Summary
Настоящий протокол сочетает в себе стимуляцию ex vivo и проточную цитометрию для анализа профилей полифункциональных Т-клеток (Т-ПФ) в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMCs) у детей, вакцинированных вирусом японского энцефалита (JEV). Метод обнаружения и цветовая схема проточной цитометрии JEV-специфических TPF были протестированы, чтобы обеспечить ссылку для аналогичных исследований.
Abstract
Т-клеточный иммунитет играет важную роль в борьбе с флавивирусной инфекцией, либо после вакцинации, либо после естественной инфекции. «Качество» Т-клетки необходимо оценивать по функции, а более высокая функция связана с более мощной иммунной защитой. Т-клетки, которые могут одновременно продуцировать два или более цитокинов или хемокинов на одноклеточном уровне, называются полифункциональными Т-клетками (TPF), которые опосредуют иммунные реакции через различные молекулярные механизмы для экспрессии маркеров дегрануляции (CD107a) и секретирования интерферона (IFN)-γ, фактора некроза опухоли (TNF)-α, интерлейкина (IL)-2 или воспалительного белка макрофагов (MIP)-1α. Появляется все больше доказательств того, что TPFтесно связаны с поддержанием долговременной иммунной памяти и защиты и что их повышенная доля является важным маркером защитного иммунитета и важна для эффективного контроля вирусной инфекции и реактивации. Эта оценка относится не только к специфическим иммунным реакциям, но и к оценке перекрестно-реактивных иммунных реакций. Здесь, взяв в качестве примера вирус японского энцефалита (JEV), был протестирован метод обнаружения и цветовая схема проточной цитометрии JEV-специфических TPF, продуцируемых мононуклеарными клетками периферической крови детей, вакцинированных против японского энцефалита, чтобы обеспечить ссылку на аналогичные исследования.
Introduction
Вирус японского энцефалита (JEV) является важным переносимым комарами вирусом, принадлежащим к роду Flavivirus в семействе Flaviviridae1. Многие страны Азиатско-Тихоокеанского региона уже давно сталкиваются с огромными проблемами общественного здравоохранения из-за огромного бремени болезней, вызванных японским энцефалитом (ЯЭ), но это значительно улучшилось с увеличением доступности различных типов прививок2. Адаптивные защитные иммунные реакции, вызванные естественной инфекцией или вакцинацией, способствуют профилактике и противовирусной регуляции. Гуморальный иммунитет и клеточно-опосредованный иммунитет классифицируются как адаптивный иммунитет, и индукция первого всегда рассматривалась как ключевая стратегия в разработке вакцин, хотя и с относительно ограниченным пониманием в последние3. Однако роль Опосредованного Т-клетками иммунитета в ограничении распространения флавивируса и клиренса вируса все больше внимания уделяется и широко изучается4. Кроме того, Т-клеточный иммунитет не только незаменим в JEV-специфических противовирусных реакциях, но и играет заметную роль в перекрестной защите от вторичной инфекции гетерологичными флавивирусами, что было продемонстрировано в предыдущих исследованиях5. Предполагается, что этот эффект может обойти потенциальные эффекты усиления, опосредованные антителами, при инфекции5. Следует отметить, что такой перекрестно-реактивный Т-клеточный иммунитет важен, особенно при отсутствии вакцин и противовирусных препаратов против флавивирусов. Хотя было проведено много исследований для определения вклада Т-клеток в инфекцию JEV в отношении CD4+ и CD8+ Т-клеток 6,7, соответствующие линии, секретирующие цитокины, и их функциональная диверсификация остаются неопределенными, что означает, что выяснение точных функций хелперных и киллерных Т-клеток затруднено.
