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Immunology and Infection

Nachweis polyfunktioneller T-Zellen bei Kindern, die mit Impfstoff gegen Japanische Enzephalitis geimpft wurden, mittels Durchflusszytometrie

Published: September 23, 2022 doi: 10.3791/64671
* These authors contributed equally

Summary

Das vorliegende Protokoll kombiniert Ex-vivo-Stimulation und Durchflusszytometrie, um polyfunktionelle T-Zell-Profile (T PF) in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) bei mit dem Japanischen Enzephalitis-Virus (JEV) geimpften Kindern zu analysieren. Die Detektionsmethode und das Farbschema der Durchflusszytometrie von JEV-spezifischen TPFs wurden getestet, um eine Referenz für ähnliche Studien zu liefern.

Abstract

Die T-Zell-vermittelte Immunität spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Flavivirus-Infektion, entweder nach der Impfung oder nach einer natürlichen Infektion. Die "Qualität" einer T-Zelle muss nach Funktion beurteilt werden, und eine höhere Funktion ist mit einem stärkeren Immunschutz verbunden. T-Zellen, die gleichzeitig zwei oder mehr Zytokine oder Chemokine auf Einzelzellebene produzieren können, werden als polyfunktionelle T-Zellen (TPFs) bezeichnet, die Immunantworten durch eine Vielzahl von molekularen Mechanismen vermitteln, um Degranulationsmarker (CD107a) zu exprimieren und Interferon (IFN)-γ, Tumornekrosefaktor (TNF)-α, Interleukin (IL)-2 oder Makrophagen-Entzündungsprotein (MIP)-1α zu sezernieren. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dassT-PFeng mit der Aufrechterhaltung des langfristigen Immungedächtnisses und -schutzes zusammenhängen und dass ihr erhöhter Anteil ein wichtiger Marker für schützende Immunität und wichtig für die wirksame Kontrolle von Virusinfektionen und Reaktivierungen ist. Diese Bewertung gilt nicht nur für spezifische Immunantworten, sondern auch für die Beurteilung von kreuzreaktiven Immunantworten. Hier wurden am Beispiel des Japanischen Enzephalitis-Virus (JEV) die Nachweismethode und das durchflusszytometrische Farbschema von JEV-spezifischenT-PFsgetestet, die von peripheren mononukleären Blutzellen von Kindern produziert werden, die gegen Japanische Enzephalitis geimpft wurden, um eine Referenz für ähnliche Studien zu liefern.

Introduction

Das Japanische Enzephalitis-Virus (JEV) ist ein wichtiges durch Mücken übertragenes Virus der Gattung Flavivirus innerhalb der Familie Flaviviridae1. Viele asiatisch-pazifische Länder stehen aufgrund der enormen Krankheitslast durch die Japanische Enzephalitis (JE) seit langem vor enormen Herausforderungen für die öffentliche Gesundheit, aber dies hat sich mit der zunehmenden Verfügbarkeit verschiedener Arten von Impfungen dramatisch verbessert2. Adaptive schützende Immunantworten, die durch natürliche Infektionen oder Impfungen hervorgerufen werden, tragen zur Prävention und antiviralen Regulation bei. Humorale Immunität und zellvermittelte Immunität werden als adaptive Immunität klassifiziert, und die Induktion der ersteren wurde immer als Schlüsselstrategie im Impfstoffdesign angesehen, wenn auch mit relativ begrenztem Verständnis in der Vergangenheit3. Die Rolle der T-Zell-vermittelten Immunität bei der Begrenzung der Flavivirusverbreitung und Virusclearance wurde jedoch zunehmend in den Fokus gerückt und umfassend untersucht4. Darüber hinaus ist die T-Zell-Immunität nicht nur für JEV-spezifische antivirale Reaktionen unverzichtbar, sondern spielt auch eine herausragende Rolle beim Kreuzschutz vor Sekundärinfektionen mit heterologen Flaviviren, was in früheren Studien gezeigt wurde5. Es wird spekuliert, dass dieser Effekt potenzielle Antikörper-vermittelte Verstärkungseffekte bei Infektion umgehen kann5. Bemerkenswert ist, dass eine solche kreuzreaktive T-Zell-Immunität wichtig ist, insbesondere in Abwesenheit von Impfstoffen und antiviralen Medikamenten gegen Flaviviren. Obwohl viele Studien durchgeführt wurden, um den Beitrag von T-Zellen bei der JEV-Infektion in Bezug auf CD4+ und CD8+ T-Zellen6,7 zu bestimmen, bleiben die jeweiligen Linien der Zytokine und ihre funktionelle Diversifizierung unbestimmt, was bedeutet, dass die Aufklärung der genauen Funktionen von Helfer- und Killer-T-Zellen behindert wird.

