Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Механо-узловое измерение пор: быстрая платформа без меток для многопараметрических одноэлементных вязкоупругих измерений

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64665
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 1,3, 1,2
1Graduate Program in Bioengineering, University of California, Berkeley and University of California, San Francisco, 2Department of Mechanical Engineering, University of California, Berkeley, 3Department of Electrical Engineering and Computer Sciences, University of California, Berkeley
* These authors contributed equally

Summary

Здесь представлен метод механического фенотипирования одиночных клеток с использованием микрофлюидной платформы на основе электроники, называемой механо-узлово-поровым зондированием (mechano-NPS). Эта платформа поддерживает умеренную пропускную способность 1-10 клеток / с при измерении как упругих, так и вязких биофизических свойств клеток.

Abstract

Клеточные механические свойства участвуют в самых разнообразных биологических процессах и заболеваниях, начиная от дифференцировки стволовых клеток и заканчивая метастазированием рака. Традиционные методы измерения этих свойств, такие как атомно-силовая микроскопия (AFM) и аспирация микропипетки (MA), захватывают богатую информацию, отражающую полную вязкоупругую реакцию клетки; однако эти методы ограничены очень низкой пропускной способностью. Высокопроизводительные подходы, такие как цитометрия деформируемости в реальном времени (RT-DC), могут измерять только ограниченную механическую информацию, поскольку они часто ограничиваются однопараметрическими показаниями, которые отражают только упругие свойства клетки. В отличие от этих методов, механо-узлово-поровое зондирование (mechano-NPS) представляет собой гибкую, не содержащую меток микрофлюидную платформу, которая устраняет разрыв в достижении многопараметрических вязкоупругих измерений ячейки с умеренной пропускной способностью. Измерение постоянного тока (DC) используется для мониторинга клеток, когда они проходят через микрофлюидный канал, отслеживая их размер и скорость до, во время и после того, как они проталкиваются через узкое сужение. Эта информация (т.е. размер и скорость) используется для количественной оценки поперечной деформации каждой ячейки, сопротивления деформации и восстановления после деформации. В общем, эта микрофлюидная платформа на основе электроники обеспечивает множественные вязкоупругие свойства ячейки и, следовательно, более полную картину механического состояния клетки. Поскольку он требует минимальной подготовки образцов, использует простое электронное измерение (в отличие от высокоскоростной камеры) и использует преимущества стандартного изготовления мягкой литографии, реализация этой платформы проста, доступна и адаптируется к последующему анализу. Гибкость, полезность и чувствительность этой платформы предоставили уникальную механическую информацию о разнообразном спектре клеток, с потенциалом для многих других применений в фундаментальной науке и клинической диагностике.

Introduction

Одиночные ячейки являются динамическими, вязкоупругими материалами1. Множество внутренних и внешних процессов (например, начало митоза или ремоделирования внеклеточного матрикса [ECM]) влияют на их структуру и состав 2,3,4, часто приводя к различным биофизическим свойствам, которые дополняют их текущее состояние. В частности, было показано, что механические свойства являются важными биомаркерами клеточного развития, физиологии и патологии, давая ценную количественную информацию, которая может дополнять канонические молекулярно-генетические подходы 5,6,7. Например, Li et al. недавно описали механические различия между лекарственно-устойчивыми и лекарственно-чувствительными клетками острого промиелоцитарного лейкоза, а также использовали РНК-seq для выявления дифференциально экспрессированных генов, связанных с цитоскелетом 8. Понимая сложное взаимодействие между механикой одной клетки и клеточной функцией, механофенотипирование имеет более широкое применение в преобразовании фундаментальной науки и клинической диагностики9.

Наиболее широко распространенным инструментом для измерения одноэлементной механики является атомно-силовая микроскопия (AFM). В то время как AFM позволяет локализованное измерение механических свойств ячеек с высоким разрешением, оно по-прежнему ограничено пропускной способностью <0,01 ячейки / с10. Альтернативно, оптические носилки, которые используют два расходящихся лазерных луча для улавливания и деформации взвешенных одиночных ячеек11, ограничены незначительно более высокой пропускной способностью <1 ячейки/с12. Последние достижения в области микрофлюидных технологий позволили создать новое поколение устройств для быстрой, одноклеточной, механической оценки12,13. Эти методы используют узкие сужающие каналы14,15, сдвиговой поток16 или гидродинамическое растяжение17 для быстрой деформации клеток при пропускной способности 10-1000 клеток / с18. Хотя скорость измерения этих подходов значительно выше, чем у обычных методов, они часто обменивают возможности высокой пропускной способности на ограниченные механические показания (дополнительная таблица 1). Все вышеупомянутые быстрые микрофлюидные методы сосредоточены на базовых однопараметрических метриках, таких как время прохождения или коэффициенты деформируемости, которые отражают только упругие свойства клетки. Однако, учитывая внутреннюю вязкоупругую природу отдельных клеток, надежная и тщательная механическая характеристика клеток требует рассмотрения не только упругих компонентов, но и вязких реакций.

Механо-узлово-поровое зондирование (mechano-NPS)2,8 (рисунок 1A) представляет собой микрофлюидную платформу, которая устраняет существующие ограничения с помощью одноклеточного механофенотипирования. Этот метод позволяет измерять несколько биофизических параметров одновременно, включая диаметр ячейки, относительную деформируемость и время восстановления после деформации, с умеренной пропускной способностью 1-10 клеток / с. Этот метод основан на узлово-поровом зондировании (NPS)19,20,21,22,23,24, которое включает в себя использование измерения четырехточечного зонда для измерения модулированного импульса тока, производимого клеткой, проходящей через микрофлюидный канал, который был сегментирован более широкими областями, называемыми «узлами». Модулированный импульс тока является результатом того, что ячейка частично блокирует поток тока в сегментах (т.е. «порах») и узлах, причем в первом блокируется больше тока, чем во втором. В механо-NPS один сегмент, «канал сжатия», уже, чем диаметр ячейки; следовательно, ячейка должна деформироваться, чтобы пройти весь канал (рисунок 1B). Диаметр ячейки может быть определен по величине субимпульса, образующегося при прохождении клеткой узлов-пор до канала сжатия (рис. 1B,C). Здесь |ΔInp|, падение тока, когда ячейка находится в поре, пропорционально объемному отношению ячейки к поре, Vячейка/Vпора 2,8,19. Жесткость клеток может быть определена по ΔTc, длительности значительно большего субимпульса, образующегося при прохождении клеткой канала сжатия (рис. 1B, C). Более жесткой ячейке потребуется больше времени для прохождения канала, чем более мягкой 2,8. Наконец, «восстановление» клетки, способность клетки возвращаться к своему первоначальному размеру и форме после деформации, может быть определено серией субпусков, образующихся при прохождении клеткой узлов-пор после канала сжатия (рис. 1B, C). Время восстановления, ΔTr, - это время, необходимое для того, чтобы текущие субпульсы вернулись к величине предыдущих субвыпусков, прежде чем клетка будет сжата. В целом, модулированные импульсы тока, полученные при прохождении клетки по микрофлюидному каналу, регистрируются и анализируются для извлечения соответствующих одноэлементных механических параметров (рисунок 1D)2,8.