Масштаб их противовирусной защиты определяет качество реакций Т-клеток. CD4+ или CD8+ Т-клетки, которые могут сочетать две или более функции, включая секрецию цитокинов и дегрануляцию, характеризуются как полифункциональные Т-клетки (TPFs) при специфической стимуляции на одноклеточном уровне8. CD4 + Т-клетки, которые производят один или несколько цитокинов, могут иметь различные эффекты и иммунные воспоминания. Например, IL-2+ IFN-γ + CD4 + Т-клетки с большей вероятностью образуют долгосрочный эффективный защитный ответ, чем IL-2 + CD4 + Т-клетки9, которые могут быть использованы в качестве важного параметра при оценке эффекта вакцинации. Частота IL-2+ IFN-γ + CD4 + Т-клеток увеличивается у пациентов с длительным непрогрессированием синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), в то время как CD4 + Т-клетки у пациентов с прогрессированием СПИДа более склонны к производству IFN-γ в одиночку из-за стимулирующего эффекта IL-2 на пролиферацию Т-клеток10. Кроме того, было показано, что подмножество IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ выживает в течение длительного времени in vivo и синергетически способствует функции уничтожения11. Хотя CD8+ Т-клетки с большей вероятностью проявляют цитотоксическую активность, некоторые CD4+ Т-клетки также оснащены цитотоксической активностью в качестве косвенно обнаруженной экспрессии поверхностных молекул CD107a12. Кроме того, некоторые подмножества Т-клеток экспрессируют хемокин MIP-1α, который часто секретируется моноцитами для участия в Опосредованной Т-клетками рекрутации нейтрофилов13. Аналогичным образом, CD8 + TPFs также может быть использован для характеристики универсальности вышеуказанных маркеров. Исследования показали, что стратегия прайм-буст может эффективно вызывать длительный период защитных эффектов TPF 13, которые могут усилить защиту, вызванную вакцинацией. Центральной особенностью при изучении иммунной системы является способность Т-клеток памяти способствовать более сильным, быстрым и эффективным ответам на вторичные вирусные проблемы, чем наивные Т-клетки. Эффекторные Т-клетки памяти (Т-ЭМ) и Т-клетки центральной памяти (Т-СМ) являются важными подмножествами Т-клеток, которые часто дифференцируются составной экспрессией CD27/CD45RO или CCR7/CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ или CCR7+ CD45RA-) имеет тенденцию локализоваться во вторичных лимфоидных тканях, в то время как TEM (CD27- CD45RO+ или CCR7- CD45RA-) локализуется в лимфоидных и периферических тканях15,16. TEM обеспечивает немедленную, но не устойчивую защиту, тогда как TCM поддерживает ответ, размножаясь во вторичных лимфоидных органах и генерируя новые эффекторы17. Таким образом, учитывая, что клетки памяти могут опосредуть специфические и эффективные реакции на вирусы, возникают вопросы о вкладе этого подмножества полифункций.
С развитием технологии проточной цитометрии стало обычным делом одновременно обнаруживать маркеры более 10 кластеров, фенотипов и дифференцированных антигенов, что полезно для более обильного аннотирования функциональных иммунологических особенностей на отдельных Т-клетках, чтобы уменьшить неправильную интерпретацию и трудности в понимании фенотипов Т-клеток. В этом исследовании использовались стимуляция ex vivo и проточная цитометрия для анализа профилей TPF в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMCs) у детей, вакцинированных JEV. Применяя этот подход, будет расширено понимание краткосрочного и долгосрочного JEV-специфического и даже перекрестно-реактивного Т-клеточного иммунитета, вызванного вакцинацией.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этическое одобрение для настоящего исследования было получено Комитетом по этике Пекинской детской больницы Столичного медицинского университета (номер одобрения: 2020-k-85). Добровольцы были набраны из Пекинской детской больницы Столичного медицинского университета. Образцы периферической венозной крови были получены от внешне здоровых детей (2 года), которые ранее получали первичную и усиленную вакцинацию живой аттенуированной вакциной JE SA14-14-2 менее полугода (дети, вакцинированные JE, n = 5) и непривитых детей (6 месяцев, n = 5). Информированное согласие людей было отменено, поскольку в этом исследовании использовались только остаточные образцы после клинических испытаний. Чтобы защитить конфиденциальность добровольцев, все данные были полностью анонимизированы и обезличены.
1. Выделение ПБМК из периферической венозной крови
- Собирать образцы периферической венозной крови (2 мл) у JE-вакцинированных и невакцинированных детей в EDTA-K 2-антикоагулянтированных пробирках (см. Таблицу материалов) стандартным методом венипунктуры18.
- Добавьте 2 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (1x PBS) для разжижения периферической крови.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс обрабатывается как можно скорее для поддержания максимальной живучести. - Добавьте 4 мл среды градиента плотности (см. Таблицу материалов) в центрифужную трубку объемом 15 мл и медленно перенесите разбавленную кровь в верхний слой разделительной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не смешивайте кровь с разделительной средой и не разрушайте контактную поверхность, образованную двумя жидкостями; в противном случае эффект разделения не будет достигнут. - Центрифуга при 800 × г в течение 20 мин при комнатной температуре. Наблюдайте за значительными слоями после центрифугирования.
- Переложите НБМК (средний слой) в другую 15 мл центрифужную трубку и промыть НБМК 10 мл среды RPMI-1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, см. Таблицу материалов).
