Summary
Denne protokollen kombinerer ex vivo stimulering og flowcytometri for å analysere polyfunksjonelle T-celle (T PF) profiler i perifere mononukleære celler i blodet (PBMCs) innen japanske encefalittvirus (JEV)-vaksinerte barn. Deteksjonsmetoden og flowcytometrifargeskjemaet til JEV-spesifikke TPFer ble testet for å gi en referanse for lignende studier.
Abstract
T-cellemediert immunitet spiller en viktig rolle i å kontrollere flavivirusinfeksjon, enten etter vaksinasjon eller etter naturlig infeksjon. "Kvaliteten" til en T-celle må vurderes etter funksjon, og høyere funksjon er forbundet med kraftigere immunforsvar. T-celler som samtidig kan produsere to eller flere cytokiner eller kjemokiner på enkeltcellenivå kalles polyfunksjonelle T-celler (TPFs), som formidler immunresponser gjennom en rekke molekylære mekanismer for å uttrykke degranulasjonsmarkører (CD107a) og utskille interferon (IFN)-γ, tumornekrosefaktor (TNF)-α, interleukin (IL)-2, eller makrofag inflammatorisk protein (MIP)-1α. Det er økende bevis på at TPFs er nært knyttet til vedlikehold av langsiktig immunminne og beskyttelse, og at deres økte andel er en viktig markør for beskyttende immunitet og er viktig i effektiv kontroll av virusinfeksjon og reaktivering. Denne evalueringen gjelder ikke bare for spesifikke immunresponser, men også for vurdering av kryssreaktive immunresponser. Her, med det japanske encefalittviruset (JEV) som et eksempel, ble deteksjonsmetoden og flowcytometrifargeskjemaet til JEV-spesifikke TPF-erprodusert av perifere mononukleære celler av barn vaksinert mot japansk encefalitt testet for å gi en referanse for lignende studier.
Introduction
Japansk encefalittvirus (JEV) er et viktig myggbårent virus som tilhører slekten Flavivirus i Flaviviridae-familien 1. Mange land i Asia og Stillehavsområdet har lenge stått overfor enorme folkehelseutfordringer på grunn av den enorme sykdomsbyrden forårsaket av japansk encefalitt (JE), men dette har forbedret seg dramatisk med den økende tilgjengeligheten av ulike typer vaksinasjoner2. Adaptive beskyttende immunresponser fremkalt av naturlig infeksjon eller vaksinasjon bidrar til forebygging og antiviral regulering. Humoral immunitet og cellemediert immunitet klassifiseres som adaptiv immunitet, og induksjon av førstnevnte har alltid vært ansett som en sentral strategi i vaksinedesign, om enn med relativt begrenset forståelse i de siste3. Imidlertid har rollen som T-cellemediert immunitet for å begrense flavivirusspredning og virusklarering blitt stadig mer fokusert på og grundig studert4. Videre er T-celleimmunitet ikke bare uunnværlig i JEV-spesifikke antivirale responser, men spiller også en fremtredende rolle i kryssbeskyttelse mot sekundær infeksjon med heterologe flavivirus, noe som er vist i tidligere studier5. Det spekuleres i at denne effekten kan omgå potensielle antistoffmedierte forbedringseffekter ved infeksjon5. Merk at slik kryssreaktiv T-celleimmunitet er viktig, spesielt i fravær av vaksiner og antivirale legemidler mot flavivirus. Selv om mange studier har blitt utført for å bestemme bidraget fra T-celler i JEV-infeksjon med hensyn til CD4 + og CD8 + T-celler6,7, forblir de respektive linjene som utskiller cytokiner og deres funksjonelle diversifisering ubestemt, noe som betyr at belysningen av de nøyaktige funksjonene til hjelper- og morder-T-celler hindres.
