Summary
여기에 제시된 것은 mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)라고하는 전자 기반 미세 유체 플랫폼을 사용하여 단일 세포를 기계적으로 표현형하는 방법입니다. 이 플랫폼은 1-10 cells/s의 적당한 처리량을 유지하면서 세포의 탄성 및 점성 생물물리학적 특성을 모두 측정합니다.
Abstract
세포의 기계적 특성은 줄기 세포 분화에서 암 전이에 이르기까지 다양한 생물학적 과정과 질병에 관여합니다. 원자력 현미경 (AFM) 및 마이크로 피펫 흡인 (MA)과 같은 이러한 특성을 측정하는 기존의 방법은 세포의 전체 점탄성 반응을 반영하여 풍부한 정보를 캡처합니다. 그러나 이러한 방법은 처리량이 매우 낮기 때문에 제한됩니다. 실시간 변형성 세포분석(RT-DC)과 같은 고처리량 접근 방식은 종종 세포의 탄성 특성만 반영하는 단일 파라미터 판독값으로 제한되기 때문에 제한된 기계적 정보만 측정할 수 있습니다. 이러한 방법과 달리 메카노-노드-기공 감지(mechano-NPS)는 중간 처리량으로 세포의 다중 파라미터 점탄성 측정을 달성하는 데 있어 격차를 해소하는 유연하고 비표지 미세유체 플랫폼입니다. 직류(DC) 측정은 세포가 미세유체 채널을 통과할 때 세포를 모니터링하여 좁은 수축을 통과하기 전, 도중 및 후에 세포의 크기와 속도를 추적하는 데 사용됩니다. 이 정보(즉, 크기 및 속도)는 각 셀의 횡방향 변형, 변형에 대한 저항 및 변형으로부터의 회복을 정량화하는 데 사용됩니다. 일반적으로이 전자 기반 미세 유체 플랫폼은 여러 점탄성 세포 특성을 제공하므로 세포의 기계적 상태를보다 완벽하게 파악할 수 있습니다. 최소한의 샘플 준비가 필요하고 간단한 전자 측정(고속 카메라와 달리)을 활용하며 표준 소프트 리소그래피 제조를 활용하기 때문에 이 플랫폼의 구현은 간단하고 액세스 가능하며 다운스트림 분석에 적용할 수 있습니다. 이 플랫폼의 유연성, 유용성 및 감도는 다양한 범위의 세포에 대한 고유한 기계적 정보를 제공했으며 기초 과학 및 임상 진단 분야에서 더 많은 응용 분야를 지원할 수 있습니다.
Introduction
단일 세포는 역동적이고 점탄성 재료입니다1. 다수의 내부 및 외부 과정 (예 : 유사 분열의 발병 또는 세포 외 기질 [ECM]의 리모델링)은 구조와 구성 2,3,4에 영향을 미치며 종종 현재 상태를 보완하는 뚜렷한 생물 물리학 적 특성을 초래합니다. 특히, 기계적 특성은 세포 발달, 생리학 및 병리학의 중요한 바이오마커로 나타났으며, 표준 분자 및 유전적 접근 5,6,7을 보완할 수 있는 귀중한 정량적 정보를 산출합니다. 예를 들어, Li 등은 최근 약물 내성 및 약물 반응성 급성 전골수성 백혈병 세포 사이의 기계적 차이를 설명하면서 RNA-seq를 사용하여 차등적으로 발현된 세포골격 관련 유전자8를 밝혀냈습니다. 단일 세포 역학과 세포 기능 간의 복잡한 상호 작용을 이해함으로써 기계 분석은 기초 과학 및 임상 진단을 변화시키는 데 더 광범위하게 적용됩니다9.
단일 세포 역학을 측정하기 위해 가장 널리 채택되는 도구는 원자력 현미경(AFM)입니다. AFM은 세포 기계적 특성의 고분해능, 국부적 인 측정을 가능하게하지만 <0.01 cells/s10의 처리량으로 제한됩니다. 대안적으로, 부유된 단일 세포(11)를 포획하고 변형시키기 위해 2개의 발산 레이저 빔을 사용하는 광학 들것은 <1 cell/s(12)의 약간 더 높은 처리량으로 제한된다. 최근 미세유체 기술의 발전으로 신속한 단일 세포 기계적 평가를 위한 차세대 장치가 가능해졌습니다12,13. 이들 기술은 좁은 수축 채널(14,15), 전단 흐름(16) 또는 유체역학적 스트레칭(17)을 사용하여 10-1,000 cells/s(18)의 처리량으로 세포를 신속하게 변형시킨다. 이러한 접근 방식의 측정 속도는 기존 기술보다 훨씬 빠르지만 제한된 기계적 판독을 위해 높은 처리량 기능을 교환하는 경우가 많습니다(보충 표 1). 앞서 언급한 모든 신속한 미세유체 방법은 세포의 탄성 특성만 반영하는 이동 시간 또는 변형성 비율과 같은 기본 단일 매개변수 메트릭에 중점을 둡니다. 그러나 단일 세포의 고유 점탄성 특성을 고려할 때 세포의 견고하고 철저한 기계적 특성화에는 탄성 성분뿐만 아니라 점성 반응도 고려해야 합니다.
Mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) 2,8 (그림 1A)은 단일 세포 Mechanophenotyping의 기존 한계를 해결하는 미세 유체 플랫폼입니다. 이 방법을 사용하면 세포 직경, 상대 변형성 및 변형 후 회복 시간을 포함한 여러 생물물리학적 매개변수를 동시에 측정할 수 있으며 1-10 cells/s의 적당한 처리량으로 측정할 수 있습니다. 이 기술은 노드 기공 감지 (NPS) 19,20,21,22,23,24를 기반으로하며, 여기에는 4 점 프로브 측정을 사용하여 "노드"라고하는 더 넓은 영역으로 분할 된 미세 유체 채널을 통과하는 세포에 의해 생성 된 변조 전류 펄스를 측정하는 것이 포함됩니다. 변조된 전류 펄스는 셀이 세그먼트(즉, "기공") 및 노드에서 전류의 흐름을 부분적으로 차단한 결과이며, 후자보다 전자에서 더 많은 전류가 차단됩니다. mechano-NPS에서 하나의 세그먼트 인 "수축 채널"은 셀 직경보다 좁습니다. 결과적으로 셀은 전체 채널을 통과하기 위해 변형되어야 합니다(그림 1B). 셀 직경은 셀이 수축 채널 이전에 노드 기공을 통과할 때 생성되는 서브펄스의 크기에 의해 결정될 수 있습니다(그림 1B,C). 여기서, |ΔIenp|, 즉 세포가 기공 내에 있을 때의 전류 강하는 기공에 대한 세포의 부피비, V cell/V기공 2,8,19에 비례한다. 세포 강성은 세포가 수축 채널을 통과할 때 생성되는 극적으로 더 큰 서브펄스의 지속시간인 ΔTc에 의해 결정될 수 있다(도 1B,C). 더 단단한 셀은 부드러운 셀보다 채널을 통과하는 데 더 오래 걸립니다 2,8. 마지막으로, 변형 후 원래 크기와 모양으로 돌아가는 세포의 능력인 셀 "회복"은 세포가 수축 채널 후 노드 기공을 통과할 때 생성되는 일련의 서브펄스에 의해 결정될 수 있습니다(그림 1B,C). 회복 시간 ΔTr은 셀이 압착되기 전에 현재 서브 펄스가 이전 서브 펄스의 크기로 돌아가는 데 걸리는 시간입니다. 전반적으로, 세포가 미세유체 채널을 통과할 때 생성된 변조 전류 펄스를 기록하고 분석하여 관련 단일 세포 기계적 파라미터를 추출합니다(그림 1D)2,8.
