כאן, אנו מדגימים את הכנת תרחיף חד תאי באיכות גבוהה של מעי אמנון לריצוף תא בודד.
אמנון הנילוס הוא אחד ממיני דגי המים המתוקים המתורבתים הנפוצים ביותר בעולם והוא מודל מחקר נפוץ לחקר דגי חקלאות ימית. הכנת תרחיפים איכותיים של תא בודד חיונית למחקרים ברמת התא הבודד כגון RNA של תא בודד או ריצוף גנום. עם זאת, אין פרוטוקול מוכן לשימוש עבור מיני דגים חקלאות ימית, במיוחד עבור המעי של אמנון. אנזימי הדיסוציאציה היעילים משתנים בהתאם לסוג הרקמה. לכן, אופטימיזציה של פרוטוקול הדיסוציאציה של רקמות על ידי בחירת שילוב האנזים או האנזים המתאים כדי להשיג מספיק תאים בני קיימא עם נזק מינימלי היא חיונית. מחקר זה מדגים פרוטוקול אופטימלי להכנת תרחיף חד-תאי איכותי ממעי אמנון הנילוס עם שילוב אנזים של collagenase/dispase. שילוב זה יעיל מאוד לדיסוציאציה עם שימוש באלבומין בסרום בקר ו- DNase להפחתת צבירת תאים לאחר העיכול. תפוקת התא עונה על הדרישות לריצוף תא בודד, עם 90% כדאיות התא וריכוז תאים גבוה. פרוטוקול זה יכול גם להשתנות כדי להכין תרחיף חד-תאי מהמעיים של מיני דגים אחרים. מחקר זה מספק פרוטוקול ייחוס יעיל ומפחית את הצורך בניסויים נוספים בהכנת תרחיפים חד-תאיים למיני דגים של חקלאות ימית.
תאים הם היחידות הבסיסיות של אורגניזמים. בהשוואה למחקרי רקמות בתפזורת, מחקרים ברמת תא בודד יכולים לשקף הטרוגניות של תאים ולספק מידע ברזולוציה גבוהה יותר1. בשנים האחרונות, חוקרים יישמו טכנולוגיות ריצוף חד-תאי עבור גנום, שעתוק, אפיגנום או מחקרים רב-אומיים ברמת התא הבודד ביונקים, דגי זברה ואורגניזמים מודל אחרים ודיווחו על פריצות דרך גדולות 2,3,4,5,6,7 . בעוד שרוב המחקרים התמקדו באורגניזמים מודלים, יש מעט פרוטוקולי ייחוס או ערכות דיסוציאציה מסחריות לריצוף חד-תאי במיני דגים כלכליים, מה שמגביל את היישום של ריצוף חד-תאי במחקר חקלאות ימית. לכן, פיתוח פרוטוקולים לדיסוציאציה של רקמות המייצרים תרחיפים חד-תאיים באיכות גבוהה עם כדאיות גבוהה של תאים ושלמות חומצות גרעין הוא חיוני.
מיטוב פרוטוקול הדיסוציאציה של רקמות עם שילוב האנזים או האנזים המתאים כדי להשיג מספיק תאים בני קיימא עם נזק מינימלי הוא חיוני. האנזים היעיל ביותר לדיסוציאציה של רקמות משתנה בהתאם לסוג הרקמה. ביונקים נעשה שימוש במספר אנזימים להכנת תרחיפים חד-תאיים לרקמות מוצקות של יונקים, כולל קולגן, דיספאז, טריפסין, פפאין, אלסטאז, היאלורונידאז, ליבראז, אקוטאז וטריפול 8,9. עיכול טריפסין בשילוב עם הפרעה מכנית שימש בדרך כלל כדי לנתק רקמות לתרבית תאים בדגים 10,11,12,13,14. טריפסין שימש או נוסף גם לקוקטייל העיכול לדיסוציאציה של רקמות במעי החולדה15 וברקמת הזימים של דג הזברה16. עם זאת, מכמה סיבות, טריפסין אינו האפשרות הטובה ביותר עבור ריצוף תא יחיד. טריפסין לבדו בדרך כלל אינו יעיל לדיסוציאציה של רקמות. בנוסף, טריפסין גורם לשבירת גדיל DNA 17,18 ולפירוק RNA19.