Omfanget av deres antivirale forsvar bestemmer kvaliteten på T-celleresponser. CD4+ eller CD8+ T-celler som kan gi to eller flere funksjoner, inkludert cytokinsekresjon og degranulering, karakteriseres som polyfunksjonelle T-celler (TPFs) ved spesifikk stimulering på enkeltcellenivå8. CD4+ T-celler som produserer enkle eller multiple cytokiner kan ha ulike effekter og immunminner. For eksempel er IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-celler mer sannsynlig å danne en langsiktig effektiv beskyttelsesrespons enn IL-2+ CD4+ T-celler9, som kan brukes som en viktig parameter for å evaluere vaksinasjonseffekten. Frekvensen av IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-celler er økt hos pasienter med langvarig ikke-progresjon av ervervet immunsviktsyndrom (AIDS), mens CD4+ T-celler hos pasienter med AIDS-progresjon er mer tilbøyelige til å produsere IFN-γ alene på grunn av den fremmende effekten av IL-2 på T-celleproliferasjon10. Videre ble en undergruppe av IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ vist å overleve langsiktig in vivo og synergistisk fremme drapsfunksjonen11. Selv om CD8+ T-celler er mer sannsynlig å utvise cytotoksisk aktivitet, er noen CD4+ T-celler også utstyrt med cytotoksisk aktivitet som et indirekte påvist uttrykk for overflate CD107a-molekyler12. I tillegg uttrykker visse T-celleundergrupper kjemokinen MIP-1α, som ofte utskilles av monocytter for å delta i T-cellemediert nøytrofilrekruttering13. På samme måte kan CD8+ TPF-erogså brukes til å karakterisere allsidigheten til markørene ovenfor. Studier har vist at prime-boost-strategien effektivt kan indusere en lengre periode med TPF-beskyttende effekter13, noe som kan forbedre beskyttelsen fremkalt av vaksinasjon. Et sentralt trekk ved undersøkelse av immunsystemet er hukommelses-T-cellers evne til å legge til rette for sterkere, raskere og mer effektive responser på sekundære virale utfordringer enn naive T-celler. Effektorminne T-celler (TEM) og sentrale minne T-celler (TCM) er viktige T-celleundergrupper som ofte differensieres av det sammensatte uttrykket av CD27 / CD45RO eller CCR7 / CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ eller CCR7+ CD45RA-) har en tendens til å lokalisere seg i sekundært lymfoid vev, mens TEM (CD27- CD45RO+ eller CCR7- CD45RA-) lokaliserer i lymfoid og perifert vev15,16. TEM gir umiddelbart, men ikke vedvarende forsvar, mens TCM opprettholder responsen ved å spre seg i sekundære lymfoide organer og generere nye effektorer17. Således, gitt at minneceller kan formidle spesifikke og effektive tilbakekallingsresponser på virus, oppstår det spørsmål om bidraget fra denne delmengden av polyfunksjoner.
Med utviklingen av flowcytometriteknologi har det blitt vanlig å samtidig oppdage markører på mer enn 10 klynger, fenotyper og differensieringsantigener, noe som er gunstig for mer rikelig å kommentere de funksjonelle immunologiske egenskapene på individuelle T-celler for å redusere feiltolkning og vanskeligheter med å forstå T-cellefenotyper. Denne studien brukte ex vivo-stimulering og flowcytometri for å analysere TPF-profiler i mononukleære celler i perifert blod (PBMCs) hos JEV-vaksinerte barn. Ved å bruke denne tilnærmingen vil forståelsen av kort- og langsiktig JEV-spesifikk og til og med kryssreaktiv T-celleimmunitet indusert av vaksinasjon bli utvidet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etisk godkjenning for denne studien ble innhentet av etikkutvalget for Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (Godkjenningsnummer: 2020-k-85). Frivillige ble rekruttert fra Beijing Children's Hospital, Capital Medical University. Perifere venøse blodprøver ble tatt fra tilsynelatende friske barn (2 år) som tidligere hadde fått primtall og økt vaksinasjon med levende-svekket JE SA14-14-2-vaksine i mindre enn et halvt år (JE-vaksinerte barn, n = 5) og uvaksinerte barn (6 måneder, n = 5). Informert samtykke fra forsøkspersoner ble frafalt da bare restprøvene, etter å ha blitt klinisk testet, ble brukt i denne studien. For å beskytte personvernet til de frivillige, ble alle data fullstendig anonymisert og avidentifisert.
1. Isolering av PBMC fra perifert venøst blod
- Samle perifere venøse blodprøver (2 ml) fra JE-vaksinerte og uvaksinerte barn i EDTA-K 2-antikoagulerte rør (se materialtabell) ved standard venepunksjonsteknikk18.
- Tilsett 2 ml fosfatbufret saltvann (1x PBS) for å fortynne perifert blod.
MERK: Prosessen håndteres så snart som mulig for å opprettholde maksimal overlevelsesevne. - Tilsett 4 ml av tetthetsgradientmediet (se materialtabell) til et 15 ml sentrifugerør, og overfør sakte det fortynnede blodet til det øvre laget av separasjonsmediet.
