Summary

הכנת תרחיף חד-תאי ממעי אמנון הנילוס לריצוף חד-תאי

Published: February 10, 2023
doi:

Summary

כאן, אנו מדגימים את הכנת תרחיף חד תאי באיכות גבוהה של מעי אמנון לריצוף תא בודד.

Abstract

אמנון הנילוס הוא אחד ממיני דגי המים המתוקים המתורבתים הנפוצים ביותר בעולם והוא מודל מחקר נפוץ לחקר דגי חקלאות ימית. הכנת תרחיפים איכותיים של תא בודד חיונית למחקרים ברמת התא הבודד כגון RNA של תא בודד או ריצוף גנום. עם זאת, אין פרוטוקול מוכן לשימוש עבור מיני דגים חקלאות ימית, במיוחד עבור המעי של אמנון. אנזימי הדיסוציאציה היעילים משתנים בהתאם לסוג הרקמה. לכן, אופטימיזציה של פרוטוקול הדיסוציאציה של רקמות על ידי בחירת שילוב האנזים או האנזים המתאים כדי להשיג מספיק תאים בני קיימא עם נזק מינימלי היא חיונית. מחקר זה מדגים פרוטוקול אופטימלי להכנת תרחיף חד-תאי איכותי ממעי אמנון הנילוס עם שילוב אנזים של collagenase/dispase. שילוב זה יעיל מאוד לדיסוציאציה עם שימוש באלבומין בסרום בקר ו- DNase להפחתת צבירת תאים לאחר העיכול. תפוקת התא עונה על הדרישות לריצוף תא בודד, עם 90% כדאיות התא וריכוז תאים גבוה. פרוטוקול זה יכול גם להשתנות כדי להכין תרחיף חד-תאי מהמעיים של מיני דגים אחרים. מחקר זה מספק פרוטוקול ייחוס יעיל ומפחית את הצורך בניסויים נוספים בהכנת תרחיפים חד-תאיים למיני דגים של חקלאות ימית.

Introduction

תאים הם היחידות הבסיסיות של אורגניזמים. בהשוואה למחקרי רקמות בתפזורת, מחקרים ברמת תא בודד יכולים לשקף הטרוגניות של תאים ולספק מידע ברזולוציה גבוהה יותר1. בשנים האחרונות, חוקרים יישמו טכנולוגיות ריצוף חד-תאי עבור גנום, שעתוק, אפיגנום או מחקרים רב-אומיים ברמת התא הבודד ביונקים, דגי זברה ואורגניזמים מודל אחרים ודיווחו על פריצות דרך גדולות 2,3,4,5,6,7 . בעוד שרוב המחקרים התמקדו באורגניזמים מודלים, יש מעט פרוטוקולי ייחוס או ערכות דיסוציאציה מסחריות לריצוף חד-תאי במיני דגים כלכליים, מה שמגביל את היישום של ריצוף חד-תאי במחקר חקלאות ימית. לכן, פיתוח פרוטוקולים לדיסוציאציה של רקמות המייצרים תרחיפים חד-תאיים באיכות גבוהה עם כדאיות גבוהה של תאים ושלמות חומצות גרעין הוא חיוני.

מיטוב פרוטוקול הדיסוציאציה של רקמות עם שילוב האנזים או האנזים המתאים כדי להשיג מספיק תאים בני קיימא עם נזק מינימלי הוא חיוני. האנזים היעיל ביותר לדיסוציאציה של רקמות משתנה בהתאם לסוג הרקמה. ביונקים נעשה שימוש במספר אנזימים להכנת תרחיפים חד-תאיים לרקמות מוצקות של יונקים, כולל קולגן, דיספאז, טריפסין, פפאין, אלסטאז, היאלורונידאז, ליבראז, אקוטאז וטריפול 8,9. עיכול טריפסין בשילוב עם הפרעה מכנית שימש בדרך כלל כדי לנתק רקמות לתרבית תאים בדגים 10,11,12,13,14. טריפסין שימש או נוסף גם לקוקטייל העיכול לדיסוציאציה של רקמות במעי החולדה15 וברקמת הזימים של דג הזברה16. עם זאת, מכמה סיבות, טריפסין אינו האפשרות הטובה ביותר עבור ריצוף תא יחיד. טריפסין לבדו בדרך כלל אינו יעיל לדיסוציאציה של רקמות. בנוסף, טריפסין גורם לשבירת גדיל DNA 17,18 ולפירוק RNA19.