פפאין מפרק את החלבונים המרכיבים את הצמתים הצפופים בין התאים. בעצב יונקים ובתאי שריר חלקים, פפאין יעיל יותר והרסני פחות מפרוטאזות אחרות20,21. עם זאת, כמו טריפסין, פפאין גורם לצבירה חופשית של תאים הנגרמת על ידי DNA עקב ליזה התא המתרחשת במהלך עיכול אנזימטי9. אלסטאז מפרק אלסטין, הנמצא בדרך כלל בעור, בריאות, ברצועות, בגידים וברקמות כלי הדם22. לעתים קרובות משתמשים בו בשילוב עם collagenase, dispase או טריפסין לניתוק רקמת ריאה8. היאלורונידאז קוטע את הקשרים הגליקוזידים של היאלורונן, ותורם לעיכול המטריצה החוץ תאית ברקמות חיבור שונות ובעור 9,23.
באופן כללי, collagenase ו dispase הם אפשרויות טובות עבור פירוק מטריצה תאיים. הם שימשו בדיסוציאציה של מעיים אנושיים, עכברים ודגי זברה24,25,26,27. Collagenase הורס את הקשר הפפטידי בקולגן, מקדם את העיכול של המטריצה החוץ תאית ומשחרר את התאים לתרחיף, ולכן collagenase משמש לעתים קרובות לדיסוציאציה של רקמות מוצקות של בני אדם ועכברים, כולל עבור הכבד 28,29, טחול30, לבלב31 ומעי 25. דיספאז הוא פרוטאז שמבצע הידרוליזה של קשרי פפטיד N-טרמינליים של שאריות חומצות אמינו לא קוטביות, והוא עדין יותר מקולגן. הוא מבקע את מרכיבי המטריקס החוץ תאיים, כגון פיברונקטין (fibronectin), קולגן מסוג IV, ובמידה פחותה קולגן מסוג I, מבלי להשפיע על הצטלבויות התא. דיספאז משמש בנפרד או עם אנזימים אחרים לדיסוציאציה של רקמות, כגון עבור מעי25,32, מוח33, כבד 34 וכו ‘. נוסף על כך, קוקטיילים מסחריים לעיכול, כולל ליבראז, אקוטאז וטריפל, הם גם חלופות טובות לדיסוציאציה של רקמות מוצקות, במיוחד עבור העור, הכבד והכליות 8,9.
אמנון הנילוס (Oreochromis niloticus) שייך למשפחה Cichlidae של הסדר Perciformes. זהו אחד ממיני דגי המים המתוקים המתורבתים ביותר באזורים טרופיים וסובטרופיים, עם ייצור שנתי של 4.5 מיליון טון בשנת 202235. זהו אחד ממיני דגי החקלאות הימית הנחקרים ביותר עם גנום מבואר היטב. אמנון הנילוס הוא מודל מחקר אידיאלי עבור מיני דגים בחקלאות ימית בשל זמן הייצור הקצר שלו, קלות הגידול שלו ויכולת ההסתגלות למגוון רחב של סביבות גידול. המעי הוא בעל עניין מחקרי רב שכן הוא איבר התזונה, העיכול והספיגה, חילוף החומרים ומערכת החיסון הרירית. המעי הוא בית הגידול של אוכלוסיות מיקרוביאליות והוא רקמת חיסון חיונית36. הוא פעיל מבחינה חיסונית בשל נוכחותם של סוגים רבים של תאי חיסון, כולל מקרופאגים, תאי B, גרנולוציטים ותאי T.
במחקר הנוכחי פיתחנו פרוטוקול להכנת תרחיף חד-תאי איכותי ממעי האמנון של הנילוס כדי להקל על מחקרים ברמת התא הבודד במינים של דגי חקלאות ימית. על פי המאפיינים של אנזימים ספציפיים לרקמות אלה ועבודה ראשונית, collagenase/dispase מתאים לניתוק רקמת מעי אמנון. סוג האנזים האחרון שיש לקחת בחשבון בהכנת תרחיפים חד-תאיים הוא DNase-I, המונע צבירת תאים על ידי פירוק דנ”א חופשי המשתחרר דרך ליזה של תאים מתים במהלך עיכול אנזימטי מבלי ליזום מסלולים אפופטוטיים9 ומגביר את תפוקת התא החי36. בנוסף, אלבומין בסרום בקר (BSA) מתווסף למאגר הכביסה כדי להפחית את גושי התאים ולשפר את כדאיות התא. מספר חברות ריאגנטים מתארות BSA כמייצב אנזים. תוספת של 0.04%-1% BSA ל-PBS (מלח חוצץ פוספט) שימשה לפיתוח פתרון שטיפה להכנת מתלי ריצוף חד-תאי ללא תופעות לוואי38. תוספת של יחס נמוך של BSA יכולה לעזור לשמור על כדאיות התא ולמנוע הצטברות חופשית של תאים הנגרמת על ידי DNA עקב ליזה של תאים. פרוטוקול זה יכול גם לספק התייחסות רבת ערך לפיתוח פרוטוקולי דיסוציאציה של תאים מהמעיים של מיני דגים אחרים בחקלאות ימית.
פרוטוקול זה מתאר הכנה של תרחיף חד תאי באיכות גבוהה של מעי אמנון הנילוס. לפני הדיסוציאציה, הסרת שומן ומזנטריה מהמעי היא הכרחית, במיוחד עבור מעיים דגים טורפים עם שומן רב. שימוש במזרק במקום גירוד קשה כדי לשטוף את תוכן המעי מפחית את הנזק המכני לתאים. כדי להבטיח את כדאיות התא, חיוני גם לשמור על הט…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להכיר בתמיכת הקרן למדעי הטבע של מחוז היינאן של סין (NO. 320QN211) ותוכנית קרן המחקר של מעבדת המפתח המחוזית של גואנגדונג לבקרת מחלות בעלי חיים ימיים ותרבות בריאה של סין (NO. PBEA2021ZD01).
0.22-μm Sterile Filter | Solarbio Life Sciences | SLGV033RB | It is used to filter and sterilize the enzyme solution. |
40-μm Cell Strainer | Solarbio Life Sciences | F8200 | Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces. |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | SRE0098 | Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 – 8 °C. |
Collagenase II | Sangon Biotech | A004202 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
Collagenase/dispase | Roche | 10269638-001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
DNase I | Sigma-Aldrich | AMPD1 | DNase I helps reduce cell clumping. |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free | Solarbio Life Sciences | E607009-0500 | Store at room temperature. |
Elastase | Sangon Biotech | A600438 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL. |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Serum, used at volume of 5% in digetstion solution. |
Inverted Microscope | Leica | qTOWER3G | It is used to examine cell viability. |
Liberase | Roche | 5401119001 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL. |
Nile tilpia (Oreochromis niloticus) | ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. | NA | Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Solarbio Life Sciences | P1020 | Store at room temperature. |
Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5424 | It is used to spin down the tissue and cell petet. |
RNase inhibitor | NEB | M0314L | Inhibit RNase activity |
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent | Sangon Biotech | B644201-0050 | It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature. |
Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | For fish euthanasia. |
Trypan Blue | Invitrogen | C0040 | It is used for staining dead cells. |
Trypsin | Sangon Biotech | E607001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |