Summary
Mevcut protokol, Japon ensefalit virüsü (JEV) aşılı çocuklarda periferik kan mononükleer hücrelerinde (PBMC'ler) polifonksiyonel T hücresi (TPF) profillerini analiz etmek için ex vivo stimülasyon ve akış sitometrisini birleştirmektedir. JEV'e özgü TPF'lerin tespit yöntemi ve akış sitometrisi renk şeması, benzer çalışmalar için bir referans sağlamak üzere test edilmiştir.
Abstract
T hücresi aracılı bağışıklık, aşılamadan sonra veya doğal enfeksiyondan sonra flavivirüs enfeksiyonunun kontrolünde önemli bir rol oynar. Bir T hücresinin "kalitesinin" fonksiyona göre değerlendirilmesi gerekir ve daha yüksek fonksiyon daha güçlü bağışıklık koruması ile ilişkilidir. Tek hücre düzeyinde aynı anda iki veya daha fazla sitokin veya kemokin üretebilen T hücrelerine, degranülasyon belirteçlerini (CD107a) eksprese etmek ve interferon (IFN)-γ, tümör nekroz faktörü (TNF)-α, interlökin (IL)-2 veya makrofaj inflamatuar protein (MIP)-1α salgılamak için çeşitli moleküler mekanizmalar yoluyla bağışıklık tepkilerine aracılık eden polifonksiyonel T hücreleri (TPFs) denir. TPF'lerinuzun süreli immün hafızanın korunması ve korunması ile yakından ilişkili olduğuna ve artan oranlarının koruyucu bağışıklığın önemli bir belirteci olduğuna ve viral enfeksiyon ve reaktivasyonun etkin kontrolünde önemli olduğuna dair kanıtlar artmaktadır. Bu değerlendirme sadece spesifik immün yanıtlar için değil, aynı zamanda çapraz reaktif immün yanıtların değerlendirilmesi için de geçerlidir. Burada, Japon ensefalit virüsü (JEV) örnek alınarak, Japon ensefalitine karşı aşılanmış çocukların periferik kan mononükleer hücreleri tarafından üretilen JEV'e özgü TPF'lerintespit yöntemi ve akış sitometrisi renk şeması, benzer çalışmalar için bir referans sağlamak üzere test edilmiştir.
Introduction
Japon ensefalit virüsü (JEV), Flaviviridae familyası1 içindeki Flavivirus cinsine ait önemli bir sivrisinek kaynaklı virüstür. Birçok Asya-Pasifik ülkesi, Japon ensefalitinin (JE) neden olduğu büyük hastalık yükü nedeniyle uzun zamandır muazzam halk sağlığı zorluklarıyla karşı karşıya kalmıştır, ancak bu, çeşitli aşı türlerinin artan kullanılabilirliği ile çarpıcı bir şekilde iyileşmiştir2. Doğal enfeksiyon veya aşılama ile uyarlanan adaptif koruyucu immün yanıtlar, önleme ve antiviral düzenlemeye katkıda bulunur. Humoral immünite ve hücre aracılı immünite, adaptif immünite olarak sınıflandırılır ve birincisinin indüksiyonu, son3'te nispeten sınırlı bir anlayışla da olsa, aşı tasarımında her zaman kilit bir strateji olarak kabul edilmiştir. Bununla birlikte, flavivirüs yayılımını ve virüs klerensini sınırlamada T hücresi aracılı bağışıklığın rolü giderek daha fazla odaklanmış ve kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır4. Ayrıca, T hücresi bağışıklığı sadece JEV'e özgü antiviral yanıtlarda vazgeçilmez olmakla kalmaz, aynı zamanda önceki çalışmalarda gösterildiği gibi heterolog flavivirüslerle sekonder enfeksiyondan çapraz korunmada da önemli bir rol oynar5. Bu etkinin enfeksiyon5'teki potansiyel antikor aracılı geliştirme etkilerini atlayabileceği düşünülmektedir. Not olarak, bu tür çapraz reaktif T hücresi bağışıklığı, özellikle flavivirüslere karşı aşıların ve antiviral ilaçların yokluğunda önemlidir. JEV enfeksiyonunda T hücrelerinin CD4+ ve CD8+ T hücreleri 6,7'ye göre katkısını belirlemek için birçok çalışma yapılmış olmasına rağmen, sitokinleri salgılayan ilgili soylar ve fonksiyonel çeşitliliği belirsizliğini korumaktadır, bu da yardımcı ve öldürücü T hücrelerinin kesin fonksiyonlarının aydınlatılmasının engellendiği anlamına gelmektedir.
Antiviral savunmalarının ölçeği, T hücresi yanıtlarının kalitesini belirler. Sitokin sekresyonu ve degranülasyon dahil olmak üzere iki veya daha fazla fonksiyonu uyumlu bir şekilde verebilen CD4 + veya CD8 + T hücreleri, tek hücreli seviye8'de spesifik stimülasyon üzerine çok fonksiyonlu T hücreleri (TPFs) olarak karakterize edilir. Tek veya çoklu sitokinler üreten CD4 + T hücrelerinin çeşitli etkileri ve bağışıklık hafızaları olabilir. Örneğin, IL-2 + IFN-γ + CD4 + T hücrelerinin, aşılama etkisinin değerlendirilmesinde önemli bir parametre olarak kullanılabilecek IL-2 + CD4 + T hücreleri9'dan uzun süreli etkili bir koruyucu yanıt oluşturma olasılığı daha yüksektir. Edinilmiş immün yetmezlik sendromunun (AIDS) uzun süreli ilerlememesi olan hastalarda IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T hücrelerinin sıklığı artarken, AIDS progresyonu olan hastalarda CD4+ T hücreleri, IL-2'nin T hücre proliferasyonu üzerindeki destekleyici etkisi nedeniyle tek başına IFN-γ üretmeye daha yatkındır10. Ayrıca, IL-2 + IFN-γ + TNF-α + 'nın bir alt kümesinin in vivo olarak uzun süre hayatta kaldığı ve öldürme fonksiyonunu sinerjik olarak teşvik ettiği gösterilmiştir11. CD8 + T hücrelerinin sitotoksik aktivite gösterme olasılığı daha yüksek olmasına rağmen, bazı CD4 + T hücreleri, yüzey CD107a moleküllerinin12 dolaylı olarak tespit edilen bir ekspresyonu olarak sitotoksik aktivite ile donatılmıştır. Ek olarak, bazı T hücresi alt kümeleri, T hücresi aracılı nötrofil işe alımına katılmak için genellikle monositler tarafından salgılanan kemokin MIP-1α'yı eksprese eder13. Benzer şekilde, CD8 + TPFs, yukarıdaki belirteçlerin çok yönlülüğünü karakterize etmek için de kullanılabilir. Çalışmalar, prime-boost stratejisinin, aşılama ile ortaya çıkan korumayı artırabilecek uzun bir TPF koruyucu etkisüresi 13'ü etkili bir şekilde indükleyebileceğini göstermiştir. Bağışıklık sistemini incelemede merkezi bir özellik, hafıza T hücrelerinin naif T hücrelerinden daha ikincil viral zorluklara daha güçlü, daha hızlı ve daha etkili tepkiler verme yeteneğidir. Efektör bellek T hücreleri (TEM) ve merkezi bellek T hücreleri (TCM), genellikle CD27 / CD45RO veya CCR7 / CD45RA14'ün bileşik ekspresyonu ile farklılaşan önemli T hücresi alt kümeleridir. TCM (CD27+ CD45RO+ veya CCR7+ CD45RA-) sekonder lenfoid dokularda lokalize olma eğilimindeyken, TEM (CD27- CD45RO+ veya CCR7- CD45RA-) lenfoid ve periferik dokularda lokalize olur15,16. TEM acil fakat sürekli olmayan bir savunma sağlarken, TCM sekonder lenfoid organlarda çoğalarak ve yeni efektörler üreterek yanıtı sürdürür17. Bu nedenle, hafıza hücrelerinin virüslere karşı spesifik ve verimli hatırlama yanıtlarına aracılık edebileceği göz önüne alındığında, bu polifonksiyon alt kümesinin katkısı hakkında sorular ortaya çıkmaktadır.
Akış sitometrisi teknolojisinin gelişmesiyle birlikte, 10'dan fazla kümenin, fenotipin ve farklılaşma antijeninin belirteçlerini aynı anda tespit etmek yaygın hale gelmiştir; bu, yanlış yorumlamayı ve T hücresi fenotiplerinin anlaşılmasındaki zorlukları azaltmak için bireysel T hücreleri üzerindeki fonksiyonel immünolojik özellikleri daha bol bir şekilde açıklamak için faydalıdır. Bu çalışmada, JEV aşılı çocuklarda periferik kan mononükleer hücrelerinde (PBMC'ler) TPF profillerini analiz etmek için ex vivo stimülasyon ve akış sitometrisi kullanılmıştır. Bu yaklaşım uygulanarak, aşılama ile indüklenen kısa ve uzun vadeli JEV'e özgü ve hatta çapraz reaktif T hücre bağışıklığının anlaşılması genişletilecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmanın etik onayı, Başkent Tıp Üniversitesi Pekin Çocuk Hastanesi Etik Kurulu tarafından alınmıştır (Onay Numarası: 2020-k-85). Gönüllüler, Başkent Tıp Üniversitesi Pekin Çocuk Hastanesi'nden işe alındı. Periferik venöz kan örnekleri, daha önce yarım yıldan az bir süredir canlı zayıflatılmış JE SA14-14-2 aşısı ile asal ve güçlendirilmiş aşılama almış (JE aşılı çocuklar, n = 5) ve aşılanmamış çocuklardan (6 aylık, n = 5) görünüşte sağlıklı çocuklardan (2 yaşında) elde edildi. Bu çalışmada sadece klinik olarak test edildikten sonra kalan örnekler kullanıldığından, insan deneklerin bilgilendirilmiş onamından feragat edilmiştir. Gönüllülerin gizliliğini korumak için, tüm veriler tamamen anonimleştirildi ve kimliksizleştirildi.