Das Ausmaß ihrer antiviralen Abwehrkräfte bestimmt die Qualität der T-Zell-Antworten. CD4+ oder CD8+ T-Zellen, die kompatibel zwei oder mehr Funktionen übertragen können, einschließlich Zytokinsekretion und Degranulation, werden bei spezifischer Stimulation auf Einzelzellebene als polyfunktionelle T-Zellen (TPFs) charakterisiert8. CD4+ T-Zellen, die einzelne oder mehrere Zytokine produzieren, können verschiedene Wirkungen und Immungedächtnisse haben. Zum Beispiel bilden IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-Zellen eher eine langfristig wirksame Schutzreaktion als IL-2+ CD4+ T-Zellen9, was als wichtiger Parameter zur Bewertung des Impfeffekts verwendet werden kann. Die Häufigkeit von IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-Zellen ist bei Patienten mit langfristiger Nicht-Progression des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) erhöht, während CD4+ T-Zellen bei Patienten mit AIDS-Progression aufgrund der fördernden Wirkung von IL-2 auf die T-Zellproliferationeher dazu neigen, IFN-γ allein zu produzieren. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass eine Untergruppe von IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ langfristig in vivo überlebt und die Tötungsfunktion synergistisch fördert11. Obwohl CD8+ T-Zellen eher zytotoxische Aktivität aufweisen, sind einige CD4+ T-Zellen auch mit zytotoxischer Aktivität als indirekt nachgewiesene Expression von Oberflächen-CD107a-Molekülenausgestattet 12. Darüber hinaus exprimieren bestimmte T-Zell-Untergruppen das Chemokin MIP-1α, das oft von Monozyten sezerniert wird, um an der T-Zell-vermittelten Neutrophilenrekrutierung teilzunehmen13. In ähnlicher Weise können CD8+ TPFs auch verwendet werden, um die Vielseitigkeit der oben genannten Marker zu charakterisieren. Studien haben gezeigt, dass die Prime-Boost-Strategie effektiv einen längeren Zeitraum von T-PF-Schutzwirkungen induzieren kann13, was den durch die Impfung hervorgerufenen Schutz verstärken kann. Ein zentrales Merkmal bei der Untersuchung des Immunsystems ist die Fähigkeit von Gedächtnis-T-Zellen, stärkere, schnellere und effektivere Reaktionen auf sekundäre virale Herausforderungen zu ermöglichen als naive T-Zellen. Effektorgedächtnis-T-Zellen (T EM) und zentrale Gedächtnis-T-Zellen (T CM) sind wichtige T-Zell-Untergruppen, die oft durch die zusammengesetzte Expression von CD27/CD45RO oder CCR7/CD45RA 14 unterschieden werden. TCM (CD27+ CD45RO+ oder CCR7+ CD45RA-) neigt dazu, sich in sekundären lymphatischen Geweben zu lokalisieren, während TEM (CD27- CD45RO+ oder CCR7- CD45RA-) in lymphatischen und peripheren Geweben lokalisiert15,16. TEM bietet eine sofortige, aber nicht anhaltende Abwehr, während TCM die Reaktion aufrechterhält, indem es sich in den sekundären lymphatischen Organen vermehrt und neue Effektoren erzeugt17. Da Gedächtniszellen spezifische und effiziente Erinnerungsreaktionen auf Viren vermitteln können, stellen sich Fragen nach dem Beitrag dieser Untergruppe von Polyfunktionen.

Mit der Entwicklung der Durchflusszytometrie-Technologie ist es üblich geworden, Marker von mehr als 10 Clustern, Phänotypen und Differenzierungsantigenen gleichzeitig zu erkennen, was vorteilhaft ist, um die funktionellen immunologischen Merkmale einzelner T-Zellen besser zu kommentieren, um Fehlinterpretationen und Schwierigkeiten beim Verständnis von T-Zell-Phänotypen zu reduzieren. Diese Studie verwendete Ex-vivo-Stimulation und Durchflusszytometrie, umT-PF-Profile in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) bei JEV-geimpften Kindern zu analysieren. Mit diesem Ansatz wird das Verständnis der kurz- und langfristigen JEV-spezifischen und sogar kreuzreaktiven T-Zell-Immunität, die durch Impfung induziert wird, erweitert.

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Protocol

Die ethische Genehmigung für die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission des Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, erhalten (Zulassungsnummer: 2020-k-85). Freiwillige wurden vom Beijing Children's Hospital der Capital Medical University rekrutiert. Periphere venöse Blutproben wurden von scheinbar gesunden Kindern (2 Jahre alt) entnommen, die zuvor weniger als ein halbes Jahr lang eine Prime- und Boost-Impfung mit lebend-attenuiertem JE SA14-14-2-Impfstoff erhalten hatten (JE-geimpfte Kinder, n = 5) und ungeimpfte Kinder (6 Monate alt, n = 5). Auf die Einwilligung des Menschen wurde verzichtet, da in dieser Studie nur die Restproben verwendet wurden, nachdem sie klinisch getestet wurden. Um die Privatsphäre der Freiwilligen zu schützen, wurden alle Daten vollständig anonymisiert und anonymisiert.