- Центрифугу при 800 × г в течение 10 мин при комнатной температуре и осторожно выбрасывайте надосадочную палочку пипеткой.
- Повторно суспендируйте НБМК 1 мл среды RPMI-1640, содержащей 10% FBS, и подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика на основе трипана синего цвета (см. Таблицу материалов).
2. Стимуляция PBMCs инактивированными частицами JEV для индуцирования экспрессии цитокинов
- Установили две подгруппы стимуляции JEV и контрольную группы в JE-вакцинированных и невакцинированных образцах соответственно.
- Отрегулируйте количество PBMCs до 2 × 106 ячеек/мл со средой RPMI-1640, содержащей 10% FBS, и засейте PBMCs в 24-луночные пластины (2 × 106 клеток/1 мл среды на скважину); привить по три скважины для каждой группы.
- Стимулируют PBMCs группы стимуляции JEV концентрированными инактивированными частицами JEV5 (2 × 105 PFU) в течение 16 ч при 37 °C в присутствии моноклональных антител CD28 (1 мкг/мл, 1:1000) и CD49d (1 мкг/мл), GolgiPlug (1 мкг/мл, 1:1000) и моненсина (1 мкг/мл, 1:1000). Для окрашивания поверхности используйте BV605-anti-CD107a (1 мкг/мл, 1:1000) (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: JEV был инактивирован УФ-облучением, как описано ранее19. - Стимулируют PBMCs контрольной группы без концентрированных вирусных частиц в течение 16 ч при 37 °C в присутствии моноклональных антител CD28 (1 мкг/мл, 1:1000) и CD49d (1 мкг/мл, 1:1000), GolgiPlug (1 мкг/мл, 1:1000) и моненсина (1 мкг/мл, 1:1000). Окрашивание поверхности BV605-anti-CD107a (1 мкг/мл, 1:1 000).
3. Ex vivo внутриклеточное окрашивание
- Соберите клеточную суспензию из каждой группы в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, центрифугу по 500 × г в течение 5 мин при комнатной температуре и удалите супернатант пипеткой.
- Повторно суспендируют клетки в 1 мл 1x PBS, добавляют поправимый краситель жизнеспособности (1 мкл/мл, 1:1000, см. Таблицу материалов) в клеточную суспензию и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте. Центрифугу при 500 × г (при комнатной температуре) в течение 5 мин и удаляют супернатант.
- Повторное суспендирование клеток в 1 мл 1x PBS. Центрифуга при 500 × г (при комнатной температуре) в течение 5 мин. Осторожно выбросьте супернатант.
- Выполните окрашивание клеточной поверхности маркером.
- Повторно суспендируют клетки в 100 мкл 1x PBS и добавляют 2 мкл каждого поверхностного маркерного антитела (BV650-анти-CD3, BUV395-анти-CD4, BV421-анти-CD8, BUV737-анти-CD27 и BV480-анти-CD45RO, коэффициент разбавления: 1:50, см. Таблицу материалов) к клеточной суспензии в каждой пробирке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол окрашивания цветных флуоресцентных антител показан в таблице 1. - Инкубируют пробирки (стадия 3.4.1) в течение 30 мин при комнатной температуре и защищают их от света. Центрифугу при 500 × г в течение 5 мин и удаляют супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Антитело BUV737-анти-CD27 и BV480-анти-CD45RO может быть заменено на BUV737-анти-CCR7 и BV480-анти-CD45RA в качестве аннотации Т-клеток памяти.
- Повторно суспендируют клетки в 100 мкл 1x PBS и добавляют 2 мкл каждого поверхностного маркерного антитела (BV650-анти-CD3, BUV395-анти-CD4, BV421-анти-CD8, BUV737-анти-CD27 и BV480-анти-CD45RO, коэффициент разбавления: 1:50, см. Таблицу материалов) к клеточной суспензии в каждой пробирке.
- Повторное суспендирование клеток в 1 мл 1x PBS. Центрифуга при 500 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Осторожно выбросьте супернатант.
- Выполняют фиксацию и разрыв мембраны.
- Повторно суспендируют клетки 500 мкл мембраноразрушающего фиксирующего раствора (см. Таблицу материалов) и фиксируют ячейки на 20 мин в темноте при комнатной температуре. Центрифугу при 500 × г в течение 5 мин и удаляют супернатант.
- Повторное суспендирование клеток в 1 мл 1x PBS. Центрифугу в течение 5 мин при 500 × г при комнатной температуре и осторожно удаляют надосадочную массу.