פפאין מפרק את החלבונים המרכיבים את הצמתים הצפופים בין התאים. בעצב יונקים ובתאי שריר חלקים, פפאין יעיל יותר והרסני פחות מפרוטאזות אחרות20,21. עם זאת, כמו טריפסין, פפאין גורם לצבירה חופשית של תאים הנגרמת על ידי DNA עקב ליזה התא המתרחשת במהלך עיכול אנזימטי9. אלסטאז מפרק אלסטין, הנמצא בדרך כלל בעור, בריאות, ברצועות, בגידים וברקמות כלי הדם22. לעתים קרובות משתמשים בו בשילוב עם collagenase, dispase או טריפסין לניתוק רקמת ריאה8. היאלורונידאז קוטע את הקשרים הגליקוזידים של היאלורונן, ותורם לעיכול המטריצה החוץ תאית ברקמות חיבור שונות ובעור 9,23.

באופן כללי, collagenase ו dispase הם אפשרויות טובות עבור פירוק מטריצה תאיים. הם שימשו בדיסוציאציה של מעיים אנושיים, עכברים ודגי זברה24,25,26,27. Collagenase הורס את הקשר הפפטידי בקולגן, מקדם את העיכול של המטריצה החוץ תאית ומשחרר את התאים לתרחיף, ולכן collagenase משמש לעתים קרובות לדיסוציאציה של רקמות מוצקות של בני אדם ועכברים, כולל עבור הכבד 28,29, טחול30, לבלב31 ומעי 25. דיספאז הוא פרוטאז שמבצע הידרוליזה של קשרי פפטיד N-טרמינליים של שאריות חומצות אמינו לא קוטביות, והוא עדין יותר מקולגן. הוא מבקע את מרכיבי המטריקס החוץ תאיים, כגון פיברונקטין (fibronectin), קולגן מסוג IV, ובמידה פחותה קולגן מסוג I, מבלי להשפיע על הצטלבויות התא. דיספאז משמש בנפרד או עם אנזימים אחרים לדיסוציאציה של רקמות, כגון עבור מעי25,32, מוח33, כבד 34 וכו ‘. נוסף על כך, קוקטיילים מסחריים לעיכול, כולל ליבראז, אקוטאז וטריפל, הם גם חלופות טובות לדיסוציאציה של רקמות מוצקות, במיוחד עבור העור, הכבד והכליות 8,9.

אמנון הנילוס (Oreochromis niloticus) שייך למשפחה Cichlidae של הסדר Perciformes. זהו אחד ממיני דגי המים המתוקים המתורבתים ביותר באזורים טרופיים וסובטרופיים, עם ייצור שנתי של 4.5 מיליון טון בשנת 202235. זהו אחד ממיני דגי החקלאות הימית הנחקרים ביותר עם גנום מבואר היטב. אמנון הנילוס הוא מודל מחקר אידיאלי עבור מיני דגים בחקלאות ימית בשל זמן הייצור הקצר שלו, קלות הגידול שלו ויכולת ההסתגלות למגוון רחב של סביבות גידול. המעי הוא בעל עניין מחקרי רב שכן הוא איבר התזונה, העיכול והספיגה, חילוף החומרים ומערכת החיסון הרירית. המעי הוא בית הגידול של אוכלוסיות מיקרוביאליות והוא רקמת חיסון חיונית36. הוא פעיל מבחינה חיסונית בשל נוכחותם של סוגים רבים של תאי חיסון, כולל מקרופאגים, תאי B, גרנולוציטים ותאי T.

במחקר הנוכחי פיתחנו פרוטוקול להכנת תרחיף חד-תאי איכותי ממעי האמנון של הנילוס כדי להקל על מחקרים ברמת התא הבודד במינים של דגי חקלאות ימית. על פי המאפיינים של אנזימים ספציפיים לרקמות אלה ועבודה ראשונית, collagenase/dispase מתאים לניתוק רקמת מעי אמנון. סוג האנזים האחרון שיש לקחת בחשבון בהכנת תרחיפים חד-תאיים הוא DNase-I, המונע צבירת תאים על ידי פירוק דנ”א חופשי המשתחרר דרך ליזה של תאים מתים במהלך עיכול אנזימטי מבלי ליזום מסלולים אפופטוטיים9 ומגביר את תפוקת התא החי36. בנוסף, אלבומין בסרום בקר (BSA) מתווסף למאגר הכביסה כדי להפחית את גושי התאים ולשפר את כדאיות התא. מספר חברות ריאגנטים מתארות BSA כמייצב אנזים. תוספת של 0.04%-1% BSA ל-PBS (מלח חוצץ פוספט) שימשה לפיתוח פתרון שטיפה להכנת מתלי ריצוף חד-תאי ללא תופעות לוואי38. תוספת של יחס נמוך של BSA יכולה לעזור לשמור על כדאיות התא ולמנוע הצטברות חופשית של תאים הנגרמת על ידי DNA עקב ליזה של תאים. פרוטוקול זה יכול גם לספק התייחסות רבת ערך לפיתוח פרוטוקולי דיסוציאציה של תאים מהמעיים של מיני דגים אחרים בחקלאות ימית.