1. Isolierung von PBMCs aus peripherem venösem Blut

  1. Sammeln Sie periphere venöse Blutproben (2 ml) von JE-geimpften und ungeimpften Kindern in EDTA-K 2-antikoagulierten Röhrchen (siehe Materialtabelle) mit der Standard-Venenpunktionstechnik18.
  2. Fügen Sie 2 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x PBS) hinzu, um das periphere Blut zu verdünnen.
    HINWEIS: Der Prozess wird so schnell wie möglich durchgeführt, um die maximale Überlebensfähigkeit zu erhalten.
  3. 4 ml des Dichtegradientenmediums (siehe Materialtabelle) in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben und das verdünnte Blut langsam in die obere Schicht des Trennmediums überführen.
    HINWEIS: Mischen Sie das Blut nicht mit dem Trennmedium und zerstören Sie nicht die Kontaktfläche, die von den beiden Flüssigkeiten gebildet wird. Andernfalls wird der Trenneffekt nicht erreicht.
  4. Bei 800 × g 20 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Beobachten Sie die signifikanten Schichten nach dem Zentrifugieren.
  5. Die PBMCs (die mittlere Schicht) werden in ein weiteres 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und die PBMCs mit 10 ml RPMI-1640-Medium gewaschen, das 10% fötales Rinderserum enthält (FBS, siehe Materialtabelle).
  6. Bei 800 × g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette vorsichtig entsorgen.
  7. Resuspendieren Sie die PBMCs mit 1 ml RPMI-1640-Medium, das 10% FBS enthält, und zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Trypanblau-basierten Zähler (siehe Materialtabelle).

2. Stimulation von PBMCs durch inaktivierte JEV-Partikel zur Induktion der Zytokinexpression

  1. Legen Sie zwei Untergruppen der JEV-Stimulations- und Kontrollgruppen in den JE-geimpften bzw. ungeimpften Proben fest.
  2. Stellen Sie die Anzahl der PBMCs auf 2 × 10 6 Zellen/ml mit RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS ein und säen Sie die PBMCs in 24-Well-Platten (2 × 106 Zellen/1 ml Medium pro Well); Impfen Sie drei Brunnen für jede Gruppe.
  3. Stimulation der PBMCs der JEV-Stimulationsgruppe mit konzentrierten inaktivierten JEV-Partikeln 5 (2 × 105 PFU) für 16 h bei 37 °C in Gegenwart der monoklonalen Antikörper CD28 (1 μg/ml, 1:1.000) und CD49d (1 μg/ml), GolgiPlug (1 μg/ml, 1:1.000) und Monensin (1 μg/ml, 1:1.000). Verwenden Sie zur Oberflächenfärbung BV605-anti-CD107a (1 μg/ml, 1:1.000) (siehe Materialtabelle).
    ANMERKUNG: Der JEV wurde durch UV-Bestrahlung inaktiviert, wie zuvor beschrieben19.
  4. Stimulierung der PBMCs der Kontrollgruppe ohne konzentrierte Viruspartikel für 16 h bei 37 °C in Gegenwart der monoklonalen Antikörper CD28 (1 μg/ml, 1:1.000) und CD49d (1 μg/ml, 1:1.000), GolgiPlug (1 μg/ml, 1:1.000) und Monensin (1 μg/ml, 1:1.000). Färben Sie die Oberfläche mit BV605-anti-CD107a (1 μg/ml, 1:1.000).

3. Ex-vivo intrazelluläre Färbung

  1. Sammeln Sie die Zellsuspension von jeder Gruppe in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
  2. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 1x PBS, fügen Sie fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoff (1 μL / ml, 1:1.000, siehe Materialtabelle) zur Zellsuspension hinzu und inkubieren Sie für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Bei 500 × g (bei Raumtemperatur) 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
  3. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 1x PBS. Bei 500 × g (bei Raumtemperatur) 5 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig.
  4. Führen Sie eine Zelloberflächenmarkerfärbung durch.
    1. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL 1x PBS und fügen Sie der Zellsuspension in jedem Röhrchen 2 μL jedes Oberflächenmarker-Antikörpers (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 und BV480-anti-CD45RO, Verdünnungsfaktor: 1:50, siehe Materialtabelle) hinzu.
      HINWEIS: Das Farbfluoreszenz-Antikörper-Färbeprotokoll ist in Tabelle 1 dargestellt.
    2. Die Röhrchen (Schritt 3.4.1) 30 min bei Raumtemperatur inkubieren und vor Licht schützen. Bei 500 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
      HINWEIS: Der Antikörper von BUV737-anti-CD27 und BV480-anti-CD45RO kann durch BUV737-anti-CCR7 und BV480-anti-CD45RA als Annotation der Gedächtnis-T-Zellen ersetzt werden.
  5. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 1x PBS. Bei 500 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig.
  6. Führen Sie eine Fixierung und einen Membranbruch durch.
    1. Resuspendieren Sie die Zellen mit 500 μL membranbrechender Fixierlösung (siehe Materialtabelle) und fixieren Sie die Zellen für 20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Bei 500 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
  7. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 1x PBS. 5 min bei 500 × g bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen.
  8. Führen Sie eine intrazelluläre Zytokinfärbung durch.
    1. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL 1x PBS und geben Sie 2 μL jedes Zytokin-Antikörpers (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 und APC-anti-MIP-1α, Verdünnungsfaktor: 1:50, siehe Materialtabelle) zur Zellsuspension in jedem Röhrchen.
      HINWEIS: Die Volumina und Informationen zu fluorophorkonjugierten Antikörpern sind in Tabelle 1 aufgeführt.
    2. Die Röhrchen (Schritt 3.8.1) 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Bei 500 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
  9. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 1x PBS. Bei 500 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen. Fügen Sie 500 μL 1x PBS hinzu, um die Zellen zu resuspendieren.

4. Einrichtung der Durchflusszytometrie

  1. Isolieren Sie die PBMC-Probe allein, indem Sie die in Schritt 1 beschriebenen Verfahren als Kontrollstichprobe ausführen. Teilen Sie die Zellsuspension in 12 gleiche Teile in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (100 μL / Röhrchen), wie unten erwähnt.
    1. Stellen Sie ungefärbte, APC-Cy7-live/dead fixierbare gefärbte, BV650-anti-CD3 einfach gefärbte, BUV395-anti-CD4 einfach gefärbte, BV421-anti-CD8 einfach gefärbte, BUV737-anti-CD27 einfach gefärbte, BV480-anti-CD45RO gefärbt, BV605-anti-CD107a, FITC-anti-IFN-γ gefärbt, PE-anti-TNF-α einfach gefärbt, BV785-anti-IL-2 einfach gefärbt und APC-anti-MIP-1α einfach gefärbte Proben auf.
  2. Fügen Sie die Zelloberflächenmarker und die intrazelluläre Zytokinfärbung wie in Schritt 3 beschrieben hinzu. Fügen Sie für jede einzelne Färbeprobe nur einen der Fluorophore aus dem Färbeschritt hinzu. Fügen Sie 500 μL 1x PBS hinzu, um die Zellen und den Wirbel mit niedriger Geschwindigkeit zu resuspendieren.
  3. Passen Sie mit einer ungefärbten Probe die Vorwärtsstreuung (FSC), die Seitenstreuung (SSC) und die verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffspannungen an.
    HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden die folgenden Spannungen eingestellt. FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V und BV785: 725 V.
  4. Passen Sie die Durchflusszytometrie-Kompensation mithilfe der Einzelfärbungsproben an, um die Kontaminationssignale zwischen den verschiedenen Fluorophoren zu eliminieren.
    HINWEIS: Die Kompensationsparameter sind in Tabelle 2 aufgeführt.

5. Gating-Strategie und Datenanalyse

ANMERKUNG: In der vorliegenden Studie wurden für diese Analyse die zentralen Gedächtnis-T-Zellen (TCM von CD8+ oder CD4+ T-Zellen als CD27+ CD45RO+ oder CCR7+ CD45RA- und die Effektorgedächtnis-T-Zellen (TEM) von CD8+ oder CD4+ T-Zellen als CD27- CD45RO+ oder CCR7- CD45RA- definiert16.

  1. Zeichnen Sie ein Polygongatter durch das FSC-Area (FSC-A)/SSC-Area (SSC-A) Punktdiagramm, um die intakte Lymphozytenpopulation auszuwählen und dabei die Trümmer auszuschließen (Abbildung 1A).
  2. Zeichnen Sie ein rechteckiges Tor durch das FSC-A/FSC-width (FSC-W)-Punktdiagramm, um die einzelnen Zellen auszuwählen (Abbildung 1B).
  3. Zeichnen Sie ein rechteckiges Tor durch das Live/Dead/SSC-A-Punktdiagramm, um die lebenden Zellen auszuwählen (Abbildung 1C).
  4. Zeichnen Sie ein rechteckiges Tor durch das CD3/SSC-A-Punktdiagramm, um die CD3+ T-Zellen zu identifizieren (Abbildung 1D).
  5. Zeichnen Sie ein Quad-Gate durch das CD4/CD8-Punktdiagramm, um die CD4+- oder CD8+-T-Zellen zu identifizieren (Abbildung 1E).
  6. Zeichnen Sie ein Quad-Gate durch das CD45RO/CD27-Punktdiagramm, um die CD4+- oder CD8+-T-Zellen in TCM (CD27+ CD45RO+) und TEM (CD27- CD45RO+) zu unterteilen (Abbildung 1F-I).
  7. Zeichnen Sie die Gatter von CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 und MIP-1α aus dem TCM oder TEM der CD8+ oder CD4+ T-Zellen, um die Frequenz verschiedener Antwortmuster zu bestimmen.
  8. Laden Sie die Proben nacheinander auf die Zytometrie. Verwenden Sie ein Stopptor 20, um 1 ×10 6 Lymphozyten zu erfassen.
    HINWEIS: Der einzelne Benutzer kann mehr als 1 × 106 Zellen sammeln. Diese Zahl war ein Kompromiss zwischen der benötigten Zeit und der Sammlung von genügend Zellen, um aussagekräftige Ergebnisse zu liefern.

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt die Gating-Strategie, mit der dieT-CM- oderT-EM von CD8+- oder CD4+-T-Zellen aus einer repräsentativen JEV-Stimulationsgruppe von JE-geimpften Kindern geteilt wird. Das FSC-A/SSC-A-Punktdiagramm wird verwendet, um Lymphozyten zu identifizieren, und das FSC-A/FSC-W-Punktdiagramm wird verwendet, um einzelne Zellen zu identifizieren. Lebensfähige Zellen werden auf dem Lebend/Toten/SSC-A-Punktdiagramm ausgewählt. Das CD3/SSC-A-Punktdiagramm wird verwendet, um die CD3+ T-Zellen zu identifizieren. Das CD4/CD8-Punktdiagramm wird verwendet, um die CD3+ CD4+ bzw. CD3+ CD8+ T-Zellen zu identifizieren. DieT-CM (CD27+ CD45RO+) undT-EM (CD27- CD45RO+) der CD8+- oder CD4+-T-Zellen werden separat im CD45RO/CD27-Punktdiagramm ausgewählt. Zellen mit dem Phänotyp CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ und MIP-1α+ aus CD8+ T CM (Abbildung 1F), CD8+ TEM (Abbildung 1G), CD4+ TCM (Abbildung 1H) und CD4+ T EM (Abbildung 1I) werden separat ausgewählt, indem das entsprechende rechteckige Gate gezeichnet wird.

Die polyfunktionelle Charakterisierung der zentralen und Effektorgedächtnis-CD4+- und CD8+-T-Zell-Antworten (einschließlich Degranulation, Zytokine und Chemokine) auf JEV bei JE-geimpften und ungeimpften Kindern ist in Tabelle 3 dargestellt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass erhöhte Spiegel von CD107a, IFN-γ, TNF-α und IL-2 in den CD8+ TCM-Zellen der geimpften Kinder nach JEV-Stimulation im Vergleich zu denen bei ungeimpften Kindern nachgewiesen wurden. Das Niveau von MIP-1α unterschied sich nicht zwischen den beiden Gruppen. Es wird angenommen, dassT-EM-Zellen direkt bei Restimulation mit JEV antivirale Wirkungen ausüben. Höhere Konzentrationen von CD107a und IFN-γ wurden in den CD8+ T-EM-Zellen der geimpften Gruppe unter JEV-Stimulation im Vergleich zur ungeimpften Gruppe nachgewiesen. TNF-α, IL-2 und MIP-1α waren in diesen positiven Zellen jedoch nicht signifikant erhöht.

Das JEV-Antigen induzierte erfolgreich höhere Spiegel von CD107a, IFN-γ, TNF-α und MIP-1α in den CD4+ TCM-Zellen der geimpften Gruppe im Vergleich zur ungeimpften Gruppe. Der Anteil der IL-2+-Zellen unterschied sich jedoch nicht zwischen den beiden Gruppen unter JEV-Stimulation. Der Anteil der CD107a+-, IFN-γ+- und TNF-α+-Untergruppen von CD4+ T-EM-Zellen in der geimpften Gruppe war in Gegenwart von JEV höher als in der ungeimpften Gruppe.

Figure 1
Abbildung 1: Illustration der Gating-Strategie zur Identifizierung derT-CM- oderT-EM von CD8+ oder CD4+ T-Zellen und deren Untergruppen. (A) Lymphozyten wurden mit Hilfe des FSC-A/SSC-A-Punktdiagramms identifiziert. (B) Einzelne Zellen wurden mit Hilfe des FSC-A/FSC-W-Punktdiagramms identifiziert. (C) Lebende Zellen wurden anhand des Live/Dead/SSC-A-Punktdiagramms identifiziert. (D) CD3+ T-Zellen wurden mit dem CD3/SSC-A-Punktdiagramm identifiziert. (E) CD3+ CD4+ T- und CD3+ CD8+ T-Zellen wurden mit Hilfe des CD4/CD8-Punktdiagramms identifiziert. (F) CD8+ TCM mit dem Phänotyp CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ und MIP-1α+ wurden separat unterteilt. (G) CD8+ TEM mit den fünf Phänotypen wurden separat unterteilt. (H) CD4+ TCM mit den fünf Phänotypen wurden getrennt unterteilt. (I) CD4+ TEM mit den fünf Phänotypen wurden separat unterteilt. Die Zahlen auf jedem Feld stellen den Prozentsatz der Zellen in den Toren dar. Die Farbcodierung stellt die Häufigkeit des Auftretens der Zellen dar, wobei Rot die höchste Frequenz und Blau die niedrigste ist. Abkürzungen: SSC-A = Seitenstreufläche; FSC-A = Vorwärtsstreufläche; FSC-W = Vorwärtsstreubreite. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Antikörper-Target Konjugiertes Fluorophor Dosierung Klonen Isotyp Anregungslaserlinie Ex-Max (nm) Em-Max (nm)
CD3 BV650 2 μL SK7 Maus IgG1, κ Violett 407 650
CD4 BUV395 2 μL SK3 Maus IgG1, κ UV 348 39
CD8 BV421 2 μL SK1 Maus IgG1, κ Violett 407 421
CD27 BUV737 2 μL L128 Maus IgG1, κ UV 350 737
CD45RO BV480 2 μL UCHL1 Maus IgG2a, κ Violett 436 478
CCR7 BUV737 2 μL 3D12 Ratte IgG2a, κ UV 350 737
CD45RA BV480 2 μL HI100 Maus IgG2b, κ Violett 436 478
CD107a BV605 2 μL H4A3 Maus IgG1, κ Violett 407 602
IL-2 BV785 2 μL MQ1-17H12 Ratte IgG2a, κ Violett 407 786
IFN-γ FITC 2 μL 4S. B3 Maus IgG1, κ Blau 494 520
TNF-α PE 2 μL MAb11 Maus IgG1, κ Gelbgrün 496, 564 578
MIP-1α APC 2 μL 11A3 Maus IgG2a, κ Rot 650 660
Zombie NIR APC-Cy7 1 μL - - Rot 650 779

Tabelle 1: Das Farbfluoreszenz-Antikörper-Färbeprotokoll für durchflusszytometrische Analysen. Abkürzungen: BV = brillantes Violett; BUV = brillantes Ultraviolett; FITC = Fluoresceinisothiocyanat; PE = Phycoerythrin; APC = Allophycocyanin.

Kompensationsreferenz der Durchflusszytometrie (%)
FITC APC APC-Cy7 BV421 BV480 BV605 BV560 BV785 BUV395 BUV737 PE
FITC 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
APC 0 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0
APC-Cy7 0 0 100 0 0 0 0 65 0 44 0
BV421 0 0.6 0 100 10.5 3 15 3 0.4 0 0
BV480 3 0 0 46 100 19 0 6.1 0 0 0
BV605 0 0 0 3.6 0 100 94 10 0 9 14
BV560 0 5.5001 0 2 1 7.1 100 9 0 10 0
BV785 0 0 0 0 0 0 0 100 0 30 0
BUV395 0 0 0 1.7 0 0 0 0 100 0 0
BUV737 0 0 2 0 0 0 0 3.7001 3 100 0
PE 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100

Tabelle 2: Die Parameter der Kompensation für durchflusszytometrische Analysen. Abkürzungen: BV = brillantes Violett; BUV = brillantes Ultraviolett; FITC = Fluoresceinisothiocyanat; PE = Phycoerythrin; APC = Allophycocyanin.

Gruppe von TPF  Polyfunktionelle Charakterisierung (%)
Reiz CD107a IFN-γ TNF-α IL-2 MIP-1α
CD8+ T-Zellen TCM Geimpft JEV 1,50±0,48 1,60±0,69 0,66±0,32 0,54±0,27 0,16±0,11
Strg 0,51±0,38 0,31±0,13 0,28±0,13 0,37±0,20 0,02±0,05
Nicht geimpft JEV 0,38±0,19 0,20±0,03 0,19±0,09 0,16±0,04 0,19±0,09
Strg 0,50±0,28 0,27±0,09 0,19±0,05 0,23±0,14 0,08±0,11
P-Wert* - 0.00 0.00 0.02 0.01 0.70
TEM Geimpft JEV 1,47±0,58 1,21±0,22 0,49±0,36 0,33±0,31 0,24±0,17
Strg 0,82±0,48 0,39±0,15 0,16±0,18 0,23±0,256 0,09±0,21
Nicht geimpft JEV 0,41±0,25 0,14±0,09 0,15±0,11 0,20±0,07 0,15±0,13
Strg 0,34±0,13 0,21±0,15 0,17±0,10 0,19±0,19 0,01±0,02
P-Wert* - 0.01 0.00 0.08 0.13 0.36
CD4+ T-Zellen TCM Geimpft JEV 1,55±0,43 1,16±0,24 0,57±0,25 0,29±0,18 0,19±0,07
Strg 0,44±0,27 0,26±0,20 0,15±0,06 0,12±0,06 0,04±0,07
Nicht geimpft JEV 0,28±0,08 0,21±0,08 0,17±0,03 0,21±0,16 0,10±0,03
Strg 0,31±0,13 0,26±0,06 0,14±0,04 0,25±0,13 0,04±0,04
P-Wert* - 0.00 0.00 0.01 0.47 0.04
TEM Geimpft JEV 1,54±0,58 1,33±0,15 0,89±0,25 0,37±0,22 0,21±0,05
Strg 0,46±0,49 0,35±0,30 0,13±0,08 0,14±0,09 0,05±0,11
Nicht geimpft JEV 0,27±0,09 0,23±0,10 0,30±0,15 0,23±0,03 0,14±0,06
Strg 0,35±0,21 0,24±0,14 0,19±0,20 0,25±0,08 0,05±0,07
P-Wert* - 0.00 0.00 0.00 0.19 0.08
* Mann-Whitney U-Test, PBMCs von geimpften Individuen, stimuliert durch JEV vs. PBMCs von ungeimpften Personen, die durch JEV stimuliert wurden, wurden nur gezeigt.

Tabelle 3: Polyfunktionelle Charakterisierung der T-CM- und T-EM-Antworten von CD4+ oder CD8+ T-Zellantworten auf JEV. Geimpft, n = 5; ungeimpft, n = 5. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. P < 0,05 zeigte eine signifikante Differenz an. * PBMCs von geimpften Personen, die nur durch JEV stimuliert wurden, im Vergleich zu PBMCs von ungeimpften Personen, die nur durch JEV stimuliert wurden. Abkürzungen: TPFs = polyfunktionelle T-Zellen; IFN-γ = Interferon-γ; TNF-α = Tumornekrosefaktor-α; IL-2 = Interleukin-2; MIP-1α = Makrophagen-Entzündungsprotein-1α; TCM = zentrale Speicher-T-Zellen; TEM = Effektorgedächtnis-T-Zellen.

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Discussion

Dieses Protokoll stellt eine praktikable Durchflusszytometrie-basierte Nachweismethode fürT-PF-Profile in den PBMCs von Kindern dar, die mit dem JEV-Impfstoff SA14-14-2 geimpft wurden. Diese Studie verwendete die venösen Blut-PBMCs von geimpften und ungeimpften Kindern als Forschungsmaterialien. Mit der Stimulation von PBMCs mit dem JEV-Antigen können diese amplifizierten antigenspezifischenT-PFsdurch mehrfarbige Durchflusszytometrie-Antikörperfärbung charakterisiert werden. Im Vergleich zur herkömmlichen enzymgebundenen Immunospot-Assay-Methode besteht der herausragende Vorteil der Durchflusszytometrie darin, die funktionellen Merkmale von PBMCs auf Einzelzellebene so vielfältig wie möglich darzustellen und die Anzahl der PBMCs, die für den Nachweis benötigt werden, zu reduzieren, was besonders für Kinder geeignet ist.

Eine klare Impfgeschichte, die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit, die T-Zell-Immunogenität des Stimulators und kompatible Farbabstimmungsstrategien sind kritische Schritte in diesem Protokoll. China hat die Impfung von JEV SA14-14-2 seit 2008 in das nationale erweiterte Impfprogramm aufgenommen und die Impfhistorie in ein einheitliches Management aufgenommen, das für die Zugänglichkeit der Impfstoffgeschichte verfügbar geworden ist3. Die in diesem Protokoll untersuchten PBMCs wurden experimentell auf Eis gehalten, um die maximale Zelllebensfähigkeit zu erhalten. Die Verwendung spezifischer Reize hat sich zuvor als wirksam erwiesen 4,5,21,22. Die Farbanpassungsstrategie ist die Haupteinschränkung bei dieser Methode, und die Verwendbarkeit dieser Strategie wurde in der kontinuierlichen Vortestverfeinerung und dem Abgleich der Instrumentenparameter dargestellt. Darüber hinaus bot dieses Protokoll zwei Optionen zur Annotation der Gedächtnis-T-Zellen. Durch die obige Konfiguration und Optimierung der experimentellen Parameter könnte es möglich sein, die spezifische und sogar kreuzreaktive Immunität zu messen, indem das Ausmaß und die Häufigkeit derT-PF-Reaktionen auf die Impfung durch Durchflusszytometrie bewertet werden. Die fünf repräsentativen Indikatoren zur Charakterisierung vonT-PFsind jedoch eine Einschränkung dieser Studie; Die derzeit üblichen funktionellen Moleküle (CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 und MIP-1α) können erweitert werden, um das Spektrum zu detektieren, um die Vielseitigkeit vonT-PFsbasierend auf dem vorgestellten Protokoll besser zu charakterisieren.

Die JEV-Infektion gilt als eine durch Impfung vermeidbare Krankheit, bei der impfbedingte Gedächtnis-T-Zell-Reaktionen für die Aufrechterhaltung eines lang anhaltenden Immunschutzes entscheidend sein können, insbesondere wenn die Antikörperreaktionen im Laufe der Zeit nachlassen4. Als wichtigste totipotente Schutzkomponente in Gedächtnis-T-Zellen sollten TPFs als routinemäßiges Testobjekt für die Bewertung der Wirksamkeit von Impfstoffen vorgeschlagen werden und umgekehrt das Design und die Entwicklung gezielter T-Zell-Impfstoffe leiten. Tatsächlich wird die Rolle der T-Zell-Immunität bei der Kontrolle von Flavivirus-Infektionen zunehmend geschätzt, und sie kann sogar die Rolle von Antikörpern im Guten wie im Schlechten umgehen5. Die Klärung desT-PF-Profils wird zweifellos das Repertoire an antigenen Epitopen weiter einschränken, was die Kosten für Impfstoffe durch eine verbesserte Ausrichtung senken wird. Die synergistischen Effekte von CD4+ und CD8+ T-Zellen ergänzen sich gegenseitig und sind zweifellos stärker ausgeprägt auf TPFs. Daher wird vorgeschlagen, dass sich Studien zuT-PFsauf (1) Profilunterschiede zwischen lang- und kurzfristigenT-PFkonzentrieren; (2) die Identifizierung von HLA-beschränkten T-PF-Epitopen; und (3) die Erforschung und Erforschung polyfunktionaler Subpopulationen.

Die Identifizierung vonT-PF-Zellen in der Immunkontrolle von Virusinfektionen wurdeberichtet 23,24,25. Die Beschreibung der vollständigen Detektionsstrategie und des Prozesses von TPFs ist jedoch nicht gut organisiert. Darüber hinaus gilt das Farbschema dieser Methode für mehrere Durchflusszytometermodelle. Die Marker können auch angepasst werden, um andere funktionelle Untergruppen basierend auf dieser Farbübereinstimmung zu erkennen.

Diese Studie lieferte eine T-PF-Nachweisstrategie durch Kombination von Ex-vivo-spezifischer Stimulation und Durchflusszytometrie zur Analyse von T-PF-Untergruppenprofilen in den PBMCs vonJEV-Impfstoffempfängern. Die isolierten PBMCs wurden zuerst mit dem JEV-Antigen stimuliert und dann mit den entsprechenden fluoreszenzmarkierten Antikörpern angefärbt, und JEV-spezifische CD4+ und CD8+ Speicher-TPFswurden durch Durchflusszytometrie charakterisiert. Basierend auf diesem Ergebnis können die T-PF-Frequenzen von Doppel-, Dreifach-, Vierfach- und Fünffachfunktionen weiter berechnet werden, um TPFs detaillierter und umfassender zu beschreiben. Routinemäßige venöse Blutvolumina (2 ml) bei Kindern haben sich fürT-PF-Studien als ausreichend erwiesen. Daher wird erwartet, dass die Nachweismethoden für virusspezifischeT-PFs verwendet werden, um Messungen der T-Zell-vermittelten adaptiven Immunität im Zusammenhang mit Impfung oder Infektion zu untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

R.W. wurde von der National Natural Science Foundation of China (82002130) und der Beijing Natural Science Foundation of China (7222059) unterstützt. ZD.X. wurde vom CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-human CD28 Biolegend 302934 Antibody
anti-human CD49d Biolegend 304339 Antibody
APC anti-human MIP-1α BD 551533 Fluorescent antibody 
Automated cell counter BIO RAD TC20 Cell count
BD FACSymphony A5 BD A5 flow Cytometry
BUV395 anti-human CD4 BD 563550 Fluorescent antibody 
BUV737 anti-human CCR7 BD 741786 Fluorescent antibody 
BUV737 anti-human CD27 BD 612829 Fluorescent antibody 
BV421 anti-human CD8 Biolegend 344748 Fluorescent antibody 
BV480 anti-human CD45RA BD 566114 Fluorescent antibody 
BV480 anti-human CD45RO BD 566143 Fluorescent antibody 
BV605 anti-human CD107a Biolegend 328634 Fluorescent antibody 
BV650 anti-human CD3 BD 563999 Fluorescent antibody 
BV785 anti-human IL-2 Biolegend 500348 Fluorescent antibody 
Centrifuge Tube BD Falcon BD-35209715 15 mL centrifuge tube
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714 Cell fixation and permeabilization
Density gradient medium Dakewe DKW-KLSH-0100 Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium
FITC anti-human IFN-γ Biolegend 502506 Fluorescent antibody 
Gibco Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16000-044 Fetal Bovine Serum
Gibco RPMI-1640 medium Thermo Fisher Scientific 22400089 cell culture medium
High-speed centrifuge Sigma  3K15 Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
High-speed centrifuge Eppendorf 5424R Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C 1.5 mL microcentrifuge tube
PE anti-human TNF-α Biolegend 502909 Fluorescent antibody 
Phosphate Buffered Saline (PBS) BI 02-024-1ACS PBS
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) BD 555029 blocks intracellular protein transport processes
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) BD 554724 blocks intracellular protein transport processes
Round-bottom test tube BD Falcon 352235 5 mL test tube
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit Beyotime C0011 Trypan Blue Staining
Zombie NIR Fixable Viability Dye Biolegend 423106 Dead cell stain

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 187 Polyfunktionelle T-Zellen Japanische Enzephalitis Impfung Durchflusszytometrie
Nachweis polyfunktioneller T-Zellen bei Kindern, die mit Impfstoff gegen Japanische Enzephalitis geimpft wurden, <em>mittels</em> Durchflusszytometrie
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Zhang, L., Zhang, M., Liu, M., Ai,More

Zhang, L., Zhang, M., Liu, M., Ai, J., Tian, J., Ge, H., Wang, R., Xie, Z. Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique. J. Vis. Exp. (187), e64671, doi:10.3791/64671 (2022).

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