Воспроизводимость и простота использования этой микрофлюидной платформы на основе электроники были ранее продемонстрированы25. Кроме того, платформа представляет собой низкий барьер для входа для одноклеточного механофенотипирования. Стандартная мягкая литография используется для изготовления микрофлюидных устройств. Измерительное оборудование состоит из недорогих компонентов, включая простую печатную плату (PCB), блок питания, предусилитель, плату сбора данных (DAQ) и компьютер. Наконец, для сбора и анализа данных доступен удобный код, обеспечивающий простую реализацию. Этот метод механофенотипирования может различать популяции незлокачественных и злокачественных эпителиальных клеточных линий молочной железы и легких, различать подлинии в первичных эпителиальных клетках молочной железы человека и характеризовать эффекты цитоскелетных возмущений и других фармакологических агентов 2,8. В целом, эта платформа является эффективным подходом для механофенотипирования одиночных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Проектирование геометрии устройства

  1. Выберите ширину сегментов калибровки и восстановления, чтобы она была шире, чем диаметр самых больших измеряемых ячеек, но также поддерживала достаточное соотношение сигнал/шум (SNR). В дополнительной таблице 2 приведены примеры различных размеров и ширины сегментов восстановления для различных линий ячеек.
  2. Выберите ширину сегмента сокращения, чтобы применить 30%-40% деформацию к среднему размеру клеток, которые должны подвергаться механофенотипированию. Деформация определяется как Equation 1, где d - диаметр ячейки, а wc - ширина канала сжатия 2,8. В дополнительной таблице 2 приведены различные ширины сегментов сокращения для различных линий ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если кто-то желает сравнить типы ячеек или условия с существенно отличающимися диаметрами, следует использовать отдельные конструкции устройств с шириной сегмента сжатия, специфичной для каждого типа/состояния ячейки.
  3. Спроектируйте эталонное устройство для каждой уникальной геометрии устройства. Это необходимо для определения De, эффективного диаметра размерного порового сегмента микрофлюидного канала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эталонное устройство использует ту же геометрию, что и основное устройство. Единственное изменение заключается в том, что сегмент сжатия должен быть равен по ширине сегменту пор калибровки с помощью полистирольных шариков известного размера. Расширение сжимания предотвращает засорение полистирольных шариков каналом сжатия во время калибровки. Процесс калибровки дополнительно описан на этапах 4.1 и 5.3.1. Калибровка также может быть достигнута с использованием коммерчески доступного счетчика ячеек, и в этом случае эталонное устройство не требуется. Этот процесс описан в шаге 4.2.
  4. Выберите высоту канала таким образом, чтобы самые большие ячейки, представляющие интерес, могли полностью удлиняться без ограничений в пределах сегмента сокращения2. Убедитесь, что высота канала больше hmin Equation 2 (это предполагает, что ячейка имеет сферическую предварительную деформацию, и что изометрическая деформация происходит по длине и высоте канала во время деформации).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая величину подимпульса тока, Equation 3чем больше hmin , тем ниже будет общий SNR.
  5. Проектирование и создание фотомаски с помощью программного обеспечения для автоматизированного проектирования с выбранной шириной канала. Пример файла приведен в дополнительном файле 1. Масштабируйте дизайн микрофлюидной маски на 1,5%, чтобы учесть усадку полидиметилсилоксана (PDMS) после отшелушивания от отрицательного мастера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Массив устройств может быть включен в одну маску, если общий массив не превышает размер пластины (дополнительный рисунок 1A).
  6. Спроектировать и создать фотомаску с электродами, которая будет использоваться для выполнения четырехточечного зондового измерения тока микрофлюидного устройства (рисунок 1D). Пример файла приведен в дополнительном файле 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Массив электродов может быть включен в одну маску, если массив не превышает размер стеклянной горки (дополнительный рисунок 1B).

2. Изготовление устройств (рисунок 2)

  1. Подготовьте электродные узоры на стеклянной подложке.
    1. Раскрутите покрытие, выровняйте и обработайте положительный фоторезист на простом стеклянном слайде в соответствии с техническим описанием продукта. Пример этой процедуры приведен в дополнительном файле 2.
    2. Выполняете нанесение металла, взлет и травление золота.
      1. Выполните тонкопленочное осаждение 75 Å Ti, 250 Å Pt и 250 Å Au на слайд. Пример этой процедуры с использованием электронно-пушечного испарения приведен в дополнительном файле 3.
      2. Погрузите слайд в ацетон на 15 минут, чтобы выполнить подъем лишнего металла.
      3. В вытяжном шкафу используйте одноразовую пипетку, чтобы капнуть отлитый золотой травил на область электродов, которые будут подвергаться воздействию микрофлюидного канала, как показано на дополнительном рисунке 2. Будьте осторожны, чтобы избежать падения травления в другом месте на слайде.
        ВНИМАНИЕ: Золотой травитель может вызвать раздражение кожи и глаз. Не дышите парами, и не глотайте. Обращайтесь с осторожностью, носите соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) и выбрасывайте отходы в соответствии с местными правилами утилизации.
      4. Промойте горку деионизированной (DI) водой и высушите ее сухим азотом (N2).
    3. Если на одном стеклянном слайде напечатано несколько электродов, нарежьте его кубиками на отдельные чипы.
      1. Используйте инструмент для резки стекла, чтобы забить слайд вдоль узорчатых границ электрода.
      2. Разбейте стекло вдоль партитуры, чтобы разбить слайд на отдельные фишки.
    4. Визуально осмотрите электроды под микроскопом. Убедитесь, что отдельные электроды не открыты электрически или что электроды не замыкаются вместе.
  2. Изготовьте отрицательную мастер-форму для каналов.
    1. Отшлифуйте покрытие, вымозите и обработайте эпоксидное сопротивление SU-8 на полированной кремниевой пластине в соответствии с техническим описанием продукта. Пример этой процедуры приведен в дополнительном файле 2.
    2. Измерьте высоту объекта с помощью профилометра и визуально осмотрите объекты под микроскопом (дополнительный рисунок 3). Убедитесь, что требуемая геометрия четко определена.
  3. Плесень PDMS каналов с мягкой литографией.
    1. Приготовьте PDMS путем взвешивания эластомера и сшивки в соотношении масс 10:1 в одноразовом стаканчике.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для пластины диаметром 3 г достаточно 30 г PDMS.
    2. Энергично перемешайте PDMS в течение 30 с одноразовой вилкой, пока PDMS не станет непрозрачной с пузырьками.
    3. Дегазация PDMS в вакуумной камере в течение примерно 30-90 минут или до тех пор, пока PDMS не станет прозрачной без видимых пузырьков.
    4. Поместите пластину с мастер-формой SU-8 в одноразовую чашку Петри и вылейте PDMS по центру пластины.
    5. Поместите чашку Петри, содержащую PDMS и пластину, в вакуумную камеру и дегазацию примерно на 30 минут или до тех пор, пока в PDMS не останется пузырьков.
    6. Выпекать PDMS при 80 °C в течение 2 ч в духовке или на конфорке.
    7. Острым лезвием вырежьте и снимите PDMS с отрицательного мастера СУ-8.
    8. Нарежьте формованную плиту PDMS кубиками в отдельные формы с помощью острого лезвия
    9. Закройте входные и выходные отверстия с помощью одноразового биопсийного перфоратора. Для достижения наилучших результатов используйте новый перфоратор для каждой плиты PDMS. Более острый перфоратор создает отверстия с гладкими краями, сводя к минимуму частицы, которые могут препятствовать каналу сжатия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр входных отверстий должен быть несколько меньше наружного диаметра трубки. Например, при использовании труб из политетрафторэтилена (PTFE) с наружным диаметром 1/32 дюйма следует пробить отверстие диаметром 1,5 мм.
  4. Прикрепите стеклянную/электродную подложку к каналам PDMS.
    1. Очистите стекла электрода метанолом (≥99,8%). Сухая сухимN2.
    2. Очистите устройство PDMS скотчем с последующим ополаскиванием изопропиловым спиртом (IPA) и деионизированной водой (DI; 18 МОм/см2). Сухая сухимN2. Затем снова очистите скотчем.
    3. Поместите стеклянную подложку со сборными электродами и подготовленную форму PDMS (стороной вверх) в плазменный очиститель.
    4. Подвергать обоим воздействию кислородной плазмы в течение 2 мин (100-300 мТорр, 30 Вт).
    5. Выровняйте и поместите форму PDMS стороной вниз лицевой стороной вниз на стеклянную подложку со сборными электродами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Склеивание происходит мгновенно, как только обработанные плазмой PDMS и стекло вступают в контакт; следовательно, дальнейшие изменения выравнивания будут невозможны. Для облегчения выравнивания 20 мкл разбавления метанола 2:1 в воде DI могут быть пипетированы на поверхность стекла, обработанного плазмой. Раствор метанола действует как физический барьер между обработанным стеклом и PDMS, позволяя корректировать выравнивание. При использовании метанола выпекайте выровненное и сопряженное устройство при 50 °C в течение 2 ч, чтобы испарить раствор и завершить процесс склеивания.
    6. Визуально осмотрите склеенное устройство под микроскопом. Убедитесь, что электроды и геометрия каналов правильно выровнены.