1. PBMC'lerin periferik venöz kandan izolasyonu
- EDTA-K 2-antikoagüle tüplerde JE ile aşılanmış ve aşılanmamış çocuklardan periferik venöz kan örnekleri (2 mL) toplayın (bkz.
- Periferik kanı seyreltmek için 2 mL fosfat tamponlu salin (1x PBS) ekleyin.
NOT: Maksimum hayatta kalma kabiliyetini korumak için süreç mümkün olan en kısa sürede ele alınır. - 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 4 mL yoğunluk gradyanı ortamı ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve seyreltilmiş kanı yavaşça ayırma ortamının üst tabakasına aktarın.
NOT: Kanı ayırma ortamıyla karıştırmayın veya iki sıvının oluşturduğu temas yüzeyini tahrip etmeyin; aksi takdirde ayırma etkisi elde edilemeyecektir. - Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 800 × g'da santrifüj. Santrifüjlemeden sonra önemli katmanları gözlemleyin.
- PBMC'leri (orta tabaka) başka bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve PBMC'leri% 10 fetal sığır serumu içeren 10 mL RPMI-1640 ortamı ile yıkayın (FBS, bakınız Malzeme Tablosu).
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 800 × g'da santrifüj yapın ve süpernatantı bir pipetle dikkatlice atın.
- PBMC'leri% 10 FBS içeren 1 mL RPMI-1640 ortamı ile yeniden askıya alın ve hücreleri tripan mavisi tabanlı otomatik sayaçla sayın (bkz.
2. PBMC'lerin sitokin ekspresyonunu inaktive etmek için inaktive edilmiş JEV parçacıkları tarafından uyarılması
- JEV stimülasyon ve kontrol gruplarının iki alt grubunu sırasıyla JE aşılı ve aşılanmamış örneklerde ayarlayın.
- %10 FBS içeren RPMI-1640 ortamıyla PBMC sayısını 2 × 10 6 hücre/mL'ye ayarlayın ve PBMC'leri 24 delikli plakalara (kuyu başına 2 × 106 hücre/1 mL ortam) tohumlayın; Her grup için üç kuyu aşılayın.
- JEV stimülasyon grubunun PBMC'lerini, monoklonal antikorlar CD28 (1 μg / mL, 1: 1.000) ve CD49d (1 μg / mL), GolgiPlug (1 μg / mL, 1: 1.000) ve monensin(1 μg / mL, 1: 1.000) varlığında 37 ° C'de 16 saat boyunca konsantre inaktive edilmiş JEV parçacıkları5 (2 × 10 5 PFU) ile uyarın. Yüzey boyama için BV605-anti-CD107a (1 μg/mL, 1:1.000) kullanın (bkz.
NOT: JEV, daha önce tarif edildiği gibi UV ışınlaması ile inaktive edildi19. - Monoklonal antikorlar CD28 (1 μg / mL, 1: 1.000) ve CD49d (1 μg / mL, 1: 1.000), GolgiPlug (1 μg / mL, 1: 1.000) ve monensin (1 μg / mL, 1: 1.000) varlığında konsantre virüs parçacıkları olmadan kontrol grubunun PBMC'lerini 37 ° C'de 16 saat boyunca uyarın. BV605-anti-CD107a (1 μg/mL, 1:1.000) ile yüzeyi sabitleyin.
3. Ex vivo hücre içi boyama
- Her gruptan hücre süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj yapın ve süpernatantı bir pipetle çıkarın.
- Hücreleri 1 mL 1x PBS'de yeniden askıya alın, sabitlenebilir canlılık boyası (1 μL / mL, 1: 1.000, Malzeme Tablosuna bakınız) hücre süspansiyonuna ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. 500 × g'da (oda sıcaklığında) 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
- Hücreleri 1 mL'lik 1x PBS'de yeniden askıya alın. 5 dakika boyunca 500 × g'da (oda sıcaklığında) santrifüj. Süpernatantı dikkatlice atın.
- Hücre yüzeyi işaretleyici boyama işlemini gerçekleştirin.
- Hücreleri 1x PBS'nin 100 μL'sinde yeniden askıya alın ve her tüpteki hücre süspansiyonuna her bir yüzey belirteci antikorundan 2 μL (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 ve BV480-anti-CD45RO, seyreltme faktörü: 1:50, bkz.
NOT: Renk floresan antikor boyama protokolü Tablo 1'de gösterilmiştir. - Tüpleri (adım 3.4.1) oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin ve ışıktan koruyun. 500 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
NOT: BUV737-anti-CD27 ve BV480-anti-CD45RO antikorları, bellek T hücrelerinin ek açıklaması olarak BUV737-anti-CCR7 ve BV480-anti-CD45RA ile değiştirilebilir.
- Hücreleri 1x PBS'nin 100 μL'sinde yeniden askıya alın ve her tüpteki hücre süspansiyonuna her bir yüzey belirteci antikorundan 2 μL (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 ve BV480-anti-CD45RO, seyreltme faktörü: 1:50, bkz.
- Hücreleri 1 mL'lik 1x PBS'de yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj. Süpernatantı dikkatlice atın.
- Fiksasyon ve membran kırma işlemlerini gerçekleştirin.
- Hücreleri 500 μL membran kırıcı fiksatif çözelti ile yeniden askıya alın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve hücreleri oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika sabitleyin. 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
- Hücreleri 1 mL'lik 1x PBS'de yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 500 × g'da 5 dakika santrifüj yapın ve süpernatantı dikkatlice çıkarın.
- Hücre içi sitokin boyama işlemini gerçekleştirin.
- Hücreleri 1x PBS'nin 100 μL'sinde yeniden askıya alın ve her tüpteki hücre süspansiyonuna her sitokin antikorundan 2 μL (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 ve APC-anti-MIP-1α, seyreltme faktörü: 1: 50, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
NOT: Florofor konjuge antikorlar hakkındaki hacimler ve bilgiler Tablo 1'de gösterilmiştir. - Tüpleri (adım 3.8.1) karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. 500 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
- Hücreleri 1x PBS'nin 100 μL'sinde yeniden askıya alın ve her tüpteki hücre süspansiyonuna her sitokin antikorundan 2 μL (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 ve APC-anti-MIP-1α, seyreltme faktörü: 1: 50, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
- Hücreleri 1 mL'lik 1x PBS'de yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj yapın ve süpernatantı dikkatlice çıkarın. Hücreleri yeniden askıya almak için 500 μL 1x PBS ekleyin.
4. Akış sitometrisi kurulumu
- PBMC örneğini, adım 1'de denetim örneği olarak açıklanan yordamları izleyerek tek başına yalıtın. Hücre süspansiyonunu aşağıda belirtildiği gibi 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde (100 μL / tüp) 12 eşit parçaya bölün.
- Lekesiz, APC-Cy7-canlı/ölü sabitlenebilir lekeli, BV650-anti-CD3 tek lekeli, BUV395-anti-CD4 tek boyalı, BV421-anti-CD8 tek boyalı, BUV737-anti-CD27 tek boyalı, BV480-anti-CD45RO lekeli, BV605-anti-CD107a, FITC-anti-IFN-γ lekeli, PE-anti-TNF-α tek boyalı, BV785-anti-IL-2 tek boyalı ve APC-anti-MIP-1α tek boyalı örnekler kurun.
- Hücre yüzey belirteçlerini ve hücre içi sitokin boyamasını adım 3'te açıklandığı gibi ekleyin. Her tek boyama numunesi için, boyama adımından floroforlardan sadece birini ekleyin. Hücreleri ve vorteksi düşük hızda yeniden askıya almak için 500 μL 1x PBS ekleyin.
- Lekesiz bir numune kullanarak ileri saçılımı (FSC), yan saçılımı (SSC) ve farklı floresan boya voltajlarını ayarlayın.
NOT: Bu çalışmada aşağıdaki voltajlar ayarlanmıştır. FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V ve BV785: 725 V. - Tek boyama numunelerini kullanarak, farklı floroforlar arasındaki kontaminasyon sinyallerini ortadan kaldırmak için akış sitometrisi kompanzasyonunu ayarlayın.
NOT: Telafi parametreleri Tablo 2'de gösterilmiştir.
5. Geçit stratejisi ve veri analizi
NOT: Bu çalışmada, bu analiz için, merkezi bellek T hücreleri (CD27+ CD45RO+ veya CCR7+ CD45RA olarak CD8+ veya CD4+ T hücrelerinin T CM'si- ve CD8+ veya CD4+ T hücrelerinin CD27- CD45RO+ veya CCR7- CD45RA olarak efektör bellek T hücreleri (TEM) sırasıyla16 olarak tanımlanmıştır.
- Enkazı hariç tutarken bozulmamış lenfosit popülasyonunu seçmek için FSC alanı (FSC-A)/SSC-alanı (SSC-A) nokta grafiğinden bir çokgen kapısı çizin (Şekil 1A).
- Tek hücreleri seçmek için FSC-A/FSC genişliği (FSC-W) nokta grafiği boyunca dikdörtgen bir kapı çizin (Şekil 1B).
- Canlı hücreleri seçmek için canlı/ölü/SSC-A nokta grafiği boyunca dikdörtgen bir kapı çizin (Şekil 1C).
- CD3+ T hücrelerini tanımlamak için CD3/SSC-A nokta grafiğinden dikdörtgen bir kapı çizin (Şekil 1D).
- CD4+ veya CD8+ T hücrelerini tanımlamak için CD4/CD8 nokta grafiğinden dörtlü bir kapı çizin (Şekil 1E).
- CD4+ veya CD8+ T hücrelerini TCM (CD27+ CD45RO+) ve TEM (CD27- CD45RO+) (Şekil 1F-I) olarak alt bölümlere ayırmak için CD45RO/CD27 nokta grafiğinden dörtlü bir kapı çizin.
- CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 ve MIP-1α'nın kapılarını, sırasıyla CD8 + veya CD4 + T hücrelerinin TCM veya TEM'sinden çizin, farklı yanıt modellerinin frekansını belirleyin.
- Numuneleri sitometriye sırayla yükleyin. 1 × 106 lenfosit elde etmek için bir durdurma kapısı20 kullanın.
NOT: Bireysel kullanıcı 106 hücreden 1 × fazla toplayabilir. Bu sayı, geçen zaman ile anlamlı sonuçlar sağlamak için yeterli hücrenin toplanması arasında bir uzlaşmaydı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, CD8 + veya CD4 + T hücrelerinin TCM veya TEM'sini, JE aşılı çocukların temsili bir JEV stimülasyon grubundan ayırmak için kullanılan geçit stratejisini göstermektedir. FSC-A/SSC-A nokta grafiği lenfositleri tanımlamak için kullanılır ve FSC-A/FSC-W nokta grafiği tek hücreleri tanımlamak için kullanılır. Canlı hücreler canlı/ölü/SSC-A nokta grafiğinde seçilir. CD3/SSC-A nokta grafiği, CD3+ T hücrelerini tanımlamak için kullanılır. CD4/CD8 nokta grafiği sırasıyla CD3+ CD4+ ve CD3+ CD8+ T hücrelerini tanımlamak için kullanılır. CD8+ veya CD4+ T hücrelerinin TCM (CD27+ CD45RO+) ve TEM (CD27- CD45RO+) CD45RO/CD27 nokta grafiğinde ayrı ayrı seçilir. CD8+ T CM (Şekil 1F), CD8+ T EM (Şekil 1G), CD4+ T CM (Şekil 1H) ve CD4+ T EM (Şekil 1H) değerlerinden CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ ve MIP-1α+ fenotipli hücreler, karşılık gelen dikdörtgen kapı çizilerek ayrı ayrı seçilir.
Je ile aşılanmış ve aşılanmamış çocuklarda merkezi ve efektör bellek CD4+ ve CD8+ T hücre yanıtlarının (degranülasyon, sitokinler ve kemokinler dahil) JEV'e çok fonksiyonlu karakterizasyonu Tablo 3'te gösterilmiştir. Bu sonuçlar, JEV stimülasyonundan sonra aşılanmış çocukların CD8 + TCM hücrelerinde, aşılanmamış çocuklardakilere kıyasla artmış CD107a, IFN-γ, TNF-α ve IL-2 düzeylerinin arttığını göstermektedir. MIP-1α seviyesi iki grup arasında farklılık göstermedi. TEM hücrelerinin JEV ile restirasyon üzerine doğrudan antiviral etkiler gösterdiği düşünülmektedir. JEV stimülasyonu altında aşılanmış grubun CD8 + TEM hücrelerinde aşılanmamış gruba kıyasla daha yüksek CD107a ve IFN-γ seviyeleri tespit edildi. Bununla birlikte, TNF-α, IL-2 ve MIP-1α bu pozitif hücrelerde anlamlı olarak yükselmedi.
JEV antijeni, aşılanmış grubun CD4 + TCM hücrelerinde aşılanmamış gruba kıyasla daha yüksek CD107a, IFN-γ, TNF-α ve MIP-1α seviyelerini başarıyla indükledi. Bununla birlikte, IL-2 + hücrelerinin oranı, JEV stimülasyonu altındaki iki grup arasında farklılık göstermedi. Aşılanmış gruptaki CD4 + TEM hücrelerinin CD107a +, IFN-γ + ve TNF-α + alt kümelerinin oranı, JEV varlığında aşılanmamış gruba göre daha yüksekti.