- Выполняют внутриклеточное окрашивание цитокином.
- Повторно суспендируйте клетки в 100 мкл 1x PBS и добавьте 2 мкл каждого цитокинового антитела (FITC-анти-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 и APC-anti-MIP-1α, коэффициент разбавления: 1:50, см. Таблицу материалов) к клеточной суспензии в каждой пробирке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы и информация о флуорофорных конъюгированных антителах приведены в таблице 1. - Инкубировать пробирки (стадия 3.8.1) в течение 30 мин при комнатной температуре в темное время суток. Центрифугу при 500 × г в течение 5 мин и удаляют супернатант.
- Повторно суспендируйте клетки в 100 мкл 1x PBS и добавьте 2 мкл каждого цитокинового антитела (FITC-анти-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 и APC-anti-MIP-1α, коэффициент разбавления: 1:50, см. Таблицу материалов) к клеточной суспензии в каждой пробирке.
- Повторное суспендирование клеток в 1 мл 1x PBS. Центрифугу при 500 × г в течение 5 мин при комнатной температуре и осторожно удаляют надосадочную массу. Добавьте 500 мкл 1x PBS для повторного суспендирования клеток.
4. Настройка проточной цитометрии
- Изолируйте только образец PBMC, следуя процедурам, описанным в шаге 1, в качестве контрольного образца. Разделите клеточную суспензию на 12 равных частей в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл (100 мкл / трубка), как указано ниже.
- Установите неокрашенные, APC-Cy7-live/dead поправимые окрашенные, BV650-anti-CD3 с одним окрашиванием, BUV395-anti-CD4 с одним окрашиванием, BV421-anti-CD8 с одним окрашиванием, BUV737-anti-CD27 с одним окрашиванием, BV480-анти-CD45RO окрашенные, BV605-anti-CD107a, FITC-anti-IFN-γ окрашенные, PE-anti-TNF-α с одним окрашиванием, BV785-anti-IL-2 с одним окрашиванием и APC-anti-MIP-1α с одним окрашиванием.
- Добавьте маркеры клеточной поверхности и внутриклеточное окрашивание цитокинов, как описано на этапе 3. Для каждого образца с одним окрашиванием добавьте только один из флуорофоров с этапа окрашивания. Добавьте 500 мкл 1x PBS для повторного суспендирования ячеек и вихря с низкой скоростью.
- Используя неокрашенный образец, отрегулируйте прямое рассеяние (FSC), боковое рассеяние (SSC) и различные напряжения флуоресцентного красителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования были установлены следующие напряжения. FSC: 440 В, SSC: 233 В, BV650: 575 В, APC-Cy7: 449 В, BUV395: 500 В, BV421: 402 В, BUV737: 585 В, BV480: 444 В, BV605: 457 В, FITC: 475 В, PE: 469 В, APC: 623 В и BV785: 725 В. - Используя образцы с одним окрашиванием, отрегулируйте компенсацию проточной цитометрии для устранения сигналов загрязнения между различными флуорофорами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры компенсации приведены в таблице 2.
5. Стратегия гейтинга и анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании для этого анализа были определены Т-клетки центральной памяти (ТCM CD8+ или CD4+ Т-клеток как CD27+ CD45RO+ или CCR7+ CD45RA- и эффекторные Т-клетки памяти (TEM) CD8+ или CD4+ Т-клеток как CD27-CD45RO+ или CCR7-CD45RA- были определены соответственно16.
- Нарисуйте полигональный затвор через точечный график FSC-области (FSC-A)/SSC-области (SSC-A), чтобы выбрать интактную популяцию лимфоцитов, исключив при этом мусор (рисунок 1A).
- Нарисуйте прямоугольный затвор через точечный график FSC-A/FSC-width (FSC-W), чтобы выделить отдельные ячейки (рисунок 1B).
- Нарисуйте прямоугольные ворота через живой/мертвый/SSC-A точечный график, чтобы выделить живые ячейки (рисунок 1C).
- Нарисуйте прямоугольный затвор через точечный график CD3/SSC-A, чтобы идентифицировать CD3+ T-ячейки (рисунок 1D).
- Нарисуйте четырехугольник через точечный график CD4/CD8, чтобы идентифицировать Т-ячейки CD4+ или CD8+ (рисунок 1E).
- Нарисуйте четырехугольник через точечный график CD45RO/CD27, чтобы разделить CD4+ или CD8+ Т-ячейки на TCM (CD27+ CD45RO+) и TEM (CD27- CD45RO+) (рисунок 1F-I).
- Нарисуйте затворы CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 и MIP-1α из TCM или TEM Т-клеток CD8+ или CD4+ для определения частоты различных паттернов отклика соответственно.
- Загрузите образцы на цитометрию последовательно. Используйте стоп-шлюз20 для приобретения 1 × 106 лимфоцитов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельный пользователь может собрать более 1 × 106 ячеек. Это число было компромиссом между затраченным временем и сбором достаточного количества клеток для получения значимых результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показана стратегия гатинга, используемая для деления TCM или TEM CD8+ или CD4+ Т-клеток от репрезентативной группы стимуляции JEV детей, вакцинированных JE. Точечный график FSC-A/SSC-A используется для идентификации лимфоцитов, а точечный график FSC-A/FSC-W используется для идентификации отдельных клеток. Жизнеспособные клетки выбираются на живом/мертвом/точечном графике SSC-A. Точечный график CD3/SSC-A используется для идентификации CD3+ Т-клеток. Точечный график CD4/CD8 используется для идентификации CD3+ CD4+ и CD3+ CD8+ Т-клеток соответственно. TCM (CD27+ CD45RO+) и TEM (CD27- CD45RO+) CD8+ или CD4+ Т-клеток выбираются отдельно на точечной диаграмме CD45RO/CD27. Клетки с фенотипом CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ и MIP-1α+ из CD8+ TCM (Рисунок 1F), CD8+ TEM (Рисунок 1G), CD4+ TCM (Рисунок 1H) и CD4+ TEM (Рисунок 1I) выбираются отдельно путем рисования соответствующего прямоугольного затвора.
Полифункциональная характеристика реакций cd4+ и CD8+ Т-клеток центральной и эффекторной памяти (включая дегрануляцию, цитокины и хемокины) на JEV у детей, вакцинированных и невакцинированных JE, показана в таблице 3. Эти результаты показывают, что повышенные уровни CD107a, IFN-γ, TNF-α и IL-2 были обнаружены в клетках CD8 + TCM вакцинированных детей после стимуляции JEV по сравнению с невакцинированными детьми. Уровень MIP-1α не отличался между двумя группами. Считается, чтоТ-ЭМ-клетки оказывают противовирусное действие непосредственно на рестимуляцию с помощью JEV. Более высокие уровни CD107a и IFN-γ были обнаружены в CD8+ TEM-клетках вакцинированной группы при стимуляции JEV по сравнению с невакцинированной группой. Однако TNF-α, IL-2 и MIP-1α не были значительно повышены в этих положительных клетках.
Антиген JEV успешно индуцировал более высокие уровни CD107a, IFN-γ, TNF-α и MIP-1α в клетках CD4 + TCM вакцинированной группы по сравнению с невакцинированной группой. Тем не менее, доля клеток IL-2+ не различалась между двумя группами при стимуляции JEV. Доля подмножеств CD107a+, IFN-γ+ и TNF-α+ КЛЕТОК CD4+ TEM в вакцинированной группе была выше в присутствии JEV, чем в невакцинированной группе.
Рисунок 1: Иллюстрация стратегии гатинга для идентификации TCM или TEM CD8+ или CD4+ Т-клеток и их подмножеств. (A) Лимфоциты были идентифицированы с использованием точечного графика FSC-A/SSC-A. (B) Одиночные ячейки были идентифицированы с использованием точечного графика FSC-A/FSC-W. (C) Живые клетки были идентифицированы с использованием графика живых/мертвых/SSC-A. (D) CD3+ Т-клетки были идентифицированы с использованием точечного графика CD3/SSC-A. (E) CD3+ CD4+ Т и CD3+ CD8+ Т-клетки были идентифицированы с использованием точечной диаграммы CD4/CD8. (F) CD8+ TCM с фенотипом CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ и MIP-1α+ были подразделены отдельно. (G) CD8+ TEM с пятью фенотипами были подразделены отдельно. (H) CD4+ TCM с пятью фенотипами были подразделены отдельно. (I) CD4+ TEM с пятью фенотипами были подразделены отдельно. Цифры на каждой панели представляют процент ячеек в воротах. Цветовое кодирование представляет частоту появления ячеек, где красный - самая высокая частота, а синий - самая низкая. Сокращения: SSC-A = площадь бокового рассеяния; FSC-A = прямая площадь рассеяния; FSC-W = прямая ширина рассеяния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Мишень антител | Конъюгированный флуорофор | Дозировка | Клон | Изотип | Лазерная линия возбуждения | Экс-Макс (нм) | Эм-Макс (нм) |
| СД3 | БВ650 | 2 мкл | СК7 | Мышь IgG1, κ | Фиолетовый | 407 | 650 |
| СД4 | БУВ395 | 2 мкл | СК3 | Мышь IgG1, κ | УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫЙ | 348 | 39 |
| СД8 | БВ421 | 2 мкл | СК1 | Мышь IgG1, κ | Фиолетовый | 407 | 421 |
| СД27 | БУВ737 | 2 мкл | Л128 | Мышь IgG1, κ | УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫЙ | 350 | 737 |
| СД45РО | БВ480 | 2 мкл | УЧЛ1 | Мышь IgG2a, κ | Фиолетовый | 436 | 478 |
| ККР7 | БУВ737 | 2 мкл | 3Д12 | Крыса IgG2a, κ | УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫЙ | 350 | 737 |
| СД45РА | БВ480 | 2 мкл | ХИ100 | Мышь IgG2b, κ | Фиолетовый | 436 | 478 |
| СД107а | БВ605 | 2 мкл | Н4А3 | Мышь IgG1, κ | Фиолетовый | 407 | 602 |
| Ил-2 | БВ785 | 2 мкл | MQ1-17H12 | Крыса IgG2a, κ | Фиолетовый | 407 | 786 |
| ИФН-γ | ФИТК | 2 мкл | 4С. В3 | Мышь IgG1, κ | Синий | 494 | 520 |
| ТНФ-α | ЧП | 2 мкл | МАб11 | Мышь IgG1, κ | Желто-зеленый | 496, 564 | 578 |
| МИП-1α | БТР | 2 мкл | 11А3 | Мышь IgG2a, κ | Красный | 650 | 660 |
| Зомби NIR | БТР-Сай7 | 1 мкл | - | - | Красный | 650 | 779 |
Таблица 1: Протокол окрашивания цветных флуоресцентных антител для проточных цитометрических анализов. Сокращения: BV = бриллиантовый фиолетовый; BUV = блестящий ультрафиолет; FITC = флуоресцеин изотиоцианат; ПЭ = фикоэритрин; APC = аллофикоцианин.
| Компенсационная референс проточной цитометрии (%) | ||||||||||||
| ФИТК | БТР | БТР-Сай7 | БВ421 | БВ480 | БВ605 | БВ560 | БВ785 | БУВ395 | БУВ737 | ЧП | ||
| ФИТК | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| БТР | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| БТР-Сай7 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 65 | 0 | 44 | 0 | |
| БВ421 | 0 | 0.6 | 0 | 100 | 10.5 | 3 | 15 | 3 | 0.4 | 0 | 0 | |
| БВ480 | 3 | 0 | 0 | 46 | 100 | 19 | 0 | 6.1 | 0 | 0 | 0 | |
| БВ605 | 0 | 0 | 0 | 3.6 | 0 | 100 | 94 | 10 | 0 | 9 | 14 | |
| БВ560 | 0 | 5.5001 | 0 | 2 | 1 | 7.1 | 100 | 9 | 0 | 10 | 0 | |
| БВ785 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 30 | 0 | |
| БУВ395 | 0 | 0 | 0 | 1.7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | |
| БУВ737 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3.7001 | 3 | 100 | 0 | |
| ЧП | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | |
Таблица 2: Параметры компенсации для проточных цитометрических анализов. Сокращения: BV = бриллиантовый фиолетовый; BUV = блестящий ультрафиолет; FITC = флуоресцеин изотиоцианат; ПЭ = фикоэритрин; APC = аллофикоцианин.
| Группа ТПФ | Полифункциональная характеристика (%) | |||||||
| Стимул | СД107а | ИФН-γ | ТНФ-α | Ил-2 | МИП-1α | |||
| CD8+ Т-клетки | ТСМ | Вакцинированы | JEV | 1.50±0.48 | 1.60±0.69 | 0.66±0.32 | 0.54±0.27 | 0.16±0.11 |
| Клавиша Ctrl | 0.51±0.38 | 0.31±0.13 | 0.28±0.13 | 0.37±0.20 | 0.02±0.05 | |||
| Непривитые | JEV | 0.38±0.19 | 0.20±0.03 | 0.19±0.09 | 0.16±0.04 | 0.19±0.09 | ||
| Клавиша Ctrl | 0.50±0.28 | 0.27±0.09 | 0.19±0.05 | 0.23±0.14 | 0.08±0.11 | |||
| Значение P* | - | 0.00 | 0.00 | 0.02 | 0.01 | 0.70 | ||
| ТЭМ | Вакцинированы | JEV | 1.47±0.58 | 1.21±0.22 | 0.49±0.36 | 0.33±0.31 | 0.24±0.17 | |
| Клавиша Ctrl | 0.82±0.48 | 0.39±0.15 | 0.16±0.18 | 0.23±0.256 | 0.09±0.21 | |||
| Непривитые | JEV | 0.41±0.25 | 0.14±0.09 | 0.15±0.11 | 0.20±0.07 | 0.15±0.13 | ||
| Клавиша Ctrl | 0.34±0.13 | 0.21±0.15 | 0.17±0.10 | 0.19±0.19 | 0.01±0.02 г. | |||
| Значение P* | - | 0.01 | 0.00 | 0.08 | 0.13 | 0.36 | ||
| CD4+ Т-клетки | ТСМ | Вакцинированы | JEV | 1.55±0.43 | 1.16±0.24 | 0.57±0.25 | 0.29±0.18 | 0.19±0.07 |
| Клавиша Ctrl | 0.44±0.27 | 0.26±0.20 | 0.15±0.06 | 0.12±0.06 | 0.04±0.07 | |||
| Непривитые | JEV | 0.28±0.08 | 0.21±0.08 | 0.17±0.03 | 0.21±0.16 | 0.10±0.03 | ||
| Клавиша Ctrl | 0.31±0.13 | 0.26±0.06 | 0.14±0.04 | 0.25±0.13 | 0.04±0.04 | |||
| Значение P* | - | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.47 | 0.04 | ||
| ТЭМ | Вакцинированы | JEV | 1.54±0.58 | 1.33±0.15 | 0.89±0.25 | 0.37±0.22 | 0.21±0.05 | |
| Клавиша Ctrl | 0.46±0.49 | 0.35±0.30 | 0.13±0.08 | 0.14±0.09 | 0.05±0.11 | |||
| Непривитые | JEV | 0.27±0.09 | 0.23±0.10 | 0.30±0.15 | 0.23±0.03 | 0.14±0.06 | ||
| Клавиша Ctrl | 0.35±0.21 | 0.24±0.14 | 0.19±0.20 | 0.25±0.08 | 0.05±0.07 | |||
| Значение P* | - | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.19 | 0.08 | ||
| * U-тест Манна-Уитни, PBMCs от вакцинированного человека, стимулируемого JEV vs. Были показаны только PBMC от невакцинированного человека, стимулируемого JEV. | ||||||||
Таблица 3: Полифункциональная характеристика TCM и TEM ответов CD4+ или CD8+ Т-клеток на JEV. Привитые, n = 5; непривитые, n = 5. Результаты выражены как среднее ± SD. P < 0,05 указывает на существенную разницу. * Показаны PBMCs от вакцинированных лиц, стимулируемых JEV, по сравнению с PBMCs от невакцинированных лиц, стимулируемых только JEV. Сокращения: TPFs = полифункциональные Т-клетки; IFN-γ = интерферон-γ; TNF-α = фактор некроза опухоли α; Ил-2 = интерлейкин-2; MIP-1α = воспалительный белок макрофагов-1α; TCM = центральная память Т-клеток; TEM = эффектор памяти Т-клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол представляет собой осуществимый метод обнаружения на основе проточной цитометрии для профилей TPF в PBMCs детей, вакцинированных вакциной JEV SA14-14-2. В этом исследовании в качестве исследовательских материалов использовались ПБМК венозной крови как вакцинированных, так и невакцинированных детей. При стимуляции PBMCs антигеном JEV эти амплифицированные антиген-специфические TPFs могут характеризоваться окрашиванием многоцветной проточной цитометрии антител. По сравнению с обычным методом иммуноферментного анализа, выдающимся преимуществом проточной цитометрии является представление функциональных особенностей PBMCs на уровне одной клетки как можно более разнообразно, уменьшая количество PBMCs, необходимых для обнаружения, что особенно подходит для детей.
Четкая история вакцинации, поддержание жизнеспособности клеток, иммуногенность Т-клеток стимулятора и совместимые стратегии сопоставления цветов являются критическими шагами в этом протоколе. Китай включил вакцинацию JEV SA14-14-2 в национальную расширенную программу иммунизации с 2008 года и включил историю вакцинации в единое управление, которое стало доступным для доступности историивакцины 3. НБМК, исследованные в этом протоколе, экспериментально хранились на льду для поддержания максимальной жизнеспособности клеток. Использование специфических стимулов ранее было широко продемонстрировано какэффективное 4,5,21,22. Стратегия сопоставления цветов является основным ограничением в этом методе, и удобство использования этой стратегии было представлено в непрерывном предварительном уточнении и сопоставлении параметров инструмента. Кроме того, этот протокол предоставлял два варианта аннотирования Т-клеток памяти. Благодаря приведенной выше конфигурации и оптимизации экспериментальных параметров можно было бы измерить специфический и даже перекрестно-реактивный иммунитет путем оценки масштаба и частоты реакций ТПФ на вакцинацию с помощью проточной цитометрии. Однако пять репрезентативных показателей, характеризующих TPFs, являются ограничением данного исследования; общие в настоящее время функциональные молекулы (CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 и MIP-1α) могут быть расширены для обнаружения спектра с целью более полной характеристики универсальности TPFs на основе представленного протокола.
Инфекция JEV считается заболеванием, предотвратимым вакцинацией, при котором вызванные вакцинацией реакции Т-клеток памяти могут иметь решающее значение для поддержания длительной иммунной защиты, особенно когда реакции антител ослабевают с течением времени4. В качестве основного тотипотентного защитного компонента в Т-клетках памяти TPFследует предлагать в качестве рутинного тестового элемента для оценки эффективности вакцины и, наоборот, направлять проектирование и разработку целевых Т-клеточных вакцин. Фактически, роль Т-клеточного иммунитета в инфекционном контроле флавивируса все больше ценится, и он может даже обойти роль антител к лучшему или худшему5. Уточнение профиля TPF , несомненно, еще больше сузит репертуар антигенных эпитопов, что неизбежно снизит стоимость вакцин за счет улучшения таргетирования. Синергетические эффекты CD4+ и CD8+ Т-клеток дополняют друг друга и, несомненно, более заметны наТ-ПФ. Поэтому предлагается, чтобы исследования по ТПФбыли сосредоточены на 1) различиях в профилях между долгосрочными и краткосрочными ТПФ; (2) идентификация HLA-ограниченных эпитопов TPF ; и 3) исследование и исследование более полифункциональных субпопуляций.
ИдентификацияТ-клеток ПФ в иммунном контроле вирусной инфекции была зарегистрирована 23,24,25. Однако описание полной стратегии обнаружения и процесса TPFsне было хорошо организовано. Кроме того, цветовая схема этого метода применима к нескольким моделям проточных цитометров. Маркеры также могут быть скорректированы для обнаружения других функциональных подгрупп на основе этого цветового соответствия.
Это исследование обеспечило стратегию обнаружения TPF путем объединения специфической стимуляции ex vivo и проточной цитометрии для анализа профилей подмножества TPF в PBMCs реципиентов вакцины JEV. Изолированные PBMCs сначала стимулировали антигеном JEV, а затем окрашивали соответствующими флуоресцентно мечеными антителами, а JEV-специфические CD4+ и CD8+ memory TPFs характеризовались проточной цитометрией. Основываясь на этом результате, частоты TPF двойных, тройных, четверных и пятикратных функций могут быть дополнительно рассчитаны для более подробного и более полного описания TPF. Было показано, что обычные объемы венозной крови (2 мл) у детей достаточны для исследований TPF . Таким образом, методы обнаружения вирус-специфическихТ-ПФ, как ожидается, будут использоваться для изучения показателей Т-клеточного адаптивного иммунитета, связанного с вакцинацией или инфекцией.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
R.W. был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (82002130), Пекинским фондом естественных наук Китая (7222059). ZD.X. был поддержан Инновационным фондом медицинских наук CAMS (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
| anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
| APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
| BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
| BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
| BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
| BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
| BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
| Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
| FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
| Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |
References
- Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity. Pathogens. 11 (3), 317 (2022).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).
- Wang, R., et al. Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children. Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).
- Wang, R., et al. Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).
- Wang, R., et al. T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).
- Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).
- Jain, N., et al. CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).
- Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines. NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).
- Weaver, J. M., et al. Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza. PloS One. 8 (-), 57275 (2013).
- Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).
- Gui, L., et al. IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells. Cytokine. 84, 37-46 (2016).
- Terahara, K., et al. Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection. Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).
- Tanyi, J. L., et al. Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer. NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).
- Ammirati, E., et al. Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models. Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).
- Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study. Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).
- Zhang, Y., et al. Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion. Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).
- Shin, H., Iwasaki, A. Tissue-resident memory T cells. Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).
- Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents. Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).
- Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system. Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Zheng, X., et al. Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).
- Zheng, X., et al. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19. Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).
- Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins. Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).