3. Измерение ячеек (рисунок 1D)

  1. Подготовьте источник давления, печатную плату, настольное оборудование и программное обеспечение для сбора данных.
    1. Подключите микрофлюидное устройство к печатной плате с помощью зажима. Пример печатной платы приведен в Дополнительном файле 4 (файлы GERBER) и Дополнительном файле 5 (файлы со списком схем, плат и частей печатных плат).
      1. Совместите подпружиненные штифты зажима с контактными прокладками электродов на микрофлюидном устройстве и совместите контакты зажима с отверстиями на печатной плате.
      2. Вставьте штифты коннектора зажима в отверстия печатной платы, убедившись, что подпружиненные штифты остаются выровненными с контактными прокладками электродов.
    2. Настройте и подключите электронное оборудование.
      1. Подключите два выходных порта блока питания к порту напряжения питания печатной платы с помощью двойного адаптера Neill-Concelman (BNC) и кабеля BNC.
      2. Включите блок питания. Установите выход, подключенный к внутреннему проводнику BNC, на +15 В, а другой выход - на -15 В. Включите оба выхода для питания цепи.
      3. Подключите трети выходных портов блока питания к порту входного напряжения печатной платы с помощью кабеля BNC. Установите на выходе нужное приложенное напряжение, но не включайте его до начала эксперимента.
      4. Подключите выходной токовый порт печатной платы к входу токового предусилителя с помощью кабеля BNC.
      5. Подключите выход текущего предусилителя к одному аналоговому входу на клеммном блоке BNC системы сбора данных с помощью кабеля BNC. Опционально подключите аналоговый фильтр нижних частот в соответствии с кабелем BNC для фильтрации высокочастотных помех.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшения SNR печатная плата и устройство могут быть размещены в толстом металлическом корпусе. Все кабели BNC и жидкостные трубки могут быть проложены через отверстия, просверленные в корпусе.
    3. Установка и настройка необходимого программного обеспечения на персональном компьютере (ПК)
      1. Включите питание и подключите контроллер давления к ПК. Установите все необходимое программное обеспечение контроллера давления в соответствии с инструкциями производителя.
      2. Установите MATLAB и набор инструментов сбора данных на ПК. Убедитесь, что установлены необходимые драйверы для системы сбора данных, чтобы интерфейс MATLAB Data Acquisition Toolbox мог их обнаружить.
      3. Загрузите прилагаемый скрипт сбора данных "NPS.m" со https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public.
    4. Откройте и настройте сценарий сбора данных.
      1. Задайте правильные значения для инициализации сеанса сбора данных, который включает идентификатор поставщика, идентификатор устройства DAQ и номер аналогового входного канала (строки 34–36 во включенном скрипте).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Идентификатор устройства можно найти с помощью функции "daq.getDevices" или "daqlist".
      2. Установите требуемую частоту дискретизации для сбора (строка 23 во включенном скрипте). Для достижения оптимальных результатов она должна быть установлена на частоту не менее 10 кГц.
  2. Подготовьте клеточную суспензию.
    1. Приготовьте раствор 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в 1x фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) и процедите фильтром 0,22 мкм.
    2. Культивируйте и подготавливайте клетки в соответствии с соответствующим протоколом клеточной культуры клеточной линии выбора. Суспендировать клетки в приготовленном растворе 2% FBS в 1x PBS в концентрации 1-5 x 105 клеток/мл. Держите клетки на льду на время экспериментов.
  3. Измерьте физические свойства клеток.
    1. Загрузите образец ячейки в трубку и подключите его к входному отверстию устройства.
      1. Отрежьте 30 см трубки из PTFE лезвием бритвы или острым ножом.
      2. Прикрепите один конец трубки к шприцу luer lock. Используйте шприц, чтобы вытащить образец клетки на другой конец трубки.
      3. Осторожно вставьте трубку во входное отверстие устройства.
      4. Подключите противоположный конец трубки к микрофлюидному регулятору давления.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Между микрофлюидным регулятором давления и трубкой может быть добавлен фильтр для предотвращения обратного потока жидкости в регулятор давления.
    2. Запустите эксперимент.
      1. Установите желаемое постоянное давление привода на программное обеспечение контроллера давления и позвольте образцу заполнить устройство.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Давление обычно составляет 2-21 кПа. Скорость потока должна быть достаточно медленной, чтобы обеспечить четко определенные импульсы, но достаточно быстрой, чтобы обеспечить адекватную пропускную способность.
        1. Если в микрофлюидных каналах образуются пузырьки, используйте тупиковое заполнение: заткните выходное отверстие устройства и приложите низкое давление к входу, чтобы вытеснить воздух через газопроницаемую PDMS. Оставление пузырьков в канале приведет к нестабильной исходной линии тока и помешает точным измерениям.
        2. Если мусор забивает микрофлюидный канал, снимите его, слегка надавливая на верхнюю часть устройства PDMS во время применения давления привода, «пульсируя» более высокое давление, переключая и выключая давление, или снимая трубку и снова вставляя ее. Если мусор остается, может потребоваться переключиться на новое устройство.
      2. Установите нужное напряжение, вращая ручку напряжения на блоке питания, и включите напряжение, нажав кнопку Вкл .
        ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжение обычно составляет 1-5 В. Выберите самое низкое напряжение, необходимое для адекватного SNR. Одно и то же напряжение должно использоваться во всех условиях для сравнения.
      3. Включите текущий предусилитель и установите чувствительность (A/V) как можно ниже; в качестве альтернативы установите коэффициент усиления (В/А) как можно выше, не перегружая предусилитель и не превышая максимальное аналоговое входное напряжение DAQ. В этом исследовании чувствительность была установлена на уровне 10-7 А/В.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное значение чувствительности/усиления будет зависеть как от приложенного напряжения, так и от базового сопротивления микрофлюидного канала.
      4. Нажмите зеленую кнопку Выполнить в меню ленты MATLAB, чтобы начать сценарий сбора данных NPS.m и начать выборку и сохранение данных.
      5. Чтобы завершить эксперимент, нажмите кнопку Стоп в левом нижнем углу окна рисунка, чтобы остановить скрипт сбора данных. Отключите выход блока питания, нажав кнопку Вкл . Установите нулевое давление источника давления в программном обеспечении контроллера давления.
      6. На этом этапе эксперимент можно приостановить, чтобы выполнить одно или несколько из следующих действий:
        1. Замените текущее устройство новым.
        2. Перезагрузите трубку с большим количеством образцов клеток.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать перекрестного загрязнения образца, используйте новые устройства для измерения клеток различных типов или условий.
        3. Отсоедините устройство от печатной платы и изучите состояние канала под микроскопом. Чтобы перезапустить эксперимент с использованием того же устройства, необходимо позаботиться о том, чтобы не вводить пузырьки воздуха. Может потребоваться приложить мягкое давление к плунжеру шприца, чтобы сохранить образец ячейки в самом конце трубки при вставке его во входное отверстие устройства.