NOTAT: Ikke bland blodet med separasjonsmediet eller ødelegg kontaktflaten dannet av de to væskene; Ellers vil separasjonseffekten ikke oppnås. - Sentrifuge ved 800 × g i 20 minutter ved romtemperatur. Vær oppmerksom på de betydelige lagene etter sentrifugering.
- Overfør PBMC-ene (mellomlaget) til et annet 15 ml sentrifugerør, og vask PBMC-ene med 10 ml RPMI-1640-medium som inneholder 10% føtalt bovint serum (FBS, se materialtabell).
- Sentrifuge ved 800 × g i 10 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten forsiktig med en pipette.
- Resuspend PBMCs med 1 ml RPMI-1640 medium som inneholder 10% FBS og telle cellene med en trypan blå-basert automatisert teller (se tabell over materialer).
2. Stimulering av PBMC ved inaktiverte JEV-partikler for å indusere cytokinuttrykk
- Sett to undergrupper av JEV-stimulerings- og kontrollgruppene i henholdsvis JE-vaksinerte og uvaksinerte prøver.
- Juster antall PBMC-er til 2 × 106 celler/ml med RPMI-1640-medium som inneholder 10 % FBS, og frø PBMC-ene i 24-brønnsplater (2 × 106 celler/1 ml medium per brønn); inokulere tre brønner for hver gruppe.
- Stimulere PBMC-ene i JEV-stimuleringsgruppen med konsentrerte inaktiverte JEV-partikler 5 (2 × 105 PFU) i 16 timer ved 37 °C i nærvær av monoklonale antistoffer CD28 (1 μg/ml, 1:1,000) og CD49d (1 μg/ml), GolgiPlug (1 μg/ml, 1:1,000) og monensin (1 μg/ml, 1:1,000). For overflatefarging, bruk BV605-anti-CD107a (1 μg/ml, 1:1,000) (se materialtabell).
MERK: JEV ble inaktivert av UV-bestråling som beskrevet tidligere19. - Stimulere PBMC-ene i kontrollgruppen uten konsentrerte viruspartikler i 16 timer ved 37 °C i nærvær av monoklonale antistoffer CD28 (1 μg/ml, 1:1000) og CD49d (1 μg/ml, 1:1,000), GolgiPlug (1 μg/ml, 1:1,000) og monensin (1 μg/ml, 1:1,000). Flekk overflaten med BV605-anti-CD107a (1 μg/ml, 1:1,000).
3. Ex vivo intracellulær farging
- Samle cellesuspensjonen fra hver gruppe i et 1,5 ml mikrosentrifugerør, sentrifuge ved 500 × g i 5 minutter ved romtemperatur, og fjern supernatanten med en pipette.
- Resuspend cellene i 1 ml 1x PBS, legg til fikserbart levedyktighetsfargestoff (1 μL / ml, 1: 1000, se materialtabell) til cellesuspensjonen, og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur i mørket. Sentrifuge ved 500 × g (ved romtemperatur) i 5 minutter og fjern supernatanten.
- Resuspend cellene i 1 ml 1x PBS. Sentrifuge ved 500 × g (ved romtemperatur) i 5 minutter. Kast supernatanten forsiktig.
- Utfør farging av celleoverflatemarkører.
- Resuspend cellene i 100 μL av 1x PBS, og legg til 2 μL av hvert overflatemarkør antistoff (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 og BV480-anti-CD45RO, fortynningsfaktor: 1:50, se materialtabell) til cellesuspensjonen i hvert rør.
MERK: Fargefluorescerende antistofffargingsprotokollen er vist i tabell 1. - Inkuber rørene (trinn 3.4.1) i 30 minutter ved romtemperatur, og beskytt dem mot lys. Sentrifuge ved 500 × g i 5 minutter og fjern supernatanten.
MERK: Antistoffet til BUV737-anti-CD27 og BV480-anti-CD45RO kan erstattes med BUV737-anti-CCR7 og BV480-anti-CD45RA som merknad av minnet T-celler.
- Resuspend cellene i 100 μL av 1x PBS, og legg til 2 μL av hvert overflatemarkør antistoff (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 og BV480-anti-CD45RO, fortynningsfaktor: 1:50, se materialtabell) til cellesuspensjonen i hvert rør.
- Resuspend cellene i 1 ml 1x PBS. Sentrifuge ved 500 × g i 5 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten forsiktig.
- Utfør fiksering og membranbrudd.
- Resuspend cellene med 500 μL membranbrytende fikseringsløsning (se materialtabell) og fest cellene i 20 minutter i mørket ved romtemperatur. Sentrifuge ved 500 × g i 5 minutter og fjern supernatanten.
- Resuspend cellene i 1 ml 1x PBS. Sentrifuge i 5 minutter ved 500 × g ved romtemperatur og fjern supernatanten forsiktig.
- Utfør intracellulær cytokinfarging.
- Resuspend cellene i 100 μL av 1x PBS, og tilsett 2 μL av hvert cytokinantistoff (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 og APC-anti-MIP-1α, fortynningsfaktor: 1:50, se Materialtabell) til cellesuspensjonen i hvert rør.
MERK: Volumene og informasjonen om fluoroforkonjugerte antistoffer er vist i tabell 1. - Inkuber rørene (trinn 3.8.1) i 30 minutter ved romtemperatur i mørket. Sentrifuge ved 500 × g i 5 minutter og fjern supernatanten.
- Resuspend cellene i 100 μL av 1x PBS, og tilsett 2 μL av hvert cytokinantistoff (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 og APC-anti-MIP-1α, fortynningsfaktor: 1:50, se Materialtabell) til cellesuspensjonen i hvert rør.
- Resuspend cellene i 1 ml 1x PBS. Sentrifuge ved 500 × g i 5 minutter ved romtemperatur, og fjern supernatanten forsiktig. Tilsett 500 μL 1x PBS for å resuspendere cellene.
4. Oppsett av flowcytometri
- Isoler PBMC-prøven alene ved å følge prosedyrene beskrevet i trinn 1 som kontrollprøven. Del cellesuspensjonen i 12 like deler i 1,5 ml mikrosentrifugerør (100 μL / rør) som nevnt nedenfor.
- Sett opp unstained, APC-Cy7-live/dead fixable stained, BV650-anti-CD3 single-stained, BUV395-anti-CD4 single-stained, BV421-anti-CD8 single-stained, BUV737-anti-CD27 single-stained, BV480-anti-CD45RO stained, BV605-anti-CD107a, FITC-anti-IFN-γ stained, PE-anti-TNF-α single-stained, BV785-anti-IL-2 single-stained og APC-anti-MIP-1α single-stained samples.
- Legg til celleoverflatemarkørene og intracellulær cytokinfarging som beskrevet i trinn 3. For hver enkeltfargeprøve tilsettes bare en av fluoroforene fra fargetrinnet. Tilsett 500 μL 1x PBS for å resuspendere cellene og virvelen med lav hastighet.
- Bruk en ufarget prøve, juster fremoverspredningen (FSC), sidespredningen (SSC) og forskjellige fluorescerende fargespenninger.
MERK: For denne studien ble følgende spenninger satt. FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V, og BV785: 725 V. - Bruk enkeltfargeprøvene til å justere flowcytometrikompensasjonen for å eliminere forurensningssignalene mellom de forskjellige fluoroforene.
MERK: Kompensasjonsparametrene er vist i tabell 2.
5. Gatestrategi og dataanalyse
MERK: I denne studien, for denne analysen, ble de sentrale minne T-cellene (TCM av CD8 + eller CD4 + T-celler som CD27 + CD45RO + eller CCR7 + CD45RA- og effektorminnet T-celler (TEM) av CD8 + eller CD4 + T-celler som CD27- CD45RO + eller CCR7- CD45RA- definert henholdsvis16.
- Tegn en polygonport gjennom FSC-området (FSC-A)/SSC-området (SSC-A) punktplott for å velge intakt lymfocyttpopulasjon mens du ekskluderer rusk (figur 1A).
- Tegn en rektangulær port gjennom punktdiagrammet FSC-A/FSC-width (FSC-W) for å merke enkeltcellene (figur 1B).
- Tegn en rektangulær port gjennom plottet levende/død/SSC-A-punkt for å velge de levende cellene (figur 1C).
- Tegn en rektangulær port gjennom CD3/SSC-A-punktplottet for å identifisere CD3+ T-cellene (figur 1D).
- Tegn en quad-port gjennom CD4/CD8-punktplottet for å identifisere CD4+- eller CD8+ T-cellene (figur 1E).
- Tegn en quad-port gjennom CD45RO/CD27-punktplottet for å dele CD4+- eller CD8+ T-cellene inn i TCM (CD27+ CD45RO+) og TEM (CD27- CD45RO+) (figur 1F-I).
- Tegn portene til CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 og MIP-1α fra henholdsvis TCM eller TEM på CD8+ eller CD4+ T-cellene for å bestemme frekvensen av forskjellige responsmønstre.