Şekil 1: CD8 + veya CD4 + T hücrelerinin TCM veya TEM'sini ve alt kümelerini tanımlamak için geçit stratejisinin gösterimi. (A) Lenfositler FSC-A / SSC-A nokta grafiği kullanılarak tanımlanmıştır. (B) FSC-A/FSC-W nokta grafiği kullanılarak tek hücreler tanımlanmıştır. (C) Canlı hücreler canlı/ölü/SSC-A nokta grafiği kullanılarak tanımlanmıştır. (D) CD3 + T hücreleri CD3 / SSC-A nokta grafiği kullanılarak tanımlandı. (E) CD3+ CD4+ T ve CD3+ CD8+ T hücreleri CD4/CD8 nokta grafiği kullanılarak tanımlandı. (F) CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ ve MIP-1α+ fenotipine sahip CD8+ TCM ayrı ayrı alt bölümlere ayrıldı. (G) CD8 + TEM beş fenotiple birlikte ayrı ayrı alt bölümlere ayrıldı. (H) CD4 + TCM beş fenotiple birlikte ayrı ayrı alt bölümlere ayrıldı. (I) CD4 + TEM ile beş fenotipe ayrı ayrı alt bölümlere ayrıldı. Her paneldeki sayılar, kapılardaki hücrelerin yüzdesini temsil eder. Renk kodlaması, kırmızının en yüksek frekans ve mavinin en düşük olduğu hücrelerin oluşma sıklığını temsil eder. Kısaltmalar: SSC-A = yan dağılım alanı; FSC-A = ileri dağılım alanı; FSC-W = ileri dağılım genişliği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Antikor Hedefi | Konjuge Florofor | Dozaj | Klon | Izotip | Uyarma lazer hattı | Ex-Max (nm) | Em-Max (nm) |
| CD3 | BV650 Serisi | 2 μL | SK7 Serisi | Fare IgG1, κ | Menekşe | 407 | 650 |
| CD4 | BUV395 | 2 μL | SK3 Serisi | Fare IgG1, κ | UV | 348 | 39 |
| CD8 | BV421 Serisi | 2 μL | SK1 Serisi | Fare IgG1, κ | Menekşe | 407 | 421 |
| CD27 | BUV737 | 2 μL | L128 Serisi | Fare IgG1, κ | UV | 350 | 737 |
| CD45RO | BV480 Serisi | 2 μL | UCHL1 | Fare IgG2a, κ | Menekşe | 436 | 478 |
| CCR7 Serisi | BUV737 | 2 μL | 3D12 | Sıçan IgG2a, κ | UV | 350 | 737 |
| CD45RA | BV480 Serisi | 2 μL | MERHABA100 Serisi | Fare IgG2b, κ | Menekşe | 436 | 478 |
| CD107a | BV605 Serisi | 2 μL | H4A3 | Fare IgG1, κ | Menekşe | 407 | 602 |
| IL-2 | BV785 Serisi | 2 μL | MQ1-17H12 Serisi | Sıçan IgG2a, κ | Menekşe | 407 | 786 |
| IFN-γ | FITC | 2 μL | 4S. B3 Sınıfı | Fare IgG1, κ | Mavi | 494 | 520 |
| TNF-α | PE | 2 μL | MAb11 | Fare IgG1, κ | Sarı-Yeşil | 496, 564 | 578 |
| MIP-1α | APC | 2 μL | 11A3 | Fare IgG2a, κ | Kırmızı | 650 | 660 |
| Zombi NIR | APC-Cy7 Serisi | 1 μL | - | - | Kırmızı | 650 | 779 |
Tablo 1: Akış sitometrik analizleri için renk floresan antikor boyama protokolü. Kısaltmalar: BV = parlak menekşe; BUV = parlak ultraviyole; FITC = floresein izotiyosiyanat; PE = fikoeritrin; APC = allophycocyanin.
| Akım sitometrisinin kompanzasyon referansı (%) | ||||||||||||
| FITC | APC | APC-Cy7 Serisi | BV421 Serisi | BV480 Serisi | BV605 Serisi | BV560 Serisi | BV785 Serisi | BUV395 | BUV737 | PE | ||
| FITC | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| APC | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| APC-Cy7 Serisi | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 65 | 0 | 44 | 0 | |
| BV421 Serisi | 0 | 0.6 | 0 | 100 | 10.5 | 3 | 15 | 3 | 0.4 | 0 | 0 | |
| BV480 Serisi | 3 | 0 | 0 | 46 | 100 | 19 | 0 | 6.1 | 0 | 0 | 0 | |
| BV605 Serisi | 0 | 0 | 0 | 3.6 | 0 | 100 | 94 | 10 | 0 | 9 | 14 | |
| BV560 Serisi | 0 | 5.5001 | 0 | 2 | 1 | 7.1 | 100 | 9 | 0 | 10 | 0 | |
| BV785 Serisi | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 30 | 0 | |
| BUV395 | 0 | 0 | 0 | 1.7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | |
| BUV737 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3.7001 | 3 | 100 | 0 | |
| PE | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | |
Tablo 2: Akış sitometrik analizleri için kompanzasyon parametreleri. Kısaltmalar: BV = parlak menekşe; BUV = parlak ultraviyole; FITC = floresein izotiyosiyanat; PE = fikoeritrin; APC = allophycocyanin.
| TPF Grubu | Çok fonksiyonlu karakterizasyon (%) | |||||||
| Uyarıcı | CD107a | IFN-γ | TNF-α | IL-2 | MIP-1α | |||
| CD8+ T hücreleri | TCM | Aşı | cesaret | 1.50±0.48 | 1.60±0.69 | 0.66±0.32 | 0.54±0.27 | 0.16±0.11 |
| Ctrl | 0.51±0.38 | 0.31±0.13 | 0.28±0.13 | 0.37±0.20 | 0.02±0.05 | |||
| Aşılanmamış | cesaret | 0.38±0.19 | 0.20±0.03 | 0.19±0.09 | 0.16±0.04 | 0.19±0.09 | ||
| Ctrl | 0.50±0.28 | 0.27±0.09 | 0.19±0.05 | 0.23±0.14 | 0.08±0.11 | |||
| P değeri* | - | 0.00 | 0.00 | 0.02 | 0.01 | 0.70 | ||
| TEM | Aşı | cesaret | 1.47±0.58 | 1.21±0.22 | 0.49±0.36 | 0.33±0.31 | 0.24±0.17 | |
| Ctrl | 0.82±0.48 | 0.39±0.15 | 0.16±0.18 | 0.23±0.256 | 0.09±0.21 | |||
| Aşılanmamış | cesaret | 0.41±0.25 | 0.14±0.09 | 0.15±0.11 | 0.20±0.07 | 0.15±0.13 | ||
| Ctrl | 0.34±0.13 | 0.21±0.15 | 0.17±0.10 | 0.19±0.19 | 0.01±0.02 | |||
| P değeri* | - | 0.01 | 0.00 | 0.08 | 0.13 | 0.36 | ||
| CD4+ T hücreleri | TCM | Aşı | cesaret | 1.55±0.43 | 1.16±0.24 | 0.57±0.25 | 0.29±0.18 | 0.19±0.07 |
| Ctrl | 0.44±0.27 | 0.26±0.20 | 0.15±0.06 | 0.12±0.06 | 0.04±0.07 | |||
| Aşılanmamış | cesaret | 0.28±0.08 | 0.21±0.08 | 0.17±0.03 | 0.21±0.16 | 0.10±0.03 | ||
| Ctrl | 0.31±0.13 | 0.26±0.06 | 0.14±0.04 | 0.25±0.13 | 0.04±0.04 | |||
| P değeri* | - | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.47 | 0.04 | ||
| TEM | Aşı | cesaret | 1.54±0.58 | 1.33±0.15 | 0.89±0.25 | 0.37±0.22 | 0.21±0.05 | |
| Ctrl | 0.46±0.49 | 0.35±0.30 | 0.13±0.08 | 0.14±0.09 | 0.05±0.11 | |||
| Aşılanmamış | cesaret | 0.27±0.09 | 0.23±0.10 | 0.30±0.15 | 0.23±0.03 | 0.14±0.06 | ||
| Ctrl | 0.35±0.21 | 0.24±0.14 | 0.19±0.20 | 0.25±0.08 | 0.05±0.07 | |||
| P değeri* | - | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.19 | 0.08 | ||
| * Mann-Whitney U-testi, JEV tarafından uyarılan aşılanmış bireyden PBMC'ler vs. JEV tarafından uyarılan aşılanmamış bireyden PBMC'ler sadece gösterildi. | ||||||||
Tablo 3: JEV'e CD4+ veya CD8+ T hücre yanıtlarının TCM ve TEM'sinin çok fonksiyonlu karakterizasyonu. Aşılanmış, n = 5; aşılanmamış, n = 5. Sonuçlar ortalama ± olarak ifade edilir SD. P < 0.05 anlamlı bir fark göstermiştir. * JEV tarafından uyarılan aşılanmış bireylerden PBMC'ler ve sadece JEV tarafından uyarılan aşılanmamış bireylerden PBMC'ler gösterilmiştir. Kısaltmalar: TPFs = çok fonksiyonlu T hücreleri; IFN-γ = interferon-γ; TNF-α = tümör nekroz faktörü-α; IL-2 = interlökin-2; MIP-1α = makrofaj inflamatuar protein-1α; TCM = merkezi bellek T hücreleri; TEM = efektör hafıza T hücreleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, JEV aşısı SA14-14-2 ile aşılanan çocukların PBMC'lerinde TPF profilleri için uygulanabilir bir akış sitometrisi tabanlı tespit yöntemini temsil eder. Bu çalışmada hem aşılanmış hem de aşılanmamış çocukların venöz kan PBMC'leri araştırma materyali olarak kullanılmıştır. PBMC'lerin JEV antijeni ile uyarılmasıyla, bu güçlendirilmiş antijene özgü TPFs, çok renkli akış sitometrisi antikor boyaması ile karakterize edilebilir. Geleneksel enzime bağlı immünospot tahlil yöntemiyle karşılaştırıldığında, akış sitometrisinin olağanüstü avantajı, PBMC'lerin fonksiyonel özelliklerini tek hücre seviyesinde mümkün olduğunca çeşitli bir şekilde sunması ve özellikle çocuklar için uygun olan tespit için gereken PBMC sayısını azaltmasıdır.
Net bir aşılama öyküsü, hücre canlılığının korunması, uyarıcının T hücresi immünojenisitesi ve uyumlu renk eşleştirme stratejileri bu protokoldeki kritik adımlardır. Çin, JEV SA14-14-2'nin aşılanmasını 2008'den bu yana ulusal genişletilmiş bağışıklama programına dahil etti ve aşılama geçmişini, aşı tarihinin erişilebilirliği için kullanılabilir hale gelen birleşik yönetime dahil etti3. Bu protokolde incelenen PBMC'ler, maksimum hücre canlılığını korumak için deneysel olarak buz üzerinde tutuldu. Spesifik uyaranların kullanımının daha önce etkili olduğu yaygın olarak gösterilmiştir 4,5,21,22. Renk eşleştirme stratejisi bu yöntemdeki ana kısıtlamadır ve bu stratejinin kullanılabilirliği sürekli ön test iyileştirme ve cihaz parametresi eşleştirmesinde sunulmuştur. Ek olarak, bu protokol bellek T hücrelerine açıklama eklemek için iki seçenek sağladı. Yukarıdaki konfigürasyon ve deneysel parametrelerin optimizasyonu sayesinde, TPF'nin aşılamaya verdiği yanıtların ölçeğini ve sıklığını akış sitometrisi ile değerlendirerek spesifik ve hatta çapraz reaktif bağışıklığı ölçmek mümkün olabilir. Bununla birlikte, TPFs'yi karakterize eden beş temsili gösterge bu çalışmanın bir sınırlamasıdır; Şu anda yaygın olan fonksiyonel moleküller (CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 ve MIP-1α), sunulan protokole dayanarak TPF'ninçok yönlülüğünü daha tam olarak karakterize etmek için spektrumu tespit etmek üzere genişletilebilir.
JEV enfeksiyonu, aşılama ile uyarılan hafıza T hücresi yanıtlarının, özellikle antikor yanıtları zamanla azaldıkça, uzun süreli bağışıklık korumasının korunmasında kritik olabileceği aşıyla önlenebilir bir hastalık olarak kabul edilir4. Bellek T hücrelerinde ana totipotent koruyucu bileşen olan TPFS, aşı etkinliğinin değerlendirilmesi için rutin bir test öğesi olarak önerilmeli ve tersine, hedeflenen T hücresi aşılarının tasarımı ve geliştirilmesine rehberlik etmelidir. Aslında, flavivirüs enfeksiyonu kontrolünde T hücresi bağışıklığının rolü giderek daha fazla takdir edilmektedir ve hatta antikorların rolünü daha iyi veya daha kötü5 için atlayabilir. TPF profilinin açıklığa kavuşturulması, şüphesiz, hedeflemeyi iyileştirerek aşıların maliyetini düşürmek zorunda olan antijenik epitopların repertuarını daha da daraltacaktır. CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin sinerjik etkileri birbirini tamamlar ve şüphesiz TPFs'de daha belirgindir. Bu nedenle, T PF s ile ilgili çalışmaların (1) uzun ve kısa vadeli TPFs arasındaki profil farklılıklarına odaklandığı önerilmektedir; (2) HLA-kısıtlı TPF epitoplarının tanımlanması; ve (3) daha çok işlevli alt popülasyonların araştırılması ve araştırılması.
Viral enfeksiyonun immün kontrolünde TPF hücrelerinin tanımlanması 23,24,25 olarak bildirilmiştir. Bununla birlikte, TPFs'nin tam tespit stratejisinin ve sürecinin tanımı iyi organize edilmemiştir. Ayrıca, bu yöntemin renk şeması çoklu akış sitometresi modelleri için geçerlidir. İşaretçiler, bu renk eşleşmesine bağlı olarak diğer işlevsel alt grupları algılamak için de ayarlanabilir.
Bu çalışma, JEV aşısı alıcılarının PBMC'lerinde T PF alt küme profillerini analiz etmek için ex vivo spesifik stimülasyon ve akış sitometrisini birleştirerek bir TPF tespit stratejisi sağlamıştır. İzole PBMC'ler önce JEV antijeni ile uyarıldı ve daha sonra karşılık gelen floresan etiketli antikorlarla boyandı ve JEV-spesifik CD4 + ve CD8 + bellek T PFS, akış sitometrisi ile karakterize edildi. Bu sonuca dayanarak, çift, üçlü, dörtlü ve beşli fonksiyonların TPF frekansları, TPFs'yi daha ayrıntılı ve daha kapsamlı bir şekilde tanımlamak için daha ayrıntılı olarak hesaplanabilir. Çocuklarda rutin venöz kan hacimlerinin (2 mL) TPF çalışmaları için yeterli olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, virüse özgü TPFs için tespit yöntemlerinin, aşılama veya enfeksiyonla ilişkili T hücresi aracılı adaptif bağışıklık ölçümlerini araştırmak için kullanılması beklenmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
R.W., Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82002130), Çin Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (7222059) tarafından desteklenmiştir. ZD.X., CAMS Tıp Bilimleri İnovasyon Fonu (2019-I2M-5-026) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
| anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
| APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
| BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
| BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
| BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
| BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
| BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
| Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
| FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
| Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |
References
- Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity. Pathogens. 11 (3), 317 (2022).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).
- Wang, R., et al. Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children. Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).
- Wang, R., et al. Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).
- Wang, R., et al. T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).
- Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).
- Jain, N., et al. CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).
- Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines. NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).
- Weaver, J. M., et al. Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza. PloS One. 8 (-), 57275 (2013).
- Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).
- Gui, L., et al. IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells. Cytokine. 84, 37-46 (2016).
- Terahara, K., et al. Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection. Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).
- Tanyi, J. L., et al. Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer. NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).
- Ammirati, E., et al. Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models. Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).
- Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study. Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).
- Zhang, Y., et al. Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion. Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).
- Shin, H., Iwasaki, A. Tissue-resident memory T cells. Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).
- Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents. Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).
- Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system. Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Zheng, X., et al. Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).
- Zheng, X., et al. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19. Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).
- Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins. Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).