4. Калибровка микрофлюидного устройства

  1. Вариант 1: Измерьте полистирольные шарики в эталонных устройствах.
    1. Выберите размер полистирольного шарика, который меньше, чем калибровочный канал.
    2. Добавьте 1,5% бусин tween и полистирол в фильтрованный раствор PBS и FBS, используемый во время экспериментов в клетках, в концентрации 1-3 x 105 шариков/мл.
    3. Продолжайте эксперимент, как описано в разделе 3, используя эталонное устройство, описанное на шаге 1.3, и применяйте то же напряжение, которое использовалось во время эксперимента. Используйте среднюю величину текущей капли, образующейся при прохождении шариками через пористые размеры и известный диаметр бусин, для расчета De, как описано в разделе 5.
  2. Вариант 2: Независимое измерение размера ячейки с помощью отдельного измерительного устройства.
    1. Вместо того, чтобы следовать протоколу на этапе 4.1, используйте коммерчески доступный инструмент измерения размера клеток для измерения среднего размера ячеек в образце. В этом случае эталонное устройство не требуется. Используйте среднее падение тока, полученное при прохождении ячейками по длине размера, и измеренный средний диаметр ячейки для расчета De, как описано в разделе 5.

5. Анализ данных для извлечения фенотипов клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка данных может быть выполнена с помощью файла интерфейса командной строки MATLAB mNPS_procJOVE.m at https://github.com/sohnlab/NPS-analysis-JOVE. Дополнительные инструкции см. в дополнительном файле 6 .

  1. Предварительная обработка данных (рисунок 3A).
    1. Вычислите измеренный электрический ток, применив значение коэффициента усиления, используемое в предусилителе ток-напряжение, к необработанным данным, полученным DAQ.
    2. Удалите высокочастотный шум, применив прямоугольную функцию сглаживания и/или фильтр нижних частот к измерению необработанного тока. Затем выполните ресамплинг отфильтрованных данных с более низкой частотой дискретизации. Кроме того, вычислите соответствующие данные метки времени при этой более низкой частоте дискретизации.
    3. Вычислить установленный базовый токовый сигнал, применив такой метод, как асимметричное сглаживание наименьших квадратов26.
    4. Вычислите приближенную первую производную (разностный сигнал) предварительно обработанных текущих данных, взяв разницу между последующими точками данных.
  2. Идентификация событий в ячейках и извлечение субимпульсных данных (рисунок 3B).
    1. Поиск событий ячеек-кандидатов путем изучения предварительно обработанных данных. Отклоняйте события ячейки, которые перекрываются с другими событиями ячейки (т.е. событиями совпадения) (дополнительный рисунок 4), демонстрируют плохое базовое соответствие или имеют неожиданную или ошибочную форму импульса (например, когда в канале может присутствовать засорение).
    2. Извлеките данные подимпульса для каждого события ячейки.
      1. Каждый узел-поровой сегмент будет отображаться как соответствующий субимпульс в общем сигнальном импульсе (рис. 1В, С). Определите начало каждого подимпульса, вычислив точку времени, когда разностный сигнал достигает локального минимального значения. Определите конец каждого подимпульса, вычислив точку времени, когда разностный сигнал достигает локального максимального значения.
      2. Определите ширину каждого подимпульса как время, прошедшее между начальной и конечной точками времени. Определите амплитуду каждого подимпульса, вычислив среднее значение разницы между измеренным током и базовым током для всех точек данных между начальной и конечной точками времени.
  3. Определите механофенотип клетки для каждого события клетки на основе данных подимпульса.
    1. Определите диаметр ячейки d на основе уравнения, определенного Деблуа иБином 24:
      Equation 4
      где ΔI/I — среднее отношение амплитуды субимпульса к исходному току в подвыпульчатых значениях, De — эффективный диаметр канала (измеренный на шаге 4), а L — общая длина канала узел-пора.
      1. De определяется путем вычисления среднего значения ΔI/I , полученного набором частиц известного диаметра (либо ячеек, либо шариков, см. шаг 4), используя этот известный диаметр как d, и решая Eq. 1 для De.
    2. Количественно оцените устойчивость клетки к деформации.
      1. Определите скорость потока U жидкости, вычислив среднюю скорость ячейки в подпусках размеров, используя известные длины сегментов и измеренную продолжительность каждого субимпульса.
      2. Определите индекс деформируемости целых клеток (wCDI), определяемый Kim et al.2 как:
        Equation 5
        где Lc — длина отрезка сжатия, h-канал — высота канала, а ΔTc — длительность подимпульса сжатия.
    3. Определите время восстановления клетки от деформации, определяемое как первый субимпульс восстановления с амплитудой в пределах 8% от средней амплитуды от размера субимпульса2.
    4. Рассчитайте поперечную деформацию ячейки в сегменте сжатия.
      1. Вычислите эффективный диаметр сегмента сжатия (De,c), определенный Kim et al.2: Equation 6, где wc - ширина сегмента сжатия, а wnp - ширина всех остальных сегментов.
      2. Вычислите эквивалентный сферический диаметр dc ячейки внутри сжатия, снова используя уравнение, определенное Деблуа и Бином24:
        Equation 7
        где ΔIc/Ic — отношение амплитуды субимпульса к исходному току в подимпульсе сжатия, а Lc — длина отрезка сжатия.
      3. Рассчитайте длину удлинения ячейки Lдеформации , как описано Kim et al.2:
        Equation 8
      4. Наконец, вычислите поперечную деформацию клетки δдеформации, которая определяется Kim et al.2 как Equation 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Представленная здесь платформа механофенотипирования представляет собой простой и универсальный подход к измерению биофизических свойств отдельных клеток с умеренной пропускной способностью. Клетки протекают через микрофлюидный канал (рисунок 1А) с использованием постоянного потока, управляемого давлением. По мере прохождения клеток длина микрофлюидного канала и производимые импульсы тока регистрируются с помощью аппаратного обеспечения сбора данных. Полученный сигнал (рисунок 1B, C) затем обрабатывается с использованием пользовательского программного обеспечения НА MATLAB для извлечения соответствующих механических свойств одной ячейки. На рисунке 1D представлен графический обзор экспериментального протокола.