이 전자 기반 미세 유체 플랫폼의 재현성 및 사용 용이성은 이전에 입증되었습니다25. 또한 이 플랫폼은 단일 셀 기계형 분석을 위한 진입 장벽이 낮습니다. 표준 소프트 리소그래피는 미세 유체 장치를 제조하는 데 사용됩니다. 측정 하드웨어는 간단한 인쇄 회로 기판(PCB), 전원 공급 장치, 프리앰프, 데이터 수집 보드(DAQ) 및 컴퓨터를 포함한 저렴한 구성 요소로 구성됩니다. 마지막으로, 사용자 친화적인 코드를 데이터 수집 및 분석에 사용할 수 있으므로 간단하게 구현할 수 있습니다. 이 기계 형 분석 기술은 비 악성 및 악성 유방 및 폐 상피 세포주의 집단을 구별하고, 일차 인간 유방 상피 세포의 하위 계통을 구별하고, 세포 골격 섭동 및 기타 약리학 적 제제의 효과를 특성화 할 수 있습니다 2,8. 전반적으로이 플랫폼은 단일 세포의 기계 성형을위한 효과적인 접근 방식입니다.
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Protocol
1. 장치 형상 설계
- 측정할 가장 큰 셀의 직경보다 넓지만 충분한 신호 대 잡음비(SNR)를 유지하도록 크기 조정 및 복구 세그먼트의 너비를 선택합니다. 다양한 세포주에 대한 다양한 크기 조정 및 복구 세그먼트 너비의 예는 보충 표 2 를 참조하십시오.
- 수축 세그먼트 너비를 선택하여 기계 성형 수술을 받을 세포의 평균 크기에 30%-40% 변형을 적용합니다. 변형률은 로
정의되며, 여기서 d는 세포 직경이고 wc는 수축 채널 폭 2,8이다. 다양한 세포주에 대한 상이한 수축 세그먼트 폭에 대해서는 보충 표 2를 참조한다.
참고: 직경이 실질적으로 다른 셀 유형 또는 조건을 비교하려면 각 셀 유형/조건에 특정한 수축 세그먼트 너비와 함께 별도의 장치 설계를 사용해야 합니다. - 각각의 고유한 장치 형상에 대한 참조 장치를 설계합니다. 이는 마이크로유체 채널의 사이징 공극 세그먼트의 유효 직경인 Die를 결정하는데 필요하다.
참고: 참조 장치는 기본 장치와 동일한 형상을 사용합니다. 유일한 수정은 수축 세그먼트가 알려진 크기의 폴리스티렌 비드로 교정할 수 있도록 사이징 공극 세그먼트와 너비가 같아야 한다는 것입니다. 수축을 넓히면 폴리스티렌 비드가 교정 중에 수축 채널을 막는 것을 방지할 수 있습니다. 교정 프로세스는 4.1단계 및 5.3.1단계에서 자세히 설명합니다. 교정은 또한 상업적으로 이용 가능한 셀 카운터를 사용하여 달성 될 수 있으며,이 경우 기준 장치가 필요하지 않습니다. 이 프로세스는 4.2단계에서 설명합니다. - 관심있는 가장 큰 세포가 수축 세그먼트2 내에서 제한없이 완전히 신장될 수 있도록 채널 높이를 선택하십시오. 채널 높이가 hmin
보다 큰지 확인합니다(셀이 구형 사전 변형이고 변형 중에 채널 길이와 높이를 따라 등척성 변형이 발생한다고 가정).
참고 : 전류 서브 펄스
의 크기를 감안할 때 hmin 이 클수록 전체 SNR이 낮아집니다. - 선택한 채널 너비로 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어를 사용하여 포토마스크를 설계하고 생성합니다. 예제 파일은 보충 파일 1에 제공됩니다. 네거티브 마스터에서 박리한 후 폴리디메틸실록산(PDMS) 수축을 설명하기 위해 마이크로유체 마스크 디자인을 1.5% 스케일링합니다.
참고: 전체 어레이가 웨이퍼의 크기를 초과하지 않는 한 단일 마스크에 장치 어레이를 포함할 수 있습니다(보충 그림 1A). - 미세유체 소자 전류의 4점 프로브 측정을 수행하는 데 사용할 전극이 있는 포토마스크를 설계하고 만듭니다(그림 1D). 예제 파일은 보충 파일 1에 제공됩니다.
알림: 어레이가 유리 슬라이드의 크기를 초과하지 않는 한 단일 마스크에 전극 어레이를 포함할 수 있습니다(보충 그림 1B).
정의되며, 여기서 d는 세포 직경이고 wc는 수축 채널 폭 2,8이다. 다양한 세포주에 대한 상이한 수축 세그먼트 폭에 대해서는 보충 표 2를 참조한다.
보다 큰지 확인합니다(셀이 구형 사전 변형이고 변형 중에 채널 길이와 높이를 따라 등척성 변형이 발생한다고 가정).
의 크기를 감안할 때 hmin 이 클수록 전체 SNR이 낮아집니다.2. 장치 제작(그림 2)
- 유리 기판에 전극 패턴을 준비하십시오.
- 스핀 코팅, 패턴 및 제품 데이터 시트에 따라 일반 유리 슬라이드에 포지티브 포토레지스트를 처리합니다. 이 절차의 예는 보충 파일 2에 요약되어 있습니다.
- 금속 증착, 리프트 오프 및 금 에칭을 수행합니다.
- 슬라이드에 75 Å Ti, 250 Å Pt 및 250 Å Au의 박막 증착을 수행합니다. 전자총 증발을 사용하는 이 절차의 예는 보충 파일 3에 요약되어 있습니다.
- 슬라이드를 아세톤에 15분 동안 담그면 과도한 금속이 들어 올려집니다.
- 흄 후드에서 일회용 피펫을 사용하여 보충 그림 2와 같이 미세 유체 채널에 노출될 전극 영역에 금 에천트를 드롭캐스트합니다. 슬라이드의 다른 곳에 에천트를 떨어뜨리지 않도록 주의하십시오.
주의: 금 에천트는 피부와 눈에 자극을 줄 수 있습니다. 증기를들이 마시지 말고 섭취하지 마십시오. 주의해서 취급하고 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하고 현지 폐기 규정에 따라 폐기물을 폐기하십시오. - 슬라이드를 탈이온수(DI)로 헹구고 건조 질소(N2)로 건조시킵니다.
- 동일한 유리 슬라이드에 여러 전극이 인쇄된 경우 슬라이드를 개별 칩에 깍둑썰기합니다.
- 유리 절삭 공구를 사용하여 패턴화된 전극 경계를 따라 슬라이드에 점수를 매깁니다.
- 악보를 따라 유리를 깨서 슬라이드를 개별 칩으로 나눕니다.
- 현미경으로 전극을 육안으로 검사하십시오. 개별 전극이 전기적으로 열려 있지 않거나 전극이 함께 단락되지 않았는지 확인하십시오.
- 채널에 대한 네거티브 마스터 몰드를 제작합니다.
- 제품 데이터 시트에 따라 SU-8 에폭시 레지스트를 연마된 실리콘 웨이퍼에 스핀 코팅, 패턴 및 처리합니다. 이 절차의 예는 보충 파일 2에 요약되어 있습니다.
- 프로파일로미터를 사용하여 피처 높이를 측정하고 현미경으로 피처를 육안으로 검사합니다(보충 그림 3). 원하는 지오메트리가 잘 정의되어 있는지 확인합니다.
- 부드러운 리소그래피로 PDMS 채널을 성형합니다.
- 일회용 컵에서 엘라스토머와 가교결합제를 10:1 질량비로 칭량하여 PDMS를 준비합니다.