Protocol

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים במהלך מחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת היינאן (מספר פרוטוקול: HNUAUCC-2022-00063; תאריך אישור: 2022-03-03). רשימה של הציוד והאספקה ששימשו בניסוי זה ניתן למצוא בטבלת החומרים. סיכום הפרוטוקול הנוכחי מתואר באיור 1…

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר הכנה של תרחיף חד-תאי באיכות גבוהה של מעי אמנון הנילוס לריצוף חד-תאי (איור 1). מחקר זה מראה כי לתערובת collagenase/dispase יש אפקט דיסוציאציה טוב והיא קלה לרקמת המעי. הבחירה של אנזים העיכול האופטימלי חיונית להכנת תרחיף חד תאי באיכות גבוהה. בעבודה הראשונית הושוותה יעיל?…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר הכנה של תרחיף חד תאי באיכות גבוהה של מעי אמנון הנילוס. לפני הדיסוציאציה, הסרת שומן ומזנטריה מהמעי היא הכרחית, במיוחד עבור מעיים דגים טורפים עם שומן רב. שימוש במזרק במקום גירוד קשה כדי לשטוף את תוכן המעי מפחית את הנזק המכני לתאים. כדי להבטיח את כדאיות התא, חיוני גם לשמור על הט…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להכיר בתמיכת הקרן למדעי הטבע של מחוז היינאן של סין (NO. 320QN211) ותוכנית קרן המחקר של מעבדת המפתח המחוזית של גואנגדונג לבקרת מחלות בעלי חיים ימיים ותרבות בריאה של סין (NO. PBEA2021ZD01).

Materials

0.22-μm Sterile Filter Solarbio Life Sciences SLGV033RB It is used to filter and sterilize the enzyme solution.
40-μm Cell Strainer Solarbio Life Sciences F8200 Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich SRE0098 Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 – 8 °C.
Collagenase II Sangon Biotech A004202 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Collagenase/dispase Roche 10269638-001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Dispase Sigma-Aldrich D4818 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DNase I Sigma-Aldrich AMPD1 DNase I helps reduce cell clumping.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free Solarbio Life Sciences E607009-0500 Store at room temperature.
Elastase Sangon Biotech A600438 Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044 Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.
Inverted Microscope Leica qTOWER3G It is used to examine cell viability.
Liberase Roche 5401119001 Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus) ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. NA Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). 
Phosphate-buffered saline (PBS) Solarbio Life Sciences P1020 Store at room temperature.
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5424 It is used to spin down the tissue and cell petet.
RNase inhibitor NEB M0314L Inhibit RNase activity
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent Sangon Biotech B644201-0050 It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich E10521 For fish euthanasia. 
Trypan Blue Invitrogen C0040 It is used for staining dead cells.
Trypsin Sangon Biotech E607001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.

References

  1. Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).
  2. He, H., et al. Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).
  3. Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
  4. Wen, L., Tang, F. C. Single cell epigenome sequencing technologies. Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).
  5. Xu, R., et al. Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury. Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).
  6. Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
  7. Andrews, T. S., Hemberg, M. Identifying cell populations with scRNASeq. Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).
  9. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).
  10. Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).
  11. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  12. Kumar, R., et al. Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus. FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).
  13. Schnell, S., et al. Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia. Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).
  14. Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
  15. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  16. Pan, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia. Scientific Reports. 12, 10144 (2022).
  17. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36 (2010).
  18. Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells. International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).
  19. Vrtačnik, P., Kos, &. #. 3. 5. 2. ;., Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity. Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).
  20. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
  21. Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn’s colitis model. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).
  22. Chung, M. I., et al. Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins. Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).
  23. Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
  24. Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
  25. Glass, L. L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine. Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).
  26. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
  27. Gu, W., et al. Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines. Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).
  28. Yang, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice. Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).
  29. Howard, R. B., et al. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).
  30. Pezoldt, J., et al. Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection. Communications Biology. 4 (1), 1355 (2021).
  31. Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  32. Barriga, F. M., et al. Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  33. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17 (1), 30 (2016).
  34. Chen, L., et al. Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver. Science of the Total Environment. 821, 152961 (2022).
  35. FAO. The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , (2022).
  36. Beck, B. H., Peatman, E. . Mucosal Health in Aquaculture. , (2015).
  37. Leelatian, N., et al. A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).
  38. Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 1 (3), 100144 (2020).
  39. Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae. MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).
  40. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
  41. vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  42. Avey, D., et al. Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia. Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).
  43. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).

Play Video

Cite This Article
Wang, P., Zhou, Y., Wang, B., Elaswad, A., Wang, S., Guo, W., Zhang, D. Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing. J. Vis. Exp. (192), e64688, doi:10.3791/64688 (2023).

View Video