Для изготовления устройств первоначально создается отрицательная мастер-форма, которая используется для отливки PDMS (рисунок 2). Успешные мастер-формы, показанные на дополнительном рисунке 3, содержат гладкие вертикальные боковые стенки и не имеют дефектов в микрофлюидном канале (рисунок 4Ai). Следует соблюдать осторожность при изготовлении этой первоначальной мастер-формы, потому что в плохо изготовленных пластинах (дополнительный рисунок 3) любые дефекты будут передаваться на все последующие отливки PDMS (рисунок 4Aii), что делает их непригодными для использования. Успешные отливки PDMS затем связываются плазмой со стеклянными слайдами с помощью узорчатых электродов (рисунок 1A).

Для экспериментов электродные прокладки устройства подключаются к печатной плате (рисунок 1D) для измерения тока. Трубка, содержащая образец клетки, затем вставляется во входное отверстие устройства и подключается к микрофлюидному контроллеру потока, обеспечивая поток клеток под давлением через микрофлюидный канал. Важно отметить, что во время эксперимента отображается динамическое считывание текущего измерения. Это позволяет пользователям убедиться, что их устройство работает должным образом. Успешные события клеточного транзита состоят из легко различимых субпульсов (рисунок 4Bi). Осложнения, такие как засорение, могут возникать во время экспериментов и могут быть идентифицированы по живому считыванию событий с аномальными формами пульса (рисунок 4Bii).

Для анализа данных критические параметры сигнала, которые необходимо извлечь для каждого события транзита ячейки, подробно описаны на рисунке 1B и описаны на шаге 5.2.2. Необработанный сигнал должен иметь достаточный SNR для фильтрации шума и извлечения значимых компонентов (рисунок 3A). Критически важно, что текущий подъем сигнала от каждого узла должен быть достаточно надежным, чтобы подпульсы можно было легко идентифицировать по разностному сигналу ∂I/∂t (рисунок 3B).

Измеренное время wCDI и восстановления может быть использовано для проведения прямых сравнений между клетками или условиями. В частности, wCDI является относительным показателем жесткости клеток, который обратно пропорционален модулю упругости (дополнительный рисунок 5); таким образом, большее значение wCDI соответствует более мягкому механическому фенотипу. Например, на рисунке 5A злокачественные клетки MCF-7 имеют большее распределение wCDI , чем незлокачественные клетки MCF-10A, что указывает на то, что злокачественные клетки MCF-7 мягче, чем их незлокачественные аналоги MCF-10A. Это согласуется с многочисленными эмпирическими исследованиями, которые показали, что раковые клетки мягче, чем их незлокачественные аналоги27. Аналогичным образом, на рисунке 5B клетки MCF-10A и MCF-7, обработанные латрункулином, показывают увеличение wCDI. Латрункулин является мощным фармакологическим средством, которое разрушает актиновый цитоскелет28. Следовательно, последовательно наблюдать больший wCDI и, следовательно, более мягкий фенотип в клетках, обработанных этим препаратом. Наконец, на рисунке 5C wCDI сравнивается между двумя подлиниями эпителиальных клеток молочной железы человека, просветным эпителиальным (LEP) и миоэпителиальным (MEP). В этом сравнении снова существует отчетливое распределение wCDI , дифференцирующее два основных типа клеток, что указывает на то, что клетки LEP мягче, чем клетки MEP. Помимо wCDI, время восстановления также может быть количественно определено, чтобы обеспечить относительный показатель вязкости клеток. Более длительное время восстановления указывает на более вязкий фенотип. На рисунке 5D представлено время восстановления, разделенное на три отдельные категории, для каждого из условий на рисунках 5A-C. Необработанные MCF-10As и MCF-7 имеют большую долю клеток, которые восстанавливаются мгновенно (ΔTr = 0), что указывает на более низкую вязкость, чем их аналог, обработанный латрункулином.

wCDI и время восстановления являются относительными показателями одноклеточной упругости и вязкости. Поэтому метод, представленный здесь, лучше всего подходит для характеристики дифференциального ответа между несколькими интересующими образцами. В своем нынешнем виде протокол, представленный здесь, не дает абсолютных количественных оценок определенных механических параметров, таких как модуль Юнга.