참고: 직경이 3인 웨이퍼의 경우 30g의 PDMS로 충분합니다. - PDMS가 거품으로 불투명해질 때까지 일회용 포크로 PDMS를 30초 동안 격렬하게 혼합합니다.
- 진공 챔버에서 약 30-90분 동안 또는 PDMS가 눈에 보이는 기포 없이 투명해질 때까지 PDMS를 탈기합니다.
- SU-8 마스터 몰드가 있는 웨이퍼를 일회용 페트리 접시에 넣고 웨이퍼 중앙에 PDMS를 붓습니다.
- PDMS와 웨이퍼가 들어 있는 페트리 접시를 진공 챔버에 넣고 약 30분 동안 또는 PDMS에 기포가 남지 않을 때까지 가스를 제거합니다.
- PDMS를 80°C에서 오븐 또는 핫플레이트에서 2시간 동안 굽습니다.
- 날카로운 날로 SU-8 네거티브 마스터에서 PDMS를 자르고 제거하십시오.
- 날카로운 칼날을 사용하여 성형된 PDMS 슬래브를 개별 주형으로 깍둑썰기합니다.
- 일회용 생검 펀치를 사용하여 입구 및 출구 접근 구멍을 코어에 넣습니다. 최상의 결과를 얻으려면 각 PDMS 슬래브에 새 펀치를 사용하십시오. 더 날카로운 펀치는 가장자리가 매끄러운 구멍을 생성하여 수축 채널을 방해할 수 있는 미립자를 최소화합니다.
알림: 액세스 구멍의 직경은 튜브의 외부 직경보다 약간 작아야 합니다. 예를 들어, 외경이 1/32인치인 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 튜브를 사용하는 경우 1.5mm 구멍을 펀칭해야 합니다.
- 일회용 컵에서 엘라스토머와 가교결합제를 10:1 질량비로 칭량하여 PDMS를 준비합니다.
- 유리/전극 기판을 PDMS 채널에 접합합니다.
- 전극 유리 슬라이드를 메탄올(≥99.8%)로 청소합니다. 건조한 N2로 건조하십시오.
- 스카치 테이프로 PDMS 장치를 청소한 다음 이소프로필 알코올(IPA)과 탈이온수(DI; 18MΩ/cm2)로 헹굽니다. 건조한 N2로 건조하십시오. 그런 다음 스카치 테이프로 한 번 더 청소하십시오.
- 조립식 전극이 있는 유리 기판과 준비된 PDMS 몰드(피처 면이 위로 향함)를 플라즈마 클리너에 넣습니다.
- 둘 다 산소 플라즈마에 2분 동안 노출시킵니다(100-300mTorr, 30W).
- PDMS 몰드를 형상 면이 아래를 향하도록 정렬하고 조립식 전극이 있는 유리 기판에 놓습니다.
참고: 접합은 플라즈마 처리된 PDMS와 유리가 접촉하면 즉각적입니다. 따라서 추가 정렬 수정이 불가능합니다. 정렬을 용이하게 하기 위해, DI 물에서 메탄올의 2:1 희석액 20μL를 플라즈마 처리된 유리 표면 상에 피펫팅할 수 있다. 메탄올 용액은 처리된 유리와 PDMS 사이의 물리적 장벽 역할을 하여 정렬 조정을 허용합니다. 메탄올을 사용하는 경우 정렬되고 결합된 장치를 50°C에서 2시간 동안 베이킹하여 용액을 증발시키고 접합 공정을 완료합니다. - 현미경으로 접합 된 장치를 육안으로 검사하십시오. 전극과 채널 형상이 올바르게 정렬되었는지 확인하십시오.
3. 세포 측정(그림 1D)
- 압력 소스, PCB, 벤치탑 하드웨어 및 데이터 수집 소프트웨어를 준비합니다.
- 클램프를 사용하여 미세 유체 장치를 PCB에 연결합니다. PCB의 예는 보충 파일 4(GERBER 파일) 및 보충 파일 5(회로도, 보드 및 PCB 부품 목록 파일)에 제공됩니다.
- 클램프의 스프링 장착 핀을 미세 유체 장치의 전극 접촉 패드에 맞추고 클램프의 헤더 핀을 PCB의 구멍에 맞춥니다.
- 클램프의 헤더 핀을 PCB 구멍에 단단히 삽입하여 스프링 장착 핀이 전극 접촉 패드와 정렬되어 있는지 확인합니다.
- 전자 하드웨어를 설정하고 연결합니다.
- 이중 바나나 플러그-베이요넷 Neill-Concelman(BNC) 암 어댑터와 BNC 케이블을 사용하여 전원 공급 장치의 출력 포트 2개를 PCB의 공급 전압 포트에 연결합니다.
- 전원 공급 장치를 켭니다. BNC의 내부 컨덕터에 연결된 출력을 +15V로 설정하고 다른 출력을 -15V로 설정합니다. 두 출력을 모두 활성화하여 회로에 전원을 공급합니다.
- 전원 공급 장치의 출력 포트 중 세 번째를 BNC 케이블을 사용하여 PCB의 입력 전압 포트에 연결합니다. 출력을 원하는 인가 전압으로 설정하되 실험을 시작할 때까지 활성화하지 마십시오.
- PCB의 출력 전류 포트를 연결합니다.ampBNC 케이블을 사용하여 전류 전치 증폭기의 입력에.
- BNC 케이블을 사용하여 전류 전치 증폭기의 출력을 데이터 수집 시스템의 BNC 터미널 블록에 있는 하나의 아날로그 입력에 연결합니다. 선택적으로 아날로그 저역 통과 필터를 BNC 케이블과 나란히 연결하여 고주파 간섭을 필터링합니다.
참고: SNR을 개선하기 위해 PCB 및 장치를 두꺼운 금속 인클로저 내에 보관할 수 있습니다. 모든 BNC 케이블과 유체 튜브는 인클로저에 뚫린 구멍을 통해 배선할 수 있습니다.
- 개인용 컴퓨터(PC)에 필요한 소프트웨어 설치 및 설정
- 전원을 켜고 압력 컨트롤러를 PC에 연결합니다. 제조업체의 지침에 따라 필요한 압력 컨트롤러 소프트웨어를 설치합니다.
- PC에 MATLAB과 데이터 수집 툴박스를 설치합니다. MATLAB 데이터 수집 툴박스 인터페이스가 이를 감지할 수 있도록 데이터 수집 시스템에 필요한 드라이버가 설치되어 있는지 확인하십시오.
- https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public 에서 포함된 데이터 수집 스크립트 "NPS.m"을 다운로드합니다.
- 데이터 수집 스크립트를 열고 구성합니다.
- 벤더 ID, DAQ의 디바이스 ID, 아날로그 입력 채널 번호 (포함된 스크립트의 34-36행 포함)를 포함하는 데이터 수집 세션을 초기화하려면 올바른 값을 설정하십시오.
참고: 장치 ID는 "daq.getDevices" 또는 "daqlist" 함수를 사용하여 찾을 수 있습니다. - 수집에 대해 원하는 샘플 속도를 설정합니다(포함된 스크립트의 23행). 최적의 결과를 얻으려면 최소 10kHz로 설정해야 합니다.
- 벤더 ID, DAQ의 디바이스 ID, 아날로그 입력 채널 번호 (포함된 스크립트의 34-36행 포함)를 포함하는 데이터 수집 세션을 초기화하려면 올바른 값을 설정하십시오.
- 클램프를 사용하여 미세 유체 장치를 PCB에 연결합니다. PCB의 예는 보충 파일 4(GERBER 파일) 및 보충 파일 5(회로도, 보드 및 PCB 부품 목록 파일)에 제공됩니다.