- Legg prøvene på cytometrien sekvensielt. Bruk en stoppeport20 for å skaffe 1 × 106 lymfocytter.
MERK: Den enkelte bruker kan samle mer enn 1 × 106 celler. Dette tallet var et kompromiss mellom tiden det tok og samlingen av nok celler til å gi meningsfulle resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser gating-strategien som brukes til å dele TCM eller TEM av CD8 + eller CD4 + T-celler fra en representativ JEV-stimuleringsgruppe av JE-vaksinerte barn. FSC-A / SSC-A dotplottet brukes til å identifisere lymfocytter, og FSC-A / FSC-W dotplottet brukes til å identifisere enkeltceller. Levedyktige celler velges på live / dead / SSC-A dot plot. CD3/SSC-A-punktplottet brukes til å identifisere CD3+ T-cellene. CD4/CD8-punktdiagrammet brukes til å identifisere henholdsvis CD3+ CD4+ og CD3+ CD8+ T-cellene. TCM (CD27+ CD45RO+) og TEM (CD27- CD45RO+) for CD8+- eller CD4+ T-celler velges separat på CD45RO/CD27-punktplottet. Celler med fenotypen CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ og MIP-1α+ fra CD8+ T CM (figur 1F), CD8+ T EM (figur 1G), CD4+ TCM (figur 1H) og CD4+ T EM (figur 1I) velges separat ved å tegne den tilsvarende rektangulære porten.
Den polyfunksjonelle karakteriseringen av sentrale og effektorminne CD4+ og CD8+ T-celleresponser (inkludert degranulering, cytokiner og kjemokiner) til JEV hos JE-vaksinerte og uvaksinerte barn er vist i tabell 3. Disse resultatene indikerer at økte nivåer av CD107a, IFN-γ, TNF-α og IL-2 ble påvist i CD8+ TCM-cellene til de vaksinerte barna etter JEV-stimulering sammenlignet med de hos uvaksinerte barn. Nivået av MIP-1α var ikke forskjellig mellom de to gruppene. TEM-celler antas å utøve antivirale effekter direkte ved restimulering med JEV. Høyere nivåer av CD107a og IFN-γ ble påvist i CD8+ TEM-cellene i den vaksinerte gruppen under JEV-stimulering sammenlignet med den uvaksinerte gruppen. TNF-α, IL-2 og MIP-1α var imidlertid ikke signifikant forhøyet i de positive cellene.
JEV-antigenet induserte vellykket høyere nivåer av CD107a, IFN-γ, TNF-α og MIP-1α i CD4 + TCM-cellene i den vaksinerte gruppen sammenlignet med den uvaksinerte gruppen. Andelen IL-2+-celler var imidlertid ikke forskjellig mellom de to gruppene under JEV-stimulering. Andelen CD107a+, IFN-γ+ og TNF-α+ undergrupper av CD4+ TEM-celler i den vaksinerte gruppen var høyere i nærvær av JEV enn i den uvaksinerte gruppen.
Figur 1: Illustrasjon av gating-strategien for å identifisere TCM eller TEM for CD8+ eller CD4+ T-celler og deres undergrupper. (A) Lymfocytter ble identifisert ved hjelp av FSC-A/SSC-A dot plot. (B) Enkeltceller ble identifisert ved hjelp av FSC-A / FSC-W dot plot. (C) Levende celler ble identifisert ved hjelp av levende / døde / SSC-A prikkplott. (D) CD3+ T-celler ble identifisert ved hjelp av CD3/SSC-A-punktplottet. (E) CD3+ CD4+ T- og CD3+ CD8+ T-celler ble identifisert ved hjelp av CD4/CD8-punktplottet. (F) CD8+ TCM med fenotypen CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ og MIP-1α+ ble delt inn separat. (G) CD8+ TEM med de fem fenotypene ble delt inn separat. (H) CD4+ TCM med de fem fenotypene ble delt inn separat. (I) CD4+ TEM med de fem fenotypene ble delt inn separat. Tallene på hvert panel representerer prosentandelen av celler i portene. Fargekodingen representerer frekvensen av forekomst av cellene, hvor rødt er den høyeste frekvensen og blå er den laveste. Forkortelser: SSC-A = side scatter-area; FSC-A = fremskutt spredningsområde; FSC-W = fremover scatter-bredde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Antistoff mål | Konjugert fluorophore | Dosering | Klon | Isotype | Eksitasjonslaserlinje | Tidligere maks (nm) | Em-Max (nm) |
| CD3 | BV650 | 2 mikroliter | SK7 | Mus IgG1, κ | Fiolett | 407 | 650 |
| CD4 | BUV395 | 2 mikroliter | SK3 | Mus IgG1, κ | UV | 348 | 39 |
| CD8 | BV421 | 2 mikroliter | SK1 | Mus IgG1, κ | Fiolett | 407 | 421 |
| CD27 | BUV737 | 2 mikroliter | L128 | Mus IgG1, κ | UV | 350 | 737 |
| CD45RO | BV480 | 2 mikroliter | UCHL1 | Mus IgG2a, κ | Fiolett | 436 | 478 |
| CCR7 | BUV737 | 2 mikroliter | 3D12 | Rotte IgG2a, κ | UV | 350 | 737 |
| CD45RA | BV480 | 2 mikroliter | HI100 | Mus IgG2b, κ | Fiolett | 436 | 478 |
| CD107a | BV605 | 2 mikroliter | H4A3 | Mus IgG1, κ | Fiolett | 407 | 602 |
| IL-2 | BV785 | 2 mikroliter | MQ1-17H12 | Rotte IgG2a, κ | Fiolett | 407 | 786 |
| IFN-γ | FITC | 2 mikroliter | 4S. B3 | Mus IgG1, κ | Blå | 494 | 520 |
| TNF-α | PE | 2 mikroliter | MAb11 | Mus IgG1, κ | Gulgrønn | 496, 564 | 578 |
| MIP-1α | APC | 2 mikroliter | 11A3 | Mus IgG2a, κ | Rød | 650 | 660 |
| Zombie NIR | APC-Cy7 | 1 mikroliter | - | - | Rød | 650 | 779 |
Tabell 1: Fargefluorescerende antistofffargingsprotokoll for flowcytometriske analyser. Forkortelser: BV = strålende fiolett; BUV = strålende ultrafiolett; FITC = fluoresceinisotiocyanat; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin.
| Kompensasjonsreferanse for flowcytometri (%) | ||||||||||||
| FITC | APC | APC-Cy7 | BV421 | BV480 | BV605 | BV560 | BV785 | BUV395 | BUV737 | PE | ||
| FITC | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| APC | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| APC-Cy7 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 65 | 0 | 44 | 0 | |
| BV421 | 0 | 0.6 | 0 | 100 | 10.5 | 3 | 15 | 3 | 0.4 | 0 | 0 | |
| BV480 | 3 | 0 | 0 | 46 | 100 | 19 | 0 | 6.1 | 0 | 0 | 0 | |
| BV605 | 0 | 0 | 0 | 3.6 | 0 | 100 | 94 | 10 | 0 | 9 | 14 | |
| BV560 | 0 | 5.5001 | 0 | 2 | 1 | 7.1 | 100 | 9 | 0 | 10 | 0 | |
| BV785 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 30 | 0 | |
| BUV395 | 0 | 0 | 0 | 1.7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | |
| BUV737 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3.7001 | 3 | 100 | 0 | |
| PE | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | |
Tabell 2: Kompensasjonsparametrene for flowcytometriske analyser. Forkortelser: BV = strålende fiolett; BUV = strålende ultrafiolett; FITC = fluoresceinisotiocyanat; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin.
| Gruppe av TPF | Polyfunksjonell karakterisering (%) | |||||||
| Stimulus | CD107a | IFN-γ | TNF-α | IL-2 | MIP-1α | |||
| CD8+ T-celler | TCM | Vaksinert | JEV | 1,50±0,48 | 1.60±0.69 | 0,66±0,32 | 0,54±0,27 | 0,16±0,11 |
| Ctrl | 0,51±0,38 | 0,31±0,13 | 0,28±0,13 | 0,37±0,20 | 0.02±0.05 | |||
| Uvaksinert | JEV | 0.38±0.19 | 0,20±0,03 | 0.19±0.09 | 0,16±0,04 | 0.19±0.09 | ||
| Ctrl | 0,50±0,28 | 0,27±0,09 | 0.19±0.05 | 0.23±0.14 | 0.08±0.11 | |||
| P-verdi* | - | 0.00 | 0.00 | 0.02 | 0.01 | 0.70 | ||
| TEM | Vaksinert | JEV | 1,47±0,58 | 1.21±0.22 | 0,49±0,36 | 0,33±0,31 | 0.24±0.17 | |
| Ctrl | 0,82±0,48 | 0,39±0,15 | 0.16±0.18 | 0.23±0.256 | 0.09±0.21 | |||
| Uvaksinert | JEV | 0,41±0,25 | 0.14±0.09 | 0,15±0,11 | 0.20±0.07 | 0,15±0,13 | ||
| Ctrl | 0,34±0,13 | 0.21±0.15 | 0,17±0,10 | 0.19±0.19 | 0.01±0.02 | |||
| P-verdi* | - | 0.01 | 0.00 | 0.08 | 0.13 | 0.36 | ||
| CD4+ T-celler | TCM | Vaksinert | JEV | 1,55±0,43 | 1.16±0.24 | 0,57±0,25 | 0.29±0.18 | 0.19±0.07 |
| Ctrl | 0,44±0,27 | 0.26±0.20 | 0,15±0,06 | 0.12±0.06 | 0.04±0.07 | |||
| Uvaksinert | JEV | 0,28±0,08 | 0.21±0.08 | 0.17±0.03 | 0,21±0,16 | 0.10±0.03 | ||
| Ctrl | 0,31±0,13 | 0.26±0.06 | 0,14±0,04 | 0.25±0.13 | 0.04±0.04 | |||
| P-verdi* | - | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.47 | 0.04 | ||
| TEM | Vaksinert | JEV | 1,54±0,58 | 1.33±0.15 | 0,89±0,25 | 0,37±0,22 | 0.21±0.05 | |
| Ctrl | 0,46±0,49 | 0,35±0,30 | 0.13±0.08 | 0.14±0.09 | 0.05±0.11 | |||
| Uvaksinert | JEV | 0,27±0,09 | 0,23±0,10 | 0,30±0,15 | 0.23±0.03 | 0.14±0.06 | ||
| Ctrl | 0,35±0,21 | 0.24±0.14 | 0.19±0.20 | 0.25±0.08 | 0.05±0.07 | |||
| P-verdi* | - | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.19 | 0.08 | ||
| * Mann-Whitney U-test, PBMC fra vaksinert individ stimulert av JEV vs. PBMCer fra uvaksinert individ stimulert av JEV ble kun vist. | ||||||||
Tabell 3: Polyfunksjonell karakterisering av TCM og TEM av CD4+ eller CD8+ T-celleresponser på JEV. Vaksinert, n = 5; uvaksinert, n = 5. Resultatene uttrykkes som gjennomsnitt ± SD. P < 0,05 indikerte en signifikant forskjell. * PBMCer fra vaksinerte individer stimulert av JEV versus PBMCs fra uvaksinerte personer stimulert av JEV bare vises. Forkortelser: TPFs = polyfunksjonelle T-celler; IFN-γ = interferon-γ; TNF-α = tumornekrosefaktor-α; IL-2 = interleukin-2; MIP-1α = makrofag inflammatorisk protein-1α; TCM = sentrale minne T-celler; TEM = effektorminne T-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen representerer en gjennomførbar flowcytometribasert deteksjonsmetode for TPF-profiler i PBMC-ene til barn vaksinert med JEV-vaksinen SA14-14-2. Denne studien brukte pbmc i venøst blod hos både vaksinerte og uvaksinerte barn som forskningsmateriale. Ved stimulering av PBMC med JEV-antigenet kan de forsterkede antigenspesifikke TPF-enekarakteriseres ved flerfarget flowcytometriantistofffarging. Sammenlignet med den konvensjonelle enzymbundne immunospotanalysemetoden, er flowcytometriens enestående fordel å presentere de funksjonelle egenskapene til PBMC-er på enkeltcellenivå så variert som mulig, og redusere antall PBMC-er som kreves for deteksjon, noe som er spesielt egnet for barn.
En klar vaksinasjonshistorie, opprettholdt celle levedyktighet, T-celleimmunogenisiteten til stimulatoren og kompatible fargetilpasningsstrategier er kritiske trinn i denne protokollen. Kina har innlemmet vaksinasjonen av JEV SA14-14-2 i det nasjonale utvidede immuniseringsprogrammet siden 2008 og har inkludert vaksinasjonshistorikken i enhetlig ledelse, som har blitt tilgjengelig for tilgjengeligheten til vaksinehistorien3. PBMC-ene som ble undersøkt i denne protokollen ble eksperimentelt holdt på is for å opprettholde maksimal celle levedyktighet. Bruken av spesifikke stimuli har tidligere blitt mye vist å være effektiv 4,5,21,22. Fargetilpasningsstrategien er hovedbegrensningen i denne metoden, og brukervennligheten til denne strategien har blitt presentert i den kontinuerlige pre-testforbedringen og instrumentparametermatchingen. I tillegg ga denne protokollen to alternativer for å kommentere minnet T-celler. Gjennom ovennevnte konfigurasjon og optimalisering av de eksperimentelle parametrene, kan det være oppnåelig å måle spesifikk og til og med kryssreaktiv immunitet ved å vurdere omfanget og frekvensen av TPF-responser på vaksinasjon ved flowcytometri. De fem representative indikatorene for å karakterisere TPFs er imidlertid en begrensning ved denne studien; de for tiden vanlige funksjonelle molekylene (CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 og MIP-1α) kan utvides for å oppdage spekteret for å mer fullstendig karakterisere allsidigheten til TPFs basert på den presenterte protokollen.
JEV-infeksjon betraktes som en vaksinasjonsforebyggbar sykdom der vaksinasjonsfremkalt minne T-cellerespons kan være kritisk for å opprettholde langvarig immunforsvar, spesielt ettersom antistoffresponsene avtar over tid4. Som den viktigste totipotente beskyttende komponenten i minnet T-celler, bør TPFs foreslås som et rutinemessig testelement for evaluering av vaksineeffektivitet og omvendt veilede design og utvikling av målrettede T-cellevaksiner. Faktisk blir rollen som T-celleimmunitet i flavivirusinfeksjonskontroll i økende grad verdsatt, og det kan til og med omgå rollen som antistoffer for bedre eller verre5. Avklaringen av TPF-profilen vil utvilsomt ytterligere begrense repertoaret av antigene epitoper, som er bundet til å redusere kostnadene for vaksiner ved å forbedre målrettingen. De synergistiske effektene av CD4+ og CD8+ T-celler utfyller hverandre og er utvilsomt mer fremtredende på TPF-er. Derfor foreslås det at studier på T PF sfokuserer på (1) profilforskjeller mellom lang- og kortsiktig TPFs; (2) identifisering av HLA-begrensede T PF-epitoper; og (3) utforskning og forskning av mer polyfunksjonelle subpopulasjoner.
Identifisering av TPF-celler i immunkontroll av virusinfeksjon hadde blitt rapportert23,24,25. Beskrivelsen av den komplette deteksjonsstrategien og prosessen med TPFs har imidlertid ikke vært godt organisert. Videre gjelder denne metodens fargevalg for flere flowcytometermodeller. Markørene kan også justeres for å oppdage andre funksjonelle undergrupper basert på denne fargetilpasningen.
Denne studien ga en T PF-deteksjonsstrategi ved å kombinere ex vivo-spesifikk stimulering og flowcytometri for å analysere TPF-delmengdeprofiler i PBMC-ene til JEV-vaksinemottakere. De isolerte PBMC-ene ble først stimulert med JEV-antigenet og deretter farget med de tilsvarende fluorescerende merkede antistoffene, og JEV-spesifikke CD4+ og CD8+ minne TPF-erble karakterisert ved flowcytometri. Basert på dette resultatet kan T PF-frekvensene til dobbelt-, trippel-, firemanns- og femdoble funksjoner beregnes videre for å beskrive TPF-er mer detaljert og meromfattende. Rutinemessig venøst blodvolum (2 ml) hos barn har vist seg å være tilstrekkelig for TPF-studier. Derfor forventes deteksjonsmetodene for virusspesifikke TPFs å bli brukt til å utforske tiltak av T-cellemediert adaptiv immunitet assosiert med vaksinasjon eller infeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
RW ble støttet av National Natural Science Foundation of China (82002130), Beijing Natural Science Foundation of China (7222059). ZD.X. ble støttet av CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
| anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
| APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
| BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
| BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
| BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
| BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
| BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
| Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
| FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
| Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |
References
- Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity. Pathogens. 11 (3), 317 (2022).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).
- Wang, R., et al. Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children. Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).
- Wang, R., et al. Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).
- Wang, R., et al. T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).
- Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).
- Jain, N., et al. CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).
- Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines. NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).
- Weaver, J. M., et al. Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza. PloS One. 8 (-), 57275 (2013).
- Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).
- Gui, L., et al. IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells. Cytokine. 84, 37-46 (2016).
- Terahara, K., et al. Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection. Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).
- Tanyi, J. L., et al. Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer. NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).
- Ammirati, E., et al. Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models. Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).
- Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study. Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).
- Zhang, Y., et al. Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion. Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).
- Shin, H., Iwasaki, A. Tissue-resident memory T cells. Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).
- Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents. Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).
- Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system. Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Zheng, X., et al. Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).
- Zheng, X., et al. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19. Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).
- Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins. Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).