Figure 1
Рисунок 1: Обзор платформы механофенотипирования. (A) Изображение микрофлюидного устройства. (B) Геометрия канала с репрезентативным импульсом тока от события транзита одной ячейки. ΔInp представляет собой падение тока от ячейки, входящей в пору, а ΔIc представляет собой падение тока от ячейки, входящей в сокращение. ΔTp представляет время, необходимое ячейке для прохождения поры, ΔTc представляет время, необходимое ячейке для прохождения канала сжатия, а ΔTr представляет время, необходимое для восстановления клетки. (C) Реальный импульс тока от события транзита клетки. (D) Экспериментальный рабочий процесс: (1) клетки суспендируются в PBS и (2) проходят через микрофлюидное устройство с постоянным давлением. Когда клетки проходят через микрофлюидный канал, (3) импульсы тока измеряются с использованием аппаратного обеспечения сбора данных. (4) Импульсы тока анализируются для извлечения нескольких одноэлементных механических свойств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Обзор изготовления устройств. (A) Отрицательные мастер-формы (1) изготавливаются с использованием фотолитографии. (2) Затем PDMS отливается на отрицательные мастер-формы. (3) Формованные устройства нарезаны кубиками, с пробитостью входных и выходных отверстий. (B) Одновременно стеклянные слайды имеют (1) рисунок для изготовления металлических электродов. (2) Испарение E-балки используется для осаждения металла на затвор, за которым следует (3) процесс подъема для удаления избытка металла, оставляя после себя желаемые металлические электроды. (C) Затем устройство PDMS и стекло с металлическими электродами связываются вместе с использованием кислородной плазмы для завершения процесса изготовления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Обработка и анализ данных. (A) Необработанные текущие данные (слева) предварительно обрабатываются (справа) путем применения прямоугольной функции сглаживания и фильтра нижних частот с последующей ресамплингом до более низкой частоты дискретизации. Базовый токовый сигнал впоследствии снабжается асимметричным сглаживанием наименьших квадратов26. (B) Временные точки в начале и конце каждого подимпульса определяются как локальные минимумы и максимумы, соответственно, в разностном сигнале ∂I/∂t (слева). Для каждого субимпульса ширина Δt определяется временем, прошедшим между началом и концом, а амплитуда ΔI определяется средней разницей между измеренным током и базовым током. Извлеченные субимпульсные данные могут быть представлены в виде прямоугольного сигнала (справа); каждый подимпульс соответствует одному сегменту в геометрии устройства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Примеры успешных и ошибочных результатов во время изготовления и экспериментов. (A) Изображения слепков PDMS сегментов сжатия, взятые из двух разных форм с отрицательным мастером. (i) является примером хорошо изготовленного канала с гладкими боковинами, четко определенной геометрией и без заметных дефектов. (ii) является примером плохо сфабрикованного канала со значительными дефектами в канале сжатия (очерченного красными прямоугольниками), который либо полностью, либо частично препятствует потоку частиц (шкала = 150 мкм). (B) Примеры отфильтрованных импульсов тока, генерируемых "NPS.m" при сборе данных. (i) Пример успешного события ячейки, когда ячейка проходит по каналу по назначению. (ii) Пример импульсов тока, производимых при «засорении» прибора. В этом случае мусор препятствует потоку клеток во второй поре канала. Это приводит к событиям в клетке, которые кажутся «отрезанными» (обозначенными красной линией) в середине второго импульса размера. Уменьшение тока (обозначенное синими линиями) после «отсечения» вызвано частицами (мусором или клетками), которые накапливаются вокруг засора и, следовательно, блокируют большую часть потока тока. Резкий нисходящий всплеск тока (обозначенный зеленым прямоугольником) отражает частицу, которая способна проходить вокруг завала и, следовательно, только временно блокировать большую часть тока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Примеры wCDI и восстановления клеток между различными состояниями. (A) распределение wCDI между двумя эпителиальными клеточными линиями молочной железы, незлокачественным MCF-10A и злокачественным MCF-7. (B) wCDI MCF-10A или MCF-7, где каждый тип клеток не лечили, обрабатывали Lat-A и лечили Lat-B. (C) распределение wCDI между двумя основными эпителиальными линиями молочной железы человека: миоэпителиальными (MEP) и люминальными эпителиальными (LEP) клетками. (D) Время восстановления, соответствующее четырем условиям среди A, B и C. Время восстановления было ограничено для удобства просмотра. Все условия имели размер выборки n = 99 клеток. Эта цифра воспроизводится с разрешения Кима и др.2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Примеры массивов устройств как для микрофлюидных каналов, так и для электродов. Оба изображения, представленные в виде прозрачных масок, должны быть оформлены белым (представляющим прозрачный) в областях, где фоторезист будет подвергаться воздействию ультрафиолета, и черным в областях, где он будет заблокирован от воздействия ультрафиолета. (A) Массив микрофлюидных каналов с двумя параллельными каналами на «устройство» (прямоугольник), расположенных на пластине 3 в Si. Устройство в крайнем правом углу помечено как "ref" и предназначено, как описано в шаге 1.3, для использования в калибровке. (B) Массив электродов с двумя электродами на устройство, так что оба канала в устройстве от (A) будут выравниваться над каждой конструкцией электрода от (B). Этот массив был расположен для стеклянной горки 2 в x 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Схемы, иллюстрирующие области конструкции электрода и способы правильного травления золота (этап 2.1.2.3). Верхний слой золота должен быть удален с измерительных электродов, иначе во время измерения произойдет биообрастание и электролиз. Тем не менее, золото должно оставаться на контактных площадках, потому что мягкое золото обеспечивает превосходное электрическое соединение с контактами разъема pogo pin. (A) Схема, показывающая, как микрофлюидный канал (синим цветом) пересекается с узорчатым металлом (черный). Как указано, металл перпендикулярен микрофлюидному каналу и непосредственно под ним находятся измерительные электроды, где необходимо травить золото, в то время как крупные металлические прямоугольники в сторону канала являются контактными площадками, где должно оставаться золото. (B) Схема, показывающая, где золотой травиль должен наноситься на узорчатый металл, а также где он не должен наноситься. Зеленая область указывает, где необходимо травление, желтая область указывает, где может произойти травление и не повлияет на эффективность устройства, а красная область указывает, где золото не должно травиться. (C) Схема, показывающая типичное, успешно вытравленное устройство. Желтым цветом обозначены области, где золото все еще присутствует, а серым — регионы, где обнажен платиновый слой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Изображения успешно и плохо изготовленных каналов сокращения. (A) Изображения каналов сжатия на отрицательных мастер-формах из двух отдельных кремниевых пластин. (i) Пример хорошо изготовленной мастер-формы, которая могла бы создать идеальный канал PDMS, такой как показанный на рисунке 4Ai. ii) Пример плохо изготовленной мастер-формы, которая использовалась для создания канала PDMS, показанного на рисунке 4Aii. Области, выделенные красными прямоугольниками, соответствуют дефектам, указанным на рисунке 4Aii, демонстрируя перенос дефектов из главной формы в микроканалы PDMS (шкала = 150 мкм). (B) Изображения поперечного сечения каналов сжатия PDMS, показывающие высоту и ширину различных форм. Эти поперечные сечения были получены путем нарезки канала сжатия PDMS перпендикулярно направлению потока. i) пример хорошо изготовленной формы PDMS, созданной с использованием пластины, показанной в (Ai), демонстрирующей гладкие вертикальные боковые стенки. ii) пример плохо изготовленной формы PDMS, изготовленной с использованием пластины, показанной в (Aii), демонстрирующей наклонные боковые стенки (шкала = 20 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Пример совпадающего клеточного события (возникающего, когда более одной клетки проходит через канал одновременно). Сигнал обрабатывался в соответствии с этапами 5.1.1-5.1.3 раздела 5 протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 5: Соотношение между wCDI и модулем упругости 20,29,30,31,32,33,34,35. (A) Сравнение клеток Jurkat, MCF7 и MCF10A, измеренных с помощью этого метода, с аспирацией микропипетки. wCDI обратно пропорционален корковому напряжению. (B) Сравнение клеток MCF7 и MCF10A, измеренных с помощью этого метода, с опубликованными данными AFM. (C) Сравнение элементов A549 и BEAS-2B, измеренных с помощью этого метода, с опубликованными данными AFM. Для нескольких типов клеток wCDI обратно пропорционален модулю упругости. Эта цифра была воспроизведена с разрешения Кима и др.2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 1: Примеры методов механофенотипирования с одной клеткой и их сравнение с механо-НПВ. Методики перечислены в порядке увеличения пропускной способности 12,2,36,37. Механическая информация относится к тому, может ли устройство измерять как упругие, так и вязкие механические свойства каждой ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 2: Пример размера, сжатия и восстановления ширины сегментов для различных линий ячеек. MEP и LEP относятся к двум линиям первичных эпителиальных клеток молочной железы человека, где MEP относится к миоэпителиальным клеткам, а LEP относится к просветным эпителиальным клеткам 2,8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Пример проектирования AutoCAD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Пример протокола для обработки фотолитографии. Описаны два примера протоколов для моделирования и обработки фоторезиста или эпоксидной смолы СУ-8. Первый описывает применение положительного фоторезиста на стеклянном слайде, чтобы действовать как жертвенный слой для изготовления электродов. Во втором описано применение эпоксидной смолы СУ-8 на кремниевой пластине для создания рельефных структур для формования микрофлюидных каналов PDMS. Эти протоколы были адаптированы из спецификаций MF-321 и SU8 3000 от производителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Пример протокола для тонкопленочного осаждения 75 Å Ti, 250 Å Pt и 250 Å Au с использованием электронно-лучевого испарения. Описан пример протокола для выполнения тонкопленочного осаждения 75 Å Ti, 250 Å Pt и 250 Å Au с использованием электронно-лучевого испарителя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 4: Файлы GERBER Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 5: Список деталей схемы, платы и печатной платы Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 6: Интерфейс командной строки MATLAB. Этот файл содержит подробные инструкции по обработке данных с использованием интерфейса командной строкиMATLAB 26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Измерение механических свойств отдельных ячеек с помощью этого метода механофенотипирования состоит из трех этапов: изготовление устройства, сбор данных и анализ данных. На каждом этапе есть заметные аспекты, которые могут значительно повлиять на результаты экспериментов. Во время изготовления устройства последовательная геометрия канала и однородность между устройствами имеют важное значение для точных и воспроизводимых результатов. В частности, боковые стенки каждого устройства должны быть относительно гладкими (рисунок 4Ai), а высота канала между реплицируемыми устройствами должна быть сопоставимой. Любые устройства с дефектами, которые частично препятствуют потоку клеток, особенно в канале сжатия (рисунок 4Aii), должны быть выброшены. Использование устройств с заметными дефектами геометрии канала приведет к неточным и невоспроизводимым результатам. Во время сбора данных очень важно, чтобы пользователь мог распознать наличие засора в канале во время сбора данных. Пример скрипта "NPS.m" (доступен в https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public) отображает текущие измерения, позволяя пользователю отслеживать состояние канала и события транзита ячеек в режиме реального времени. Импульсы, характерные для засора, показаны на рисунке 4B. Засорение в канале сокращения, которое все еще позволяет некоторым клеткам течь, особенно важно для устранения, поскольку клетки будут испытывать повышенную нагрузку в месте обструкции, что приводит к неточным wCDI. Наконец, во время анализа данных пользователи должны усердно выбирать точные пороговые значения в качестве входных данных для алгоритма анализа. Если пороговые значения установлены слишком высоко, программа не будет идентифицировать события, производимые меньшими клетками, искажая результаты и искажая измеренную популяцию клеток.

