(C)セルトランジットイベントからの実電流パルス。(D)実験ワークフロー:(1)細胞をPBSに懸濁し、(2)マイクロ流体デバイスを一定の圧力で駆動します。細胞がマイクロ流体チャネルを通過するとき、(3)電流パルスはデータ収集ハードウェアを使用して測定されます。(4)電流パルスを分析して、複数の単一セルの機械的特性を抽出します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:デバイス製造の概要 。 (A)ネガマスターモールドは、(1)フォトリソグラフィを用いて作製する。(2)次に、PDMSを負のマスターモールドに鋳造します。(3)成形されたデバイスは、入口と出口の穴が開けられた状態でさいの目に切られます。(B)同時に、スライドガラスを(1)パターニングして金属電極を作製する。(2)電子ビーム蒸着を使用してスライドに金属を堆積させ、続いて(3)リフトオフプロセスを使用して余分な金属を除去し、目的の金属電極を残します。(C)次に、PDMSデバイスと金属電極付きガラスを酸素プラズマを使用して接着し、製造プロセスを完了します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:データ処理と分析 。 (A)生の電流データ(左)は、矩形平滑化機能とローパスフィルターを適用して前処理(右)した後、より低いサンプルレートにリサンプリングします。ベースライン電流信号は、続いて、非対称最小二乗平滑化26をフィッティングする。(B)各サブパルスの開始時と終了時のタイムポイントは、差分信号 ∂I/∂t (左)でそれぞれ極小値と最大値として識別されます。各サブパルスについて、幅 Δt は開始と終了の間の経過時間によって決定され、振幅 ΔI は測定電流とベースライン電流との平均差によって決定される。抽出されたサブパルスデータは、矩形化された信号として表すことができます(右)。各サブパルスは、デバイスジオメトリ内の1つのセグメントに対応します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:製造および実験中の成功した結果と欠陥のある結果の例 。 (A)2つの異なるネガマスターモールドから取得した収縮セグメントのPDMSキャストの画像。(i)は、滑らかな側壁、明確に定義された形状、および目立った欠陥のない、適切に製造されたチャネルの例です。(ii)は、収縮チャネル(赤い長方形で囲まれた)に重大な欠陥があり、粒子の流れを完全にまたは部分的に妨げる(スケールバー= 150μm)製造が不十分なチャネルの例です。(B)データ収集中に「NPS.m」によって生成されるフィルタリングされた電流パルスの例。(i)セルが意図したとおりにチャネルを通過する成功したセルイベントの例。(2)デバイスが「詰まっている」ときに生成される電流パルスの例。この場合、破片がチャネルの第2細孔の細胞の流れを妨げます。これにより、2番目のサイジングパルスの途中で「カットオフ」(赤い線で示される)に見える細胞イベントが発生します。「カットオフ」後の電流の減少(青い線で示されている)は、閉塞の周りに蓄積している粒子(破片またはセル)によって引き起こされ、したがって電流の流れの大部分を遮断しています。電流の急激な下向きのスパイク(緑色の長方形で示されます)は、閉塞の周りを通過できる粒子を反映しているため、電流の大部分を一時的にブロックするだけです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:さまざまな条件間の wCDI と細胞回収の例。 (a)2つの乳房上皮細胞株、非悪性MCF-10A、および悪性MCF-7間のwCDI 分布。(b)MCF-10AまたはMCF-7の wCDI を、各細胞型を未処理とし、Lat-Aで処理し、Lat-Bで処理した。(C)2つの主要なヒト乳腺上皮サブ系統間の wCDI 分布:筋上皮(MEP)および管腔上皮(LEP)細胞。(D)A、B、Cの4つの条件に対応する回復時間、見やすいように回復時間をビン化しました。すべての条件のサンプルサイズはn = 99セルでした。この図は、Kimらの許可を得て複製しています2。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:マイクロ流体チャネルと電極の両方のデバイスアレイの例。 透明マスクとして表される両方の画像は、フォトレジストがUVにさらされる領域では白(透明を表す)で、UV露光から遮断される領域では黒で設計する必要があります。(A)「デバイス」(長方形)ごとに2つの並列チャネルを持つマイクロ流体チャネルのアレイを、3インチのSiウェーハ上に配置します。右端のデバイスには「ref」というラベルが付けられており、手順1.3で説明されているように、キャリブレーションで使用するように設計されています。(B)(A)のデバイス内の両方のチャネルが(B)の各電極設計上で整列するように、デバイスごとに2つの電極を備えた電極のアレイ。このアレイは、スライドガラスで2インチ×3個配置した。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:電極設計の領域と金を正しくエッチングする方法を示す概略図(ステップ2.1.2.3)。金の最上層を測定電極から除去しないと、測定中に生物付着や電気分解が発生します。ただし、ソフトゴールドはポゴピンコネクタのピンとの優れた電気的接続を提供するため、コンタクトパッドに金を残す必要があります。(A)マイクロ流体チャネル(青色)がパターン化された金属(黒色)とどのように交差するかを示す模式図。示されているように、マイクロ流体チャネルに垂直およびその直下の金属は、金をエッチングする必要がある測定電極であり、チャネルの側面にある大きな金属長方形は、金が残っていなければならないコンタクトパッドです。(B)金エッチング液をパターン化された金属に塗布する場所と適用しない場所を示す概略図。緑の領域はエッチングが必要な場所を示し、黄色の領域はエッチングが発生し、デバイスの有効性に影響を与えない場所を示し、赤い領域は金をエッチングしてはならない場所を示します。(C)典型的な、正常にエッチングされたデバイスを示す概略図。黄色は金がまだ存在する領域を示し、灰色は白金層が露出している領域を示します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:収縮チャネルの作製が成功した画像と作製が不十分であった画像。 (A)2つの個別のSiウェーハからの負のマスターモールド上の収縮チャネルの画像。(i) 図4Aiに示すような理想的なPDMSチャネルを生成する、適切に製造されたマスターモールドの例。(ii) 図4Aiiに示すPDMSチャネルを作成するために使用された、製造が不十分なマスターモールドの例。赤い長方形で輪郭が描かれた領域は、 図4Aiiに示す欠陥に対応し、マスターモールドからPDMSマイクロチャネル(スケールバー= 150μm)への欠陥の移行を示しています。(B)PDMS収縮チャネルの断面の画像で、さまざまな金型の高さと幅を示しています。これらの断面は、PDMS収縮流路を流れ方向に垂直にスライスすることによって取得された。(i)(Ai)に示すウェーハを用いて作製したPDMSモールドの例で、平滑な垂直側壁を示す。(ii)(Aii)に示すウェーハを用いて作製したPDMSモールドの作製不良例で、側壁の傾斜(スケールバー=20μm)を示す。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図4:一致セルイベントの例(複数のセルが一度にチャネルを通過している場合に生成されます)。 信号は、プロトコルのセクション5のステップ5.1.1-5.1.3に従って処理されました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図5:wCDIと弾性率20,29,30,31,32,33,34,35の関係。(A)この技術によって測定されたJurkat、MCF7、およびMCF10A細胞とマイクロピペット吸引の比較。wCDIは皮質緊張に反比例する。(B)この技術によって測定されたMCF7およびMCF10A細胞と公表されたAFMデータの比較。(C)この技術で測定したA549およびBEAS-2B細胞と公開されたAFMデータの比較。複数の細胞タイプにわたって、wCDIは弾性率に反比例します。この図は、Kimらの許可を得て複製されています2。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表1:シングルセルメカノフェノタイピング技術の例と、それらがメカノNPSとどのように比較されるか。テクニックは、スループットを増加させる順にリストされています12、2、36、37。機械的情報とは、デバイスが各セルの弾性および粘性の両方の機械的特性を測定できるかどうかを指します。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表2:異なる細胞株のサイジング、収縮、および回収セグメント幅の例。 MEPおよびLEPは、初代ヒト乳腺上皮細胞の2つの系統を指し、MEPは筋上皮細胞を指し、LEPは管腔上皮細胞を指す2,8。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 1: AutoCAD の設計例。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:フォトリソグラフィ処理のプロトコル例。 フォトレジストまたはSU-8エポキシのパターニングと処理のための2つのサンプルプロトコルが概説されています。1つ目は、電極製造のための犠牲層として機能するスライドガラス上のポジ型フォトレジストの適用について説明しています。2つ目は、シリコンウェーハ上にSU-8エポキシを塗布して、PDMSマイクロ流体チャネルを成形するためのレリーフ構造を作成することです。これらのプロトコルは、製造元のMF-321およびSU8 3000データシートから採用されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル3:電子ビーム蒸着を使用した75 Å Ti、250 Å Pt、および250 Å Auの薄膜堆積のプロトコル例。 電子ビーム蒸発器を用いて75ÅTi、250ÅPt、および250ÅAuの薄膜堆積を行うためのプロトコル例が概説されている。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル4:ガーバーファイル このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル5:回路図、基板、およびPCB部品リストファイル このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 6: MATLAB コマンド ライン インターフェイス。 このファイルには、MATLABコマンドラインインターフェイス26を使用したデータ処理の詳細な手順が含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このメカノフェノタイピング技術を使用した単一細胞の機械的特性の測定は、デバイス製造、データ取得、およびデータ分析の3つの段階で構成されています。各段階では、実験結果に大きな影響を与える可能性のある注目すべき側面があります。デバイスの製造時には、正確で再現性のある結果を得るには、一貫したチャネル形状とデバイス間の均一性が不可欠です。具体的には、各デバイスの側壁は比較的滑らかでなければならず(図4Ai)、複製デバイス間のチャネルの高さは同等でなければなりません。特に収縮チャネル(図4Aii)において、細胞の流れを部分的に妨げる欠陥のあるデバイスは廃棄する必要があります。チャネル形状に識別可能な欠陥があるデバイスを使用すると、不正確で再現性のない結果になります。データ収集中、データ収集中にユーザーがチャネル内の詰まりの存在を認識できることが重要です。サンプルスクリプト「NPS.m」(https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public で入手可能)は、現在の測定値を表示し、ユーザーがチャネルの状態とセル通過イベントをリアルタイムで監視できるようにします。目詰まりに特徴的なパルスを図4Bに示します。一部の細胞が流れることを可能にする収縮チャネル内の詰まりは、細胞が閉塞の場所で緊張を増加させ、不正確な wCDIをもたらすため、対処することが特に重要です。最後に、データ分析中、ユーザーは分析アルゴリズムの入力として正確なしきい値を熱心に選択する必要があります。しきい値の設定が高すぎると、プログラムはより小さなセルによって生成されたイベントを識別せず、結果を歪め、測定されたセル集団を誤って表示します。
これらの重要な段階を超えて、さまざまな細胞タイプまたは条件を研究するときに調整が必要になる可能性のあるプロトコルの追加の側面があります。たとえば、以前に研究されたものよりも大幅に小さいサンプルにこの手法を適用するには、より狭い収縮チャネルが必要になります。より狭いチャネルを製造することは、電子ビームリソグラフィ38のようなより高価な製造方法論を必要とするかもしれない。さらに、ΔI/I~Δ Vセル/Δ V収縮(VセルとV収縮はそれぞれ変形したセルとチャネルの体積)であるため、チャネルが狭いとベースライン抵抗が大きくなり、SNR19が低下します。最後に、狭いチャネルは目詰まりのリスクを高め、実験の実行をより困難にする可能性があります。この特定の問題は、より多くのインレットフィルターを利用することで軽減できる可能性があります。
この手法の1つの制限は静的収縮チャネルであり、これは細胞の集団に単一の平均株しか適用できない。サイズの異なる細胞の変形能を比較したり、異なる適用株での単一細胞集団を調査したりするには、収縮チャネル幅が異なる複数のデバイスを使用する必要があります。プラットフォームは、測定できる剛性の範囲を制限するPDMS壁によっても制限されます。たとえば、一部の非常に硬い植物細胞は、それらを変形させると予想されるPDMS壁よりも硬い39,40です。さらに、このような硬い粒子を収縮チャネルに押し込むために必要な圧力は、PDMSとスライドガラスとの間の結合の強度を克服し、層間剥離につながる可能性があります。ただし、マイクロ流体チャネルをガラスやシリコンなどのより硬い材料に製造して、これらの制限を克服することができます。これらの小さな制約にもかかわらず、このプラットフォームは細胞の中程度のスループットの機械的測定に理想的です。光学ストレッチャーやAFMなどの他の方法論と比較して、この技術はより高いスループットを可能にします。RT-DCなどの他の中スループットから高スループットのマイクロ流体技術と比較して、この技術は、単一細胞の粘性特性と弾性特性の両方を測定することにより、より多くの生物物理学的特性を調べることができます。最後に、複雑な光学系とは対照的に安価な電子機器を利用する単純な実験セットアップにより、この技術は非常にアクセスしやすい技術になります。
全体として、このメカノフェノタイピング技術は、多くの潜在的な研究やアプリケーションのツールとして非常に有望です。これは以前、一次サンプルを含む多様な細胞タイプに適用されており、細胞の粘弾性特性に対する細胞骨格および核成分の影響を測定する上での有効性を示しています2,8。さらに、このプラットフォーム2でスクリーニングした後も細胞は生存し続けるため、研究者はダウンストリーム分析を実行する機会があります。このプラットフォームは、上流のマイクロ流体細胞ソーティングとの結合にも最適であり、循環腫瘍細胞の測定などのアプリケーションに適しています。将来を見据えて、このプラットフォームは、単一細胞の多変量機械的測定のための競争力のある汎用性の高いツールであり続け、細胞の挙動の理解41、疾患の進行の決定42、および薬物反応のモニタリング43に応用されています。この技術は、基礎的な科学的研究を超えて、臨床ツール、特に迅速な診断スクリーニングのための低コストのベンチトッププラットフォームとしても大きな期待を寄せています。さらに、低消費電力要件と測定前のサンプル前処理の必要性が最小限であることを考えると、この手法は、アクセス可能な診断機器が切実に必要とされる低リソース環境に特に適しています44。
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Disclosures
L. L. Sは、2022年7月12日に発行された米国特許第11,383,241号「メカノノードポアセンシング」、J.キム、S.ハン、L.L.ソンを保有しています。
Acknowledgments
本研究は、NIBIB 1R01EB024989-01およびNCI 1R01CA190843-01からの助成金によって支援されました。A.L.とR.R.は、H2H8協会大学院研究フェローシップの支援を受けました。KLCは、国立科学財団大学院研究フェローシップとシーベル奨学生フェローシップによってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | J.T. Baker | 5356-05 | Purity (GC) ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker) |
| Aluminum Foil | n/a | n/a | |
| Analog Low-Pass Filter | ThorLabs | EF504 | ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0) |
| Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25) |
| Blade | n/a | n/a | |
| BNC Cable | Pomona Electronics | 2249-C-12 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_ medium=cpc&utm_campaign= Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term= &utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs w-EALw_wcB |
| Cleanroom Polyester Swab | Thermo Fisher Scientific | 18383 | https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383 |
| Current Preamplifier | DL Instruments | 1211 | https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_ id=1419 |
| Custom PCB (w/ components) | n/a | n/a | see Supplemental files 4 and 5 |
| DAQ Terminal Block | National Instruments | BNC-2120 | https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html |
| DAQ to BNC-2110 cable | National Instruments | SHC68-68-EPM | https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html |
| Data Acquisition Board (DAQ) | National Instruments | PCI-6251 | https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html |
| Dessicator | Thermo Fisher Scientific | 5311-0250 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250 |
| Female BNC To Banana Plug Adapter | Pomona Electronics | 72909 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-186 | https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs |
| Glass Cutter | Chemglass | CG-1179-21 | https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips |
| Gold Etchant TFA | Transene | NC0977944 | https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944 |
| Hot Plate | Thermo Fisher Scientific | SP131825 | |
| Isopropyl Alcohol | Spectrum Chemical | I1056-4LTPL | Purity (GC) ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056) |
| Metal Hardware Enclosure | Hammond Manufacturing | EJ12126 | https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Purity (GC) ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561) |
| MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/mf-321/ |
| MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist | DuPont | n/a | https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/ |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049 |
| Photomask | Fineline Imaging | n/a | Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/) |
| Plain Glass Microscope Slide | Fisher Scientific | 12-553-5B | Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/ |
| Plastic Petri Dish | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712) |
| Pressure Controller | Fluigent | MFCS-EZ | https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/ |
| Pressure Controller Software | Fluigent | MAESFLO | |
| Programming & Computation Software | MATLAB | R2021b | for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html) |
| PTFE Tubing | Cole Parmer | 06417-31 | 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731) |
| Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter | Millapore Sigma | PHCC20060 | https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060 |
| Silicon Wafer | Wafer World | 2885 | 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885) |
| Spin Coater | n/a | n/a | |
| SU-8 3025 Negative Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-2000/ |
| SU8 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-developer/ |
| Sygard 184 Polydimethlysiloxane | Dow Chemical | 4019862 | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Tape | Scotch | 810-341296 | https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid= Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO 2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB |
| Titanium, Platinum, Gold | n/a | n/a | |
| Triple Output Power Supply | Keysight | E36311A | https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653 |
| UV Mask Aligner | Karl Suss America | MJB3 Mask Aligner |
References
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