- 세포 현탁액을 준비한다.
- 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 중 2% 소 태아 혈청(FBS) 용액을 준비하고, 0.22μm 필터로 여과한다.
- 배양하고 선택한 세포주의 적절한 세포 배양 프로토콜에 따라 세포를 준비한다. 세포를 1-5 x 105 cells/mL의 농도로 1x PBS 중 2% FBS의 준비된 용액에 현탁시킨다. 실험 기간 동안 세포를 얼음 위에 두십시오.
- 세포의 물리적 특성을 측정합니다.
- 셀 샘플을 튜브에 넣고 장치 입구에 연결합니다.
- 면도날이나 날카로운 칼로 PTFE 튜브 30cm를 자릅니다.
- 튜브의 한쪽 끝을 루어 잠금 주사기에 부착합니다. 주사기를 사용하여 세포 샘플을 튜브의 다른 쪽 끝으로 끌어 올립니다.
- 튜브를 장치의 입구에 조심스럽게 삽입하십시오.
- 튜브의 반대쪽 끝을 미세 유체 압력 컨트롤러에 연결합니다.
알림: 미세 유체 압력 컨트롤러와 튜브 사이에 필터를 추가하여 액체가 압력 컨트롤러로 역류하는 것을 방지할 수 있습니다.
- 실험을 실행합니다.
- 압력 컨트롤러 소프트웨어에서 원하는 일정한 구동 압력을 설정하고 샘플이 장치를 채우도록 합니다.
알림: 압력은 일반적으로 2-21kPa입니다. 유속은 명확하게 정의된 펄스를 허용할 만큼 충분히 느리지만 적절한 처리량을 허용할 만큼 충분히 빨라야 합니다.- 미세 유체 채널에 기포가 형성되면 막 다른 골목 충전물을 사용하십시오 : 장치 콘센트를 막고 입구에 저압을 적용하여 가스 투과성 PDMS를 통해 공기를 강제로 배출하십시오. 채널에 기포를 남기면 전류 기준선이 불안정해지고 정확한 측정이 방해됩니다.
- 이물질이 미세유체 채널을 막히게 하는 경우 구동 압력을 가하는 동안 PDMS 장치 상단을 가볍게 누르거나, 압력을 켜고 끄면서 더 높은 압력을 "펄싱"하거나, 튜브를 제거했다가 다시 삽입하여 제거합니다. 이물질이 남아 있으면 새 장치로 전환해야 할 수 있습니다.
- 전원 공급 장치의 전압 노브를 돌려 원하는 전압을 설정하고 ON( ON ) 버튼을 눌러 전압을 활성화합니다.
알림: 전압은 일반적으로 1-5V입니다. 적절한 SNR에 필요한 최저 전압을 선택합니다. 비교할 모든 조건에서 동일한 전압을 사용해야 합니다. - 전류 전치를 켜고 감도(A/V)를 가능한 한 낮게 설정하십시오. 또는 프리앰프에 과부하가 걸리거나 DAQ의 최대 아날로그 입력 전압을 초과하지 않고 게인(V/A)을 가능한 한 높게 설정하십시오. 이 연구에서는 감도를 10-7 A / V로 설정했습니다.
알림: 적절한 감도/이득 값은 적용된 전압과 미세 유체 채널의 기준 저항에 따라 달라집니다. - MATLAB 리본 메뉴에서 녹색의 Run 버튼을 눌러 데이터 수집 스크립트 NPS.m 을 시작하고 데이터 샘플링 및 저장을 시작합니다.
- 실험을 종료하려면 Figure 창의 왼쪽 하단 모서리에 있는 중지 버튼을 눌러 데이터 수집 스크립트를 중지 합니다. On 버튼을 눌러 전원 공급 장치 출력을 비활성화합니다. 압력 컨트롤러 소프트웨어에서 압력 소스를 0 압력으로 설정합니다.
- 이 시점에서 실험을 일시 중지하여 다음 중 하나 이상을 수행할 수 있습니다.
- 현재 장치를 새 장치로 교체하십시오.
- 더 많은 셀 샘플로 튜브를 다시 로드합니다.
알림: 샘플 교차 오염을 방지하려면 새 장치를 사용하여 다양한 유형 또는 조건의 세포를 측정하십시오. - PCB에서 장치의 클램프를 풀고 현미경으로 채널의 상태를 검사합니다. 동일한 장치를 사용하여 실험을 다시 시작하려면 기포가 발생하지 않도록주의해야합니다. 장치 입구에 삽입하는 동안 세포 샘플을 튜브의 맨 끝에 유지하기 위해 주사기 플런저에 부드러운 압력을 가해야 할 수도 있습니다.
- 압력 컨트롤러 소프트웨어에서 원하는 일정한 구동 압력을 설정하고 샘플이 장치를 채우도록 합니다.
- 셀 샘플을 튜브에 넣고 장치 입구에 연결합니다.
4. 미세유체 장치 보정
- 옵션 1: 기준 장치에서 폴리스티렌 비드를 측정합니다.
- 사이징 채널보다 작은 폴리스티렌 비드 크기를 선택하십시오.
- 셀 실험 중에 사용된 여과된 PBS 및 FBS 용액에 1.5% 트윈 및 폴리스티렌 비드를 1-3 x 105 beads/mL의 농도로 추가합니다.
- 3단계에 설명된 참조 장치를 사용하여 섹션 1.3에 설명된 대로 실험을 진행하고 실험 중에 사용된 것과 동일한 전압을 적용합니다. 섹션 5에 설명된 바와 같이, 비드가 사이징 공극을 통과할 때 생성된 전류 방울의 평균 크기 및 비드의 알려진 직경을 사용하여 De를 계산한다.
- 옵션 2: 별도의 측정 장치로 셀 크기를 독립적으로 측정합니다.
- 단계 4.1의 프로토콜을 따르는 대신, 시판되는 세포 크기 측정 기기를 사용하여 샘플 내의 세포의 평균 크기를 측정한다. 이 경우 참조 장치가 필요하지 않습니다. 세포가 사이징 공극을 통과할 때 생성된 평균 전류 강하 및 측정된 평균 세포 직경을 사용하여 섹션 5에 설명된 바와 같이 De를 계산한다.
5. 데이터를 분석하여 세포 표현형 추출
참고: 데이터 처리는 MATLAB 명령줄 인터페이스 프로그램 파일 mNPS_procJOVE.m(https://github.com/sohnlab/NPS-analysis-JOVE )을 사용하여 수행할 수 있습니다. 자세한 내용은 보충 파일 6 을 참조하십시오.
- 데이터를 전처리합니다(그림 3A).
- 전류-전압 프리앰프에 사용된 이득 값을 DAQ에서 수집한 원시 데이터에 적용하여 측정된 전류를 계산합니다.
- 원시 전류 측정에 직사각형 평활화 기능 및/또는 저역 통과 필터를 적용하여 고주파 노이즈를 제거합니다. 그런 다음 필터링된 데이터를 더 낮은 샘플 속도로 리샘플링합니다. 또한 이 낮은 샘플 속도로 해당 타임스탬프 데이터를 계산합니다.
- 비대칭 최소제곱 평활화(26)와 같은 방법을 적용하여 피팅된 기준선 전류 신호를 계산합니다.
- 후속 데이터 포인트 간의 차이를 취하여 전처리된 전류 데이터의 대략적인 1차 도함수(차분 신호)를 계산합니다.
- 세포 이벤트를 식별하고 서브펄스 데이터를 추출합니다(그림 3B).
- 전처리된 데이터를 검사하여 후보 세포 이벤트를 검색합니다. 다른 세포 이벤트와 겹치는 세포 이벤트(즉, 우연의 일치 이벤트)(보충 그림 4)를 거부하거나, 기준선 적합성이 좋지 않거나, 예상치 못한 또는 잘못된 펄스 모양(예: 채널에 막힘이 존재했을 수 있는 경우)을 나타냅니다.
- 각 셀 이벤트에 대한 서브펄스 데이터를 추출합니다.
- 각 노드-기공 세그먼트는 전체 신호 펄스 내에서 해당 서브펄스로 나타납니다(그림 1B, C). 차이 신호가 로컬 최소값에 도달하는 시점을 계산하여 각 서브펄스의 시작을 식별합니다. 차분 신호가 로컬 최대값에 도달하는 시점을 계산하여 각 서브펄스의 끝을 식별합니다.
- 각 서브펄스의 폭을 시작 시점과 종료 시점 사이의 경과 시간으로 결정합니다. 시작 시점과 종료 시점 사이의 모든 데이터 포인트에 대해 측정된 전류와 기준 전류 간의 차이 평균을 계산하여 각 서브펄스의 진폭을 결정합니다.
- 서브펄스 데이터를 기반으로 각 세포 이벤트에 대한 세포 기계형을 결정합니다.
- Deblois and Bean24에 의해 정의된 방정식에 기초하여 세포 직경 d를 결정한다:
여기서 ΔI/I는 사이징 서브펄스에서 기준선 전류에 대한 서브펄스 진폭의 평균 비율이고, De는 채널의 유효 직경(4단계에서 측정)이고, L은 노드-공극 채널의 전체 길이이다.- De는 알려진 직경(세포 또는 비드, 단계 4 참조)의 입자 세트에 의해 생성된 평균 ΔI/I를 계산하고, 알려진 직경을 d로 사용하고, De에 대해 식 1을 해결함으로써 결정된다.
- 변형에 대한 세포의 저항을 정량화합니다.
- 알려진 세그먼트 길이와 각 서브펄스의 측정된 지속 시간을 사용하여 사이징 서브펄스의 평균 셀 속도를 계산하여 유체 속도 U흐름을 결정합니다.
- Kim et al.2에 의해 정의된 전체 세포 변형성 지수(wCDI)를 다음과 같이 결정합니다.
여기서, Lc는 수축 세그먼트의 길이이고, h 채널은 채널 높이이고, ΔTC는 수축 서브펄스의 지속시간이다.
- 사이징 서브펄스2에서 평균 진폭의 8% 이내의 진폭을 갖는 첫 번째 복구 서브펄스로 정의되는 변형으로부터 셀의 회복 시간을 식별합니다.
- 수축 세그먼트 내에서 셀의 횡방향 변형을 계산합니다.
- Kim et al.2에
의해 정의된 바와 같이 수축 세그먼트(De,c)의 유효 직경을 계산하고, 여기서 wc는 수축 세그먼트의 너비이고 wnp는 다른 모든 세그먼트의 너비이다. - Deblois and Bean24에 의해 정의된 방정식을 사용하여 수축 내 세포의 등가 구형 직경 dc를 다시 계산합니다.
여기서 ΔIC/Ic는 수축 서브펄스에서 기준선 전류에 대한 서브펄스 진폭의 비율이고 Lc는 수축 세그먼트의 길이이다. - Kim et al.2에 설명된 대로 셀의 신장 길이 L변형을 계산합니다.
- 마지막으로, 세포의 횡방향 변형 δ변형을 계산하며, 이는 Kim et al.2에 의해 다음과 같이
정의됩니다.
- Kim et al.2에
- Deblois and Bean24에 의해 정의된 방정식에 기초하여 세포 직경 d를 결정한다:
의해 정의된 바와 같이 수축 세그먼트(De,c)의 유효 직경을 계산하고, 여기서 wc는 수축 세그먼트의 너비이고 wnp는 다른 모든 세그먼트의 너비이다.
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Representative Results
여기에 제시된 기계 성형 플랫폼은 중간 처리량으로 단일 세포의 생물 물리학 적 특성을 측정하기위한 간단하고 다양한 접근 방식입니다. 세포는 일정한 압력 구동 유동을 사용하여 마이크로유체 채널 (도 1A)을 통해 유동된다. 세포가 통과함에 따라, 생성된 마이크로유체 채널의 길이 및 전류 펄스는 데이터 획득 하드웨어를 사용하여 기록된다. 수집된 신호(그림 1B,C)는 MATLAB의 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 처리되어 관련 단일 셀 기계적 특성을 추출합니다. 도 1D는 실험 프로토콜의 그래픽 개요를 제시한다.
장치를 제작하기 위해 처음에는 네거티브 마스터 몰드가 생성되어 PDMS를 주조하는 데 사용됩니다(그림 2). 보충 그림 3에 표시된 성공적인 마스터 몰드는 매끄러운 수직 측벽을 포함하고 미세 유체 채널에 결함이 없습니다 (그림 4Ai). 이 초기 마스터 금형을 제작할 때는 잘못 제작된 웨이퍼(보충 그림 3)에서는 모든 결함이 모든 후속 PDMS 캐스트(그림 4Aii)로 전달되어 사용할 수 없게 되기 때문에 주의를 기울여야 합니다. 성공적인 PDMS 캐스트는 패턴화된 전극이 있는 유리 슬라이드에 플라즈마 결합됩니다(그림 1A).
실험을 위해 장치의 전극 패드가 PCB에 연결되어 있습니다(그림 1D). 그런 다음 세포 샘플을 포함하는 튜브를 장치 입구에 삽입하고 미세 유체 흐름 컨트롤러에 연결하여 미세 유체 채널을 통해 세포의 압력 구동 흐름을 가능하게 합니다. 중요한 것은 실험 중에 현재 측정의 실시간 판독값이 표시된다는 것입니다. 이를 통해 사용자는 장치가 의도한 대로 작동하는지 확인할 수 있습니다. 성공적인 세포 통과 이벤트는 쉽게 구별할 수 있는 서브펄스로 구성됩니다(그림 4Bi). 막힘과 같은 합병증은 실험 중에 발생할 수 있으며 비정상적인 펄스 모양을 가진 이벤트의 실시간 판독으로 식별 할 수 있습니다 (그림 4Bii).
데이터 분석을 위해 각 세포 통과 이벤트에 대해 추출해야 하는 중요한 신호 파라미터가 그림 1B 에 자세히 설명되어 있으며 5.2.2단계에서 설명됩니다. 원시 신호에는 잡음을 필터링하고 중요한 성분을 추출하기에 충분한 SNR이 있어야 합니다(그림 3A). 비판적으로, 각 노드의 전류 신호 상승은 차이 신호 ∂ I / ∂t 에서 서브 펄스를 쉽게 식별 할 수있을만큼 충분히 견고해야합니다 (그림 3B).
측정된 wCDI 및 회복 시간을 사용하여 세포 또는 상태를 직접 비교할 수 있습니다. 특히, wCDI 는 탄성 계수에 반비례하는 셀 강성의 상대적 지표입니다 (보충 그림 5). 따라서 wCDI 의 더 큰 값은 더 부드러운 기계적 표현형에 해당합니다. 예를 들어, 도 5A에서, 악성 MCF-7 세포는 비악성 MCF-10A 세포보다 더 큰 wCDI 분포를 가지며, 이는 악성 MCF-7 세포가 그의 비악성 MCF-10A 대응물보다 더 연약하다는 것을 나타낸다. 이것은 암세포가 악성이 아닌 대응 물보다 부드럽다는 것을 보여준 수많은 경험적 연구와 일치합니다27. 마찬가지로, 도 5B에서, 라트룬쿨린으로 처리된 MCF-10A 및 MCF-7 세포는 wCDI의 증가를 나타낸다. 라트룬쿨린은 액틴 세포 골격28을 파괴하는 강력한 약리학적 제제입니다. 결과적으로,이 약물로 처리 된 세포에서 더 큰 wCDI 및 따라서 더 부드러운 표현형을 관찰하는 것이 일관됩니다. 마지막으로, 도 5C에서, wCDI 는 2개의 인간 유방 상피 세포 서브라인, 내강 상피 (LEP) 및 근상피 (MEP) 사이에서 비교된다. 이 비교에서, 두 가지 일차 세포 유형을 분화시키는 뚜렷한 wCDI 분포가 다시 한 번 존재하며, 이는 LEP 세포가 MEP 세포보다 더 부드럽다는 것을 나타낸다. wCDI 외에도 회수 시간을 정량화하여 세포 점도의 상대적 지표를 제공할 수 있습니다. 회복 시간이 길수록 점성이 더 높은 표현형을 나타냅니다. 그림 5D 는 도 5A-C의 각 조건에 대해 세 가지 별개의 범주로 범주화된 복구 시간을 나타냅니다. 처리되지 않은 MCF-10A 및 MCF-7은 즉시 회복되는 세포의 비율이 더 높으며(ΔTr = 0), 이는 라트룬쿨린 처리된 대응물보다 점도가 낮음을 나타냅니다.
wCDI 및 회복 시간은 단일 셀 탄성 및 점도의 상대적 메트릭입니다. 따라서 여기에 제시된 방법은 관심 있는 여러 샘플 간의 차동 반응을 특성화하는 데 가장 적합합니다. 현재 형태에서 여기에 제시된 프로토콜은 영률과 같은 정의 된 기계적 매개 변수의 절대적인 정량화를 제공하지 않습니다.
그림 1: 기계형 플랫폼 개요. (A) 미세유체 장치의 이미지. (B) 단일 셀 통과 이벤트의 대표적인 전류 펄스가 있는 채널 형상. ΔInnp는 기공으로 들어가는 세포로부터의 전류 강하를 나타내고,ΔIc는 수축으로 들어가는 세포로부터의 전류 강하를 나타낸다. ΔTc는 세포가 공극을 통과하는데 필요한 시간을 나타내고,ΔTc는 세포가 수축 채널을 통과하는데 필요한 시간을 나타내고,ΔTr은 세포가 회복하는데 필요한 시간을 나타낸다. (C) 세포 통과 이벤트로부터의 실제 전류 펄스. (d) 실험 워크플로우: (1) 세포를 PBS에 현탁시키고 (2) 일정한 압력으로 마이크로유체 장치를 통해 구동한다. 세포가 마이크로유체 채널을 통과함에 따라, (3) 전류 펄스는 데이터 획득 하드웨어를 사용하여 측정된다. (4) 전류 펄스를 분석하여 여러 단일 셀 기계적 특성을 추출합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 장치 제작 개요 . (A) 네거티브 마스터 몰드는 (1) 포토리소그래피를 사용하여 제작됩니다. (2) PDMS는 네거티브 마스터 몰드에 주조됩니다. (3) 성형 장치는 입구 및 출구 구멍이 펀칭 된 상태에서 깍둑 썰기됩니다. (B) 동시에, 유리 슬라이드는 (1) 금속 전극을 제조하기 위해 패턴화된다. (2) E-빔 증발을 사용하여 금속을 슬라이드에 증착한 다음 (3) 리프트 오프 공정을 통해 과도한 금속을 제거하고 원하는 금속 전극을 남깁니다. (C) PDMS 장치와 금속 전극이있는 유리는 산소 플라즈마를 사용하여 함께 접착되어 제조 공정을 완료합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 데이터 처리 및 분석. (A) 원시 전류 데이터(왼쪽)는 직사각형 평활화 기능과 저역 통과 필터를 적용한 다음 더 낮은 샘플링 속도로 리샘플링하여 전처리(오른쪽)합니다. 베이스라인 전류 신호는 후속적으로 비대칭 최소제곱 평활화(26)로 피팅된다. (B) 각 서브펄스의 시작과 끝에서의 타임포인트는 차분 신호∂I/∂t(왼쪽)에서 각각 로컬 최소값과 최대값으로 식별됩니다. 각 서브 펄스에 대해 폭 Δt는 시작과 끝 사이의 경과 시간에 의해 결정되고 진폭 ΔI는 측정 된 전류와 기준 전류 간의 평균 차이에 의해 결정됩니다. 추출된 서브펄스 데이터는 직사각형 신호(오른쪽)로 나타낼 수 있습니다. 각 서브펄스는 장치 형상의 한 세그먼트에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 제작 및 실험 중 성공 및 결함 결과의 예 . (A) 두 개의 서로 다른 네거티브 마스터 몰드에서 가져온 수축 세그먼트의 PDMS 캐스트 이미지. (i)는 매끄러운 측벽, 잘 정의된 지오메트리 및 눈에 띄는 결함이 없는 잘 제작된 채널의 예입니다. (ii)는 입자 흐름을 완전히 또는 부분적으로 방해하는 수축 채널 (빨간색 직사각형으로 윤곽선)에 심각한 결함이있는 잘못 제작 된 채널의 예입니다 (스케일 바 = 150 μm). (B) 데이터 수집 중에 "NPS.m"에 의해 생성된 필터링된 전류 펄스의 예. (나는) 셀이 의도한 대로 채널을 통과하는 성공적인 셀 이벤트의 예입니다. (ii) 장치가 "막혔을 때" 생성되는 전류 펄스의 예. 이 경우 파편은 채널의 두 번째 기공에서 세포 흐름을 방해합니다. 이로 인해 두 번째 사이징 펄스의 중간에 "잘린"(빨간색 선으로 표시됨) 나타나는 세포 이벤트가 발생합니다. "차단" 후 전류(파란색 선으로 표시됨)의 감소는 막힘 주위에 축적되어 전류 흐름의 더 많은 부분을 차단하는 입자(파편 또는 셀)로 인해 발생합니다. 전류의 급격한 하향 스파이크 (녹색 사각형으로 표시)는 막힘 주위를 이동할 수있는 입자를 반영하므로 전류의 더 큰 부분 만 일시적으로 차단합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 다양한 조건 간의 wCDI 및 세포 회복의 예. (a) 2개의 유방 상피 세포주, 비악성 MCF-10A 및 악성 MCF-7 사이의 wCDI 분포. (b) MCF-10A 또는 MCF-7의 wCDI , 여기서 각 세포 유형은 처리되지 않고, Lat-A로 처리하고, Lat-B로 처리하였다. (c) 2개의 1차 인간 유방 상피 하위계통 사이의 wCDI 분포: 근상피(MEP) 및 내강 상피(LEP) 세포. (D) A, B, C 중 네 가지 조건에 해당하는 복구 시간. 복구 시간은 보기 쉽도록 범주화되었습니다. 모든 조건은 n=99 셀의 샘플 크기를 가졌다. 이 그림은 Kim et al.2의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 마이크로유체 채널 및 전극 모두에 대한 장치 어레이의 예. 투명 마스크로 표시되는 두 이미지는 포토레지스트가 UV에 노출되는 영역에서는 흰색(투명을 나타냄)으로, UV 노출이 차단되는 영역에서는 검은색으로 설계되어야 합니다. (a) 3인치 Si 웨이퍼 상에 배열된, "장치"(직사각형) 당 2개의 평행 채널을 갖는 마이크로유체 채널의 어레이. 맨 오른쪽의 장치는 "ref"로 표시되어 있으며 1.3단계에 설명된 대로 보정에 사용하도록 설계되었습니다. (B) 장치 당 두 개의 전극이있는 전극 배열로, (A)의 장치에있는 두 채널이 (B)의 각 전극 설계 위에 정렬되도록합니다. 이 어레이는 2인치 x 3인치 유리 슬라이드용으로 배열되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 전극 설계의 영역과 금을 올바르게 에칭하는 방법을 보여주는 회로도(단계 2.1.2.3). 금의 최상층은 측정 전극에서 제거되어야 하며, 그렇지 않으면 측정 중에 생물 오염 및 전기분해가 발생합니다. 그러나 부드러운 금은 포고 핀 커넥터의 핀과 우수한 전기적 연결을 제공하기 때문에 금은 접촉 패드에 남아 있어야합니다. (a) 마이크로유체 채널(파란색)이 패턴화된 금속(검은색)과 교차하는 방법을 보여주는 개략도. 표시된 바와 같이, 미세 유체 채널에 수직이고 그 바로 아래에있는 금속은 금을 에칭해야하는 측정 전극이며, 채널 측면의 큰 금속 직사각형은 금이 남아 있어야하는 접촉 패드입니다. (B) 패턴화된 금속에 금 에천트를 적용해야 하는 위치와 적용해서는 안 되는 위치를 보여주는 개략도. 녹색 영역은 에칭이 필요한 위치를 나타내고, 노란색 영역은 에칭이 발생할 수 있고 장치의 효율성에 영향을 미치지 않는 위치를 나타내며, 빨간색 영역은 금을 에칭해서는 안 되는 위치를 나타냅니다. (C) 전형적이고 성공적으로 에칭된 장치를 보여주는 개략도. 노란색은 금이 여전히 존재하는 영역을 나타내고 회색은 백금 층이 노출된 영역을 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 성공적으로 제작된 수축 채널과 제대로 제작되지 않은 수축 채널의 이미지. (A) 두 개의 개별 Si 웨이퍼에서 네거티브 마스터 몰드의 수축 채널 이미지. (i) 그림 4Ai에 표시된 것과 같은 이상적인 PDMS 채널을 생성하는 잘 제작된 마스터 금형의 예. (ii) 그림 4Aii에 표시된 PDMS 채널을 만드는 데 사용된 불량하게 제작된 마스터 금형의 예. 빨간색 직사각형으로 윤곽이 그려진 영역은 그림 4Aii에 표시된 결함에 해당하며, 마스터 금형에서 PDMS 마이크로 채널로 결함이 전달됨을 보여줍니다(스케일 바 = 150μm). (B) PDMS 수축 채널의 단면 이미지, 다른 금형의 높이와 너비를 보여줍니다. 이들 단면은 유동 방향에 수직인 PDMS 수축 채널을 슬라이스함으로써 획득되었다. (i) (Ai)에 표시된 웨이퍼를 사용하여 제작된 잘 제작된 PDMS 몰드의 예로, 매끄러운 수직 측벽을 보여줍니다. (ii) 기울어진 측벽(스케일 바 = 20μm)을 보여주는 (Aii)에 표시된 웨이퍼를 사용하여 제작된 불량하게 제작된 PDMS 금형의 예. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 4: 동시 셀 이벤트의 예(둘 이상의 셀이 한 번에 채널을 통과할 때 생성됨). 신호는 프로토콜 섹션 5의 5.1.1-5.1.3단계에 따라 처리되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 5: wCDI와 탄성률 20,29,30,31,32,33,34,35 간의 관계. (A) 이 기술로 측정한 Jurkat, MCF7 및 MCF10A 세포와 마이크로피펫 흡인의 비교. wCDI는 피질 장력에 반비례합니다. (B) 이 기술에 의해 측정된 MCF7 및 MCF10A 세포의 비교와 공개된 AFM 데이터. (C) 이 기술로 측정된 A549 및 BEAS-2B 세포와 공개된 AFM 데이터의 비교. 여러 세포 유형에서 wCDI는 탄성 계수에 반비례합니다. 이 그림은 Kim et al.2의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 단일 세포 기계형 기술의 예 및 이를 기계-NPS와 비교하는 방법. 기술은 처리량 12,2,36,37을 증가시키는 순서로 나열됩니다. 기계적 정보는 장치가 각 셀의 탄성 및 점성 기계적 특성을 모두 측정할 수 있는지 여부를 나타냅니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: 상이한 세포주에 대한 사이징, 수축 및 회복 세그먼트 폭의 예. MEP 및 LEP는 일차 인간 유방 상피 세포의 두 계통을 지칭하며, 여기서 MEP는 근상피 세포를 의미하고 LEP는 내강 상피 세포 2,8을 의미한다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: AutoCAD 설계 예제. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: 포토리소그래피 처리를 위한 예제 프로토콜. 포토레지스트 또는 SU-8 에폭시 패터닝 및 처리를 위한 두 가지 예제 프로토콜이 요약되어 있습니다. 첫 번째는 전극 제조를위한 희생 층 역할을하기 위해 유리 슬라이드에 포지티브 포토 레지스트를 적용하는 것을 설명합니다. 두 번째는 실리콘 웨이퍼에 SU-8 에폭시를 적용하여 PDMS 미세 유체 채널 성형을위한 릴리프 구조를 만드는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 제조업체의 MF-321 및 SU8 3000 데이터 시트에서 채택되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3: 전자빔 증발을 이용한 75 Å Ti, 250 Å Pt 및 250 Å Au의 박막 증착을 위한 예제 프로토콜. 전자빔 증발기를 사용하여 75 ÅTi, 250 Å Pt 및 250 ÅAu의 박막 증착을 수행하기 위한 예시적인 프로토콜이 요약되어 있다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 4: GERBER 파일 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 5: 회로도, 보드 및 PCB 부품 목록 파일 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 6: MATLAB 명령줄 인터페이스. 이 파일에는 MATLAB 명령줄 인터페이스(26)를 사용한 데이터 처리에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 기계 성형 기술을 사용하여 단일 셀의 기계적 특성을 측정하는 것은 장치 제조, 데이터 수집 및 데이터 분석의 세 단계로 구성됩니다. 각 단계에는 실험 결과에 큰 영향을 미칠 수있는 주목할만한 측면이 있습니다. 장치 제작 중에 정확하고 반복 가능한 결과를 얻으려면 일관된 채널 형상과 장치 간 균일성이 필수적입니다. 특히 각 장치의 측벽은 비교적 매끄러워야 하며(그림 4Ai) 복제 장치의 채널 높이는 비슷해야 합니다. 특히 수축 채널(그림 4Aii)에서 세포 흐름을 부분적으로 방해하는 결함이 있는 모든 장치는 폐기해야 합니다. 채널 지오메트리에서 식별 가능한 결함이 있는 장치를 사용하면 부정확하고 재현할 수 없는 결과가 발생합니다. 데이터 수집 중에 사용자가 데이터 수집 중에 채널에 막힘이 있음을 인식할 수 있어야 합니다. 예제 스크립트인 "NPS.m"(https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public 에서 사용 가능)은 현재 측정값을 표시하므로 사용자가 채널 상태 및 셀 전송 이벤트를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 막힘의 펄스 특성은 그림 4B에 나와 있습니다. 일부 세포가 여전히 흐르도록 허용하는 수축 채널 내의 막힘은 세포가 장애물 위치에서 변형이 증가하여 부정확한 wCDI를 초래하기 때문에 해결하는 데 특히 중요합니다. 마지막으로, 데이터 분석 중에 사용자는 분석 알고리즘의 입력으로 정확한 임계값을 선택하는 데 부지런해야 합니다. 임계값을 너무 높게 설정하면 프로그램이 더 작은 셀에서 생성된 이벤트를 식별하지 못하여 결과를 왜곡하고 측정된 셀 모집단을 잘못 나타냅니다.
이러한 중요한 단계 외에도 다양한 세포 유형이나 조건을 연구할 때 조정이 필요할 수 있는 프로토콜의 추가 측면이 있습니다. 예를 들어, 이전에 연구된 샘플보다 훨씬 작은 샘플에 이 기술을 적용하려면 더 좁은 수축 채널이 필요합니다. 더 좁은 채널을 제조하는 것은 전자빔 리소그래피(38)와 같은 더 비싼 제조 방법론을 필요로 할 수 있다. 부가적으로,ΔI/I ~ ΔV 셀/Δ V 수축 (여기서, V 셀 및V수축은 각각 변형된 셀 및 채널의 부피임)이기 때문에, 더 좁은 채널은 더 큰 기준선 저항을 초래하고SNR19를 감소시킨다. 마지막으로, 좁은 채널은 막힘 위험을 증가시켜 실험 실행을 더욱 어렵게 만들 수 있습니다. 이 특정 문제는 더 많은 흡입 필터를 사용하여 잠재적으로 완화될 수 있습니다.
이 기술의 한 가지 한계는 정적 수축 채널이며, 이는 세포 집단에 단일 평균 변형만을 적용할 수 있습니다. 크기가 다른 세포의 변형성을 비교하거나 서로 다른 적용된 균주에서 단일 세포 집단을 조사하려면 수축 채널 폭이 다른 여러 장치를 사용해야 합니다. 플랫폼은 또한 PDMS 벽에 의해 제한되며, 이는 측정할 수 있는 강성의 범위를 제한합니다. 예를 들어, 일부 매우 단단한 식물 세포는 이들을 변형시킬 것으로 예상되는 PDMS 벽보다 더 단단하다(39,40). 더욱이, 수축 채널을 통해 이러한 뻣뻣한 입자를 밀어내는 데 필요한 압력은 PDMS와 유리 슬라이드 사이의 결합 강도를 극복하여 박리를 유발할 수 있습니다. 그러나, 이러한 한계를 극복하기 위해 유리 또는 실리콘과 같은 더 단단한 재료로 미세 유체 채널을 제조 할 수 있습니다. 이러한 사소한 제약에도 불구하고 이 플랫폼은 세포의 중간 처리량 기계적 측정에 이상적입니다. 광학 들것 또는 AFM과 같은 다른 방법론과 비교할 때 이 기술은 더 높은 처리량을 가능하게 합니다. RT-DC와 같은 다른 중간 및 고 처리량 미세 유체 기술과 비교할 때이 기술은 단일 세포의 점성 및 탄성 특성을 모두 측정하여 더 많은 생물 물리학 적 특성을 조사 할 수 있습니다. 마지막으로, 복잡한 광학 장치가 아닌 저렴한 전자 장치를 사용하는 간단한 실험 설정은 이 기술을 접근성이 높은 기술로 만듭니다.
전반적으로이 기계 성형 기술은 수많은 잠재적 인 연구 및 응용 프로그램을위한 도구로서 엄청난 가능성을 가지고 있습니다. 이전에는 1 차 샘플을 포함한 다양한 세포 유형에 적용되었으며 세포 골격 및 핵 구성 요소가 세포 점탄성 특성에 미치는 영향을 측정하는 데 효과적인 것으로 나타났습니다 2,8. 또한 이 플랫폼2로 스크리닝한 후에도 세포가 생존 가능하기 때문에 연구원은 다운스트림 분석을 수행할 수 있습니다. 이 플랫폼은 또한 업스트림 미세유체 세포 분류와 결합하는 데 이상적이며 순환 종양 세포 측정과 같은 응용 분야에 적합합니다. 앞으로 이 플랫폼은 세포 행동을 이해하고41, 질병 진행을 결정하고42 및 약물 반응을 모니터링하는43에 응용되는 단일 세포의 다변수 기계적 측정을 위한 경쟁력 있고 다재다능한 도구로 남아 있습니다. 기초적인 과학 연구 외에도 이 기술은 임상 도구, 특히 신속한 진단 스크리닝을 위한 저비용 벤치탑 플랫폼으로서 큰 가능성을 가지고 있습니다. 더욱이, 저전력 요구 사항과 측정 전에 샘플 준비에 대한 최소한의 필요성을 감안할 때, 이 기술은 접근 가능한 진단 기기가 절실히 필요한 저자원 환경에 특히 적합합니다(44).
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Disclosures
L. L. S는 2022년 7월 12일 발행된 미국 특허 제11,383,241호 "Mechano-node-pore sensing", J. Kim, S. Han 및 L. L. Sohn을 보유하고 있습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIBIB 1R01EB024989-01 및 NCI 1R01CA190843-01의 보조금으로 지원되었습니다. AL과 R. R.은 H2H8 협회 대학원 연구 펠로우십의 지원을 받았습니다. KLC는 National Science Foundation Graduate Research Fellowship과 Siebel Scholar Fellowship의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | J.T. Baker | 5356-05 | Purity (GC) ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker) |
| Aluminum Foil | n/a | n/a | |
| Analog Low-Pass Filter | ThorLabs | EF504 | ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0) |
| Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25) |
| Blade | n/a | n/a | |
| BNC Cable | Pomona Electronics | 2249-C-12 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_ medium=cpc&utm_campaign= Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term= &utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs w-EALw_wcB |
| Cleanroom Polyester Swab | Thermo Fisher Scientific | 18383 | https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383 |
| Current Preamplifier | DL Instruments | 1211 | https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_ id=1419 |
| Custom PCB (w/ components) | n/a | n/a | see Supplemental files 4 and 5 |
| DAQ Terminal Block | National Instruments | BNC-2120 | https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html |
| DAQ to BNC-2110 cable | National Instruments | SHC68-68-EPM | https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html |
| Data Acquisition Board (DAQ) | National Instruments | PCI-6251 | https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html |
| Dessicator | Thermo Fisher Scientific | 5311-0250 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250 |
| Female BNC To Banana Plug Adapter | Pomona Electronics | 72909 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-186 | https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs |
| Glass Cutter | Chemglass | CG-1179-21 | https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips |
| Gold Etchant TFA | Transene | NC0977944 | https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944 |
| Hot Plate | Thermo Fisher Scientific | SP131825 | |
| Isopropyl Alcohol | Spectrum Chemical | I1056-4LTPL | Purity (GC) ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056) |
| Metal Hardware Enclosure | Hammond Manufacturing | EJ12126 | https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415 |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Purity (GC) ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561) |
| MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/mf-321/ |
| MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist | DuPont | n/a | https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/ |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049 |
| Photomask | Fineline Imaging | n/a | Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/) |
| Plain Glass Microscope Slide | Fisher Scientific | 12-553-5B | Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/ |
| Plastic Petri Dish | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712) |
| Pressure Controller | Fluigent | MFCS-EZ | https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/ |
| Pressure Controller Software | Fluigent | MAESFLO | |
| Programming & Computation Software | MATLAB | R2021b | for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html) |
| PTFE Tubing | Cole Parmer | 06417-31 | 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731) |
| Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter | Millapore Sigma | PHCC20060 | https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060 |
| Silicon Wafer | Wafer World | 2885 | 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885) |
| Spin Coater | n/a | n/a | |
| SU-8 3025 Negative Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-2000/ |
| SU8 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-developer/ |
| Sygard 184 Polydimethlysiloxane | Dow Chemical | 4019862 | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Tape | Scotch | 810-341296 | https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid= Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO 2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB |
| Titanium, Platinum, Gold | n/a | n/a | |
| Triple Output Power Supply | Keysight | E36311A | https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653 |
| UV Mask Aligner | Karl Suss America | MJB3 Mask Aligner |
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