Помимо этих критических этапов, существуют дополнительные аспекты протокола, которые могут потребовать корректировки при изучении различных типов клеток или условий. Например, применение этого метода к образцам, которые значительно меньше, чем те, которые были изучены ранее, требует более узких каналов сокращения. Изготовление более узких каналов может потребовать более дорогостоящих методологий изготовления, таких как электронно-лучевая литография38. Кроме того, поскольку сокращение ΔI/I ~ ΔVячейки/ΔV (гдеV-ячейка иV-образное сокращение являются объемами деформированной ячейки и канала соответственно), более узкие каналы приводят к увеличению базовых сопротивлений и снижению SNR19. Наконец, узкие каналы могут увеличить риск засорения, что делает экспериментальное выполнение более сложным. Эту конкретную проблему потенциально можно было бы смягчить, используя больше входных фильтров.

Одним из ограничений этого метода является статический канал сокращения, который может применять только один средний штамм к популяции клеток. Чтобы сравнить деформируемость клеток с различными размерами или исследовать одну популяцию клеток при различных применяемых штаммах, необходимо использовать несколько устройств с различной шириной канала сжатия. Платформа также ограничена своими стенками PDMS, которые ограничивают диапазон жесткости, которую она может измерить. Например, некоторые очень жесткие растительные клетки жестче, чем стенки PDMS, которые, как ожидается, деформируют их39,40. Кроме того, давление, необходимое для проталкивания таких жестких частиц через канал сжатия, может преодолеть прочность связи между PDMS и стеклом, что приводит к расслоению. Тем не менее, можно было бы изготовить микрофлюидные каналы в более жесткие материалы, такие как стекло или кремний, чтобы таким образом преодолеть эти ограничения. Несмотря на эти незначительные ограничения, эта платформа остается идеальной для механического измерения ячеек с умеренной пропускной способностью. По сравнению с другими методологиями, такими как оптические носилки или AFM, этот метод обеспечивает более высокую пропускную способность. По сравнению с другими микрофлюидными технологиями с умеренной и высокой пропускной способностью, такими как RT-DC, этот метод способен исследовать больше биофизических свойств путем измерения как вязких, так и упругих свойств отдельных клеток. Наконец, простая экспериментальная установка, использующая недорогую электронику в отличие от сложной оптики, делает эту технику очень доступной технологией.

В целом, этот метод механофенотипирования имеет огромные перспективы в качестве инструмента для многочисленных потенциальных исследований и применений. Ранее он применялся к разнообразному набору типов клеток, включая первичные образцы, и показал свою эффективность при измерении влияния цитоскелетных и ядерных компонентов на вязкоупругие свойства клеток 2,8. Кроме того, поскольку клетки остаются жизнеспособными после скрининга с помощью этой платформы2, исследователи имеют возможность выполнять последующий анализ. Эта платформа также идеально подходит для связи с первичной сортировкой микрофлюидных клеток, что позволяет использовать такие приложения, как измерение циркулирующих опухолевых клеток. Заглядывая в будущее, эта платформа остается конкурентоспособным и универсальным инструментом для многомерных механических измерений одиночных клеток, с приложениями для понимания поведения клеток41, определения прогрессирования заболевания42 и мониторинга лекарственного ответа43. Помимо фундаментальных научных исследований, этот метод также имеет большие перспективы в качестве клинического инструмента, в частности недорогой настольной платформы для быстрого диагностического скрининга. Кроме того, учитывая низкие требования к энергопотреблению и минимальную потребность в подготовке образцов перед измерением, этот метод особенно хорошо подходит для сред с низким уровнем ресурсов, где крайне необходимы доступные диагностические приборы44.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

L. L. S имеет патент США No 11 383 241: «Mechano-node-pore sensing», J. Kim, S. Han и L. L. Sohn, выданный 12 июля 2022 года.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано грантами NIBIB 1R01EB024989-01 и NCI 1R01CA190843-01. A. L. и R. R. были поддержаны стипендией H2H8 Association Graduate Research Fellowship. K. L. C. была поддержана стипендией Национального научного фонда для аспирантов и стипендией Siebel Scholar Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone J.T. Baker 5356-05 Purity (GC)  ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker)
Aluminum Foil n/a n/a
Analog Low-Pass Filter ThorLabs EF504 ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0)
Biopsy Punch Integra Miltex 33-31AA-P/25 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25)
Blade n/a n/a
BNC Cable Pomona Electronics 2249-C-12 https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_
medium=cpc&utm_campaign=
Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term=
&utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ
pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx
mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs
w-EALw_wcB
Cleanroom Polyester Swab Thermo Fisher Scientific 18383 https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383
Current Preamplifier DL Instruments 1211 https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_
id=1419
Custom PCB (w/ components) n/a n/a see Supplemental files 4 and 5
DAQ Terminal Block National Instruments BNC-2120 https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html
DAQ to BNC-2110 cable  National Instruments SHC68-68-EPM https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html
Data Acquisition Board (DAQ) National Instruments PCI-6251 https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html
Dessicator Thermo Fisher Scientific 5311-0250 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250
Female BNC To Banana Plug Adapter Pomona Electronics 72909 https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 89510-186 https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs
Glass Cutter Chemglass CG-1179-21 https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips
Gold Etchant TFA Transene NC0977944 https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944
Hot Plate Thermo Fisher Scientific SP131825 
Isopropyl Alcohol Spectrum Chemical I1056-4LTPL Purity (GC)  ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056)
Metal Hardware Enclosure Hammond Manufacturing EJ12126 https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415
Methanol Sigma-Aldrich 34860 Purity (GC)  ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561)
MF-321 Developer Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/mf-321/
MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist DuPont n/a https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049
Photomask Fineline Imaging n/a Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/)
Plain Glass Microscope Slide Fisher Scientific 12-553-5B Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm 
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-001 https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/
Plastic Petri Dish Thermo Fisher Scientific FB0875712 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712)
Pressure Controller Fluigent MFCS-EZ https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/
Pressure Controller Software Fluigent MAESFLO
Programming & Computation Software MATLAB R2021b for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html)
PTFE Tubing Cole Parmer 06417-31 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731)
Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter Millapore Sigma PHCC20060 https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060
Silicon Wafer Wafer World 2885 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885)
Spin Coater n/a n/a
SU-8 3025 Negative Photoresist Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/su-8-2000/
SU8 Developer Kayaku Advanced Materials n/a https://kayakuam.com/products/su-8-developer/
Sygard 184 Polydimethlysiloxane Dow Chemical 4019862 https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Tape Scotch 810-341296 https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid=
Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO
2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm
vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH
VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB
Titanium, Platinum, Gold n/a n/a
Triple Output Power Supply Keysight E36311A https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653
UV Mask Aligner Karl Suss America MJB3 Mask Aligner 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pegoraro, A. F., Janmey, P., Weitz, D. A. Mechanical properties of the cytoskeleton and cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (11), 022038 (2017).
  2. Kim, J., et al. Characterizing cellular mechanical phenotypes with mechano-node-pore sensing. Microsystems & Nanoengineering. 4, 17091 (2018).
  3. Mierke, C. T. Bidirectional mechanical response between cells and their microenvironment. Frontiers in Physics. 9, 619 (2021).
  4. Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, and metastasis: The force journey of a tumor cell. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1), 113-127 (2009).
  5. Nia, H. T., Munn, L. L., Jain, R. K. Physical traits of cancer. Science. 370 (6516), (2020).
  6. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463 (7280), 485-492 (2010).
  7. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  8. Li, B., et al. Mechanical phenotyping reveals unique biomechanical responses in retinoic acid-resistant acute promyelocytic leukemia. iScience. 25 (2), 103772 (2022).
  9. Kozminsky, M., Sohn, L. L. The promise of single-cell mechanophenotyping for clinical applications. Biomicrofluidics. 14 (3), 031301 (2020).
  10. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  11. Wottawah, F., et al. Optical rheology of biological cells. Physical Review Letters. 94 (9), 1-4 (2005).
  12. Darling, E. M., Di Carlo, D. High-throughput assessment of cellular mechanical properties. Annual Review of Biomedical Engineering. 17 (1), 35-62 (2015).
  13. Carey, T. R., Cotner, K. L., Li, B., Sohn, L. L. Developments in label-free microfluidic methods for single-cell analysis and sorting. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 11 (1), 1529 (2019).
  14. Bagnall, J. S., et al. Deformability of tumor cells versus blood cells. Scientific Reports. 5, 18542 (2015).
  15. Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
  16. Otto, O., et al. Real-time deformability cytometry: On-the-fly cell mechanical phenotyping. Nature Methods. 12 (3), 199-202 (2015).
  17. Gossett, D. R., et al. Hydrodynamic stretching of single cells for large population mechanical phenotyping. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (20), 7630-7635 (2012).
  18. Guck, J., Chilvers, E. R. Mechanics meets medicine. Science Translational Medicine. 5 (212), 3-6 (2013).
  19. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing: A robust, high-dynamic range method for detecting biological species. Lab on a Chip. 13 (7), 1302-1307 (2013).
  20. Carbonaro, A., Sohn, L. L. A resistive-pulse sensor chip for multianalyte immunoassays. Lab on a Chip. 5 (10), 1155-1160 (2005).
  21. Saleh, O. A., Sohn, L. L. Direct detection of antibody-antigen binding using an on-chip artificial pore. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (3), 820-824 (2003).
  22. Saleh, O. A., Sohn, L. L. An artificial nanopore for molecular sensing. Nano Letters. 3 (1), 37-38 (2003).
  23. Saleh, O. A., Sohn, L. L. Quantitative sensing of nanoscale colloids using a microchip Coulter counter. Review of Scientific Instruments. 72 (12), 4449-4451 (2001).
  24. DeBlois, R. W., Bean, C. P. Counting and sizing of submicron particles by the resistive pulse technique. Review of Scientific Instruments. 41 (7), 909-916 (1970).
  25. Li, B., et al. Evaluating sources of technical variability in the mechano-node-pore sensing pipeline and their effect on the reproducibility of single-cell mechanical phenotyping. PLoS ONE. 16 (10), 0258982 (2021).
  26. Zhang, Z. M., Chen, S., Liang, Y. Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. Analyst. 135 (5), 1138-1146 (2010).
  27. Alibert, C., Goud, B., Manneville, J. B. Are cancer cells really softer than normal cells. Biology of the Cell. 109 (5), 167-189 (2017).
  28. Fujiwara, I., Zweifel, M. E., Courtemanche, N., Pollard, T. D. Latrunculin A accelerates actin filament depolymerization in addition to sequestering actin monomers. Current Biology. 28 (19), 3183-3192 (2018).
  29. Saleh, O. A. A novel resistive pulse sensor for biological measurements. , Princeton University. Princeton. PhD Thesis (2003).
  30. Dokukin, M. E., Guz, N. V., Sokolov, I. Quantitative study of the elastic modulus of loosely attached cells in AFM indentation experiments. Biophysical Journal. 104 (10), 2123-2131 (2013).
  31. Li, Q., et al. Probing the elasticity of breast cancer cells using AFM. 13th International Conference on Biomedical Engineering. IFMBE Proceedings. Lim, C. T., Goh, J. C. H. 23, Springer. Berlin, Heidelberg. 2122-2125 (2009).
  32. Rother, J., et al. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046 (2014).
  33. Li, Q., et al. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (4), 609-613 (2008).
  34. Xu, C., et al. Elasticity measurement of breast cancer cells by atomic force microscopy. Proc. SPIE 9230. Twelfth International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine. (PIBM 2014). 92300, (2014).
  35. Alcaraz, J., et al. Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 84 (3), 2071-2079 (2003).
  36. Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic force microscopy in characterizing cell mechanics for biomedical applications: A review. IEEE Transactions on Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
  37. Urbanska, M., et al. A comparison of microfluidic methods for high-throughput cell deformability measurements. Nature Methods. 17, 587-593 (2020).
  38. Hill, R. T., Chilkoti, A. Surface Patterning. Biomaterials Science: An Introduction to Materials: Third Edition. , Elsevier Academic Press. NY. 276-301 (2013).
  39. Wang, Z., Volinsky, A. A., Gallant, N. D. Crosslinking effect on polydimethylsiloxane elastic modulus measured by custom-built compression instrument. Journal of Applied Polymer Science. 131 (22), 41050 (2014).
  40. Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  41. Stephens, A. D., Banigan, E. J., Adam, S. A., Goldman, R. D., Marko, J. F. Chromatin and lamin a determine two different mechanical response regimes of the cell nucleus. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1984-1996 (2017).
  42. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force microscopy of nonadherent cells: A comparison of leukemia cell deformability. Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
  43. Evers, T. M. J., Holt, L. J., Alberti, S., Mashaghi, A. Reciprocal regulation of cellular mechanics and metabolism. Nature Metabolism. 3 (4), 456-468 (2021).
  44. Balakrishnan, K. R., et al. Node-pore sensing enables label-free surface-marker profiling of single cells. Analytical Chemistry. 87 (5), 2988-2995 (2015).

Tags

Биоинженерия выпуск 190
Механо-узловое измерение пор: быстрая платформа без меток для многопараметрических одноэлементных вязкоупругих измерений
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lai, A., Rex, R., Cotner, K. L.,… More

Lai, A., Rex, R., Cotner, K. L., Dong, A., Lustig, M., Sohn, L. L. Mechano-Node-Pore Sensing: A Rapid, Label-Free Platform for Multi-Parameter Single-Cell Viscoelastic Measurements. J. Vis. Exp. (190), e64665, doi:10.3791/64665 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter