Summary
在这里,我们提出了一种建立高效液相色谱(HPLC)的协议,结合化学指纹多模式识别,为有效鉴定铁 线莲 及其掺杂物的真正品种提供了一种新策略。
Abstract
以 铁线莲 为例,构建了中药材及其相关掺杂物的鉴别方法。采用高效液相色谱(HPLC)指纹图谱结合化学计量学方法,对10批次真品川木通品种和5批次相关掺杂物进行分析比较,包括聚类分析(CA)、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。此外,测定了β-谷甾醇的含量。建立川木通对照化学指纹图谱,鉴定出12个共同峰。10批正品川木通品种指纹与对照指纹的相似度为0.910-0.989,而5批次掺杂物的相似度仅为0.133-0.720。基于色谱图中的常见峰,将15批次样品通过PCA分为3个含量等级,并按CA归集为4类,明确区分正品川木通和川木通掺杂物。此外,通过OPLS-DA发现了7种能够有效识别川木桐正宗和川木掺杂物的差异成分。10批次纯川木通品种的β-谷甾醇含量为97.53-161.56 μg/g,而5批次掺杂物的β-谷甾醇含量差异较大,其中 铁线莲 的β-谷甾醇含量为马兹。和 铁线莲 gouriana Roxb。Var. finetii Rehd.等威尔斯。明显低于川木通正宗品种。本研究建立的HPLC指标组分含量和化学指纹多模式识别方法为有效鉴定正宗中药材及相关掺杂物提供了新的策略。
Introduction
川木通,铁线莲的干花。或铁线莲蒙大拿州Buch.-Ham.,是诊所1,2,3常用的传统中药。它用于治疗泌尿问题,水肿,舌头和口腔溃疡,乳汁分泌减少,关节僵硬和湿热引起的肌肉疼痛4。川木通一直从野生品种获得,主要分布在西南地区,尤其是四川,那里的品质最好5,6。由于正宗品种具有相似的特征,因此很难区分正宗品种及其密切相关的掺杂物7,8,9,10。2020年版《中国药典》中川木通的质量标准仅规定了性质、显微鉴别、薄层鉴定等,没有进行含量测定,不能有效鉴别掺杂物,因此存在潜在风险。此外,很少有报告比较和鉴定川木通和相关植物。因此,一种确保川木通真伪的质量控制方法值得进一步研究。
川木通的化学成分主要由桫椤类五环三萜类化合物及其糖苷、黄酮类化合物和有机酸11,12,13,14组成。其中齐墩果酸、β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇具有不同强度的利尿作用,可能是促进利尿、缓解纹尿的潜在药效学物质15,16。化学指纹图谱是通过高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)等方法分离和检测样品中所含的许多化学成分而获得的。采用适当的统计分析方法分析川木通的特性,可以确定中药的整体质量控制和科学鉴定17、18、19。
本研究共收集了10批次川木桐正宗品种和5批次掺杂物。采用HPLC指纹图谱法结合多模式识别技术对它们的质量进行比较和分析,包括聚类分析(CA)、主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-CA)和药效学成分含量测定。该方案建立了高特异性正宗品种鉴定方法,是科学鉴定中药材正宗品种和掺杂物的新策略。
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Protocol
1. 化学指纹检测方法
- 色谱条件
- 制备乙腈(A)/水(B)流动相。在HPLC软件中设置梯度程序如下:0-20分钟,3%A-10%A;20-25分钟,10%A-13%A;25-65分钟,13%A-25%A;65-75分钟,25%A-40%A;75-76分钟,40%A-3%A;76-85分钟,3%A-3%A。
- 将流动相的流速保持在1.0 mL/min。
- 在保持在30°C的C18色谱柱(250 mm x 4.6 mm,5 μm)上进行色谱分离。
- 将进样体积设置为 10 μL。
- 检测波长为 205 nm 的样品。
注:色谱条件的具体设置,请参考高效液相色谱工作软件的操作规程(材料表)。
- 样品溶液的制备
- 通过将原材料穿过内径为 850 μm ± 29 μm 的尼龙网,将原材料研磨成均匀的粒径。
- 将 2 g 研磨原料(准确称量)放入带塞子的 50 mL 锥形烧瓶中,并加入 50 mL 甲醇。将塞子放在烧瓶上并超声处理(600W,40kHz)30分钟。
- 然后,将烧瓶冷却至室温(RT)。再次称量样品,并通过更换损失的萃取剂来弥补初始重量。
- 将含有药物提取物的4 mL甲醇溶液倒入10 mL容量瓶中。加入 6 mL H2O,混合,静置 10 分钟。
- 最后,通过0.45μm滤膜过滤上清液并将其置于备用状态。
- 指纹检测方法的验证
- 如上所述制备样品(步骤1.2),并每天进行HPLC分析(步骤1.1)六次。要评估精密度,请计算相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差(RSD),如步骤1.3.5中所述。
- 通过分析在室温下储存0、2、4、6、8、12和24小时的相同样品溶液来评估样品溶液的稳定性,并计算相对保留时间和相对峰面积的RSD,如步骤1.3.5中所述。
- 取同一样品(CMT-4)的六次重复,按照上述程序(步骤1.2)制备样品溶液,并按照步骤1.1在HPLC中检测其指纹。计算相对保留时间和相对峰面积的RSD,并评估其重复性,如步骤1.3.5中所述。
- 然后使用 图1B 中的峰数10作为参考峰,并计算步骤1.3.5中所述每个常见峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。
- 使用下面提到的公式计算每个常见峰的相对保留时间和相对峰面积:
T re = T 特性/T参考
A re = A 特性/A参考
其中T re=相对保留时间,T特性=特征峰保留时间,T参比=参考峰保留时间,A re=相对峰面积,A特征=特征 峰面积,A参比=参考峰面积。
注:中药指纹图谱的建立一般需要选择易于获得且分辨率高的色谱峰。这用作鉴定指纹图谱并检查其稳定性和重现性的参考峰。
二、川木通指纹的建立及相似度分析
- 使用10批次真实样品和5批次掺杂物,如 阿根廷铁线莲 (Levl.et Vant.)W. T. Wang(CC), Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd。等威尔斯。(DC), 铁线莲 手。(德), 铁线莲古里亚纳 罗克斯布。Var. finetii Rehd.et Wils (XS), 和 Clematis finetiana Levl.等瓦尼奥特。(SMT)作为指纹分析的样品。
- 按照步骤 1.2 中所述准备示例溶液。根据步骤1.1中所述的条件,通过HPLC对所有样品溶液进行指纹图谱分析。
- 将相关数据导入中药色谱指纹相似度评价系统(中医鉴定,2012版)。系统会将所有样品色谱图中高度合理、分离度好的峰指定为常见峰。
注:SESCF-TCM软件在中国药典委员会(http://114.247.108.158:8888/login)网站上注册后即可下载。- 在软件中,单击菜单中的 设置参考光谱 按钮。
- 然后在 参数设置 窗口中,将 时间窗宽度 设置为 0.5,并选择 控制频谱生成 方法作为 中位数方法。
- 单击主菜单中的多点校准,然后选择峰值匹配作为全谱峰值匹配。
- 最后,单击“生成对照”以 生成 川木通正宗物种的参考色谱指纹图谱。
- 将10批次正宗川木通样品和5批次掺杂物的保留时间和峰面积导入SESCF-TCM进行分析。具体操作如下:
- 在软件中,单击主菜单中的 设置参考光谱 按钮。
- 在参数设置窗口中, 设置 川木通正宗物种的参比色谱指纹图谱作为参考,选择 对照谱生成 法作为 中位数法,时间 窗宽度 设置为0.5。
- 单击主菜单中的多点校准,然后选择峰值匹配作为全谱峰值匹配。
- 最后,点击计算相似度,根据川木通参比色谱图谱 计算相似度 。最后,利用中药色谱指纹评价系统(2012版)计算指纹的相似度。
注:具体操作请参考《中药色谱指纹图谱评价系统(2012版)操作规范》。
3. 川木通指纹的多模式识别分析
- 聚类分析 (CA)
- 以10批正宗川木通样品及其5批次掺杂物指纹图中12个常见峰的峰面积为变量,输入统计分析软件进行系统聚类分析(CA)。
- 选择 组间 法,以皮尔逊相关系数为分类依据,绘制川木潼及其掺杂物聚类分析图。具体操作如下:
- 在统计分析软件中,单击文件以导入数据。
- 单击菜单中的分析,然后单击分类中的系统群集。
- 选择公共峰面积作为变量,并将聚类数设置为 4。
- 单击“方法”,选择聚类 方法作为“ 组间连接”,选择测量间隔作为 “皮尔逊相关”,然后单击 “确定 ”绘制CA图。
- 主成分分析
- 将正宗品种及其掺杂物的相对共同峰面积导入分析软件进行PCA分析,利用PCA评分图评估样品差异的评分矩阵图。具体操作如下:
- 打开数据分析软件,单击菜单上的 文件 并创建一个新的常规项目。从HPLC系统导入电子表格(例如excel格式)中12个常见峰的峰面积。然后单击 完成 以完成数据导入。
- 单击“ 新建 ”创建新模型,以使用 PCA 设置模型类型。单击“ 自动调整 ”和 “添加 ”以拟合数据,然后单击“ 分数 ”以获取 PCA 分数图。
- 将正宗品种及其掺杂物的相对共同峰面积导入分析软件进行PCA分析,利用PCA评分图评估样品差异的评分矩阵图。具体操作如下:
- 正交偏最小二乘判别分析
- 采用正交偏最小二乘判别分析方法和监督模式,进一步分析正宗川木通品种和掺杂物的相对常见峰面积峰,绘制所有样品的OPLS-DA分类评分图。具体操作如下:
- 在数据分析软件中,单击菜单中的文件以导入文件并创建新的常规项目。从HPLC系统导入电子表格中12个常见峰的峰面积,然后单击完成以完成数据导入。
- 单击“ 新建 ”创建新模型,以使用 PCA 设置模型类型。单击“ 自动调整 ”和 “添加 ”以适合数据。然后点击分数获取PCA 分数 图。
- 单击“新建”,然后选择“新建”作为模型 1,以使用 OPLS-DA 设置模型类型。
- 单击缩放并使用 Par for All 设置类型。首先单击“自动调整”,然后单击“分数”以获取 OPLS-DA 分数图。
- 为了确定川木通各共同峰对其分类结果的影响以及正宗川木通材料与相关掺杂物之间的差异,请使用投影中的变量重要性(VIP)进行分析。
- 绘制川木通不同组成部分的VIP地图。使用生成的 VIP 地图来评估每个变量对分类的影响,并筛选出对组间差异有显著贡献的分量。具体操作如下:
- 在数据分析软件中,点击菜单中的分析,点击排列,将排列数设置为200,得到OPLS-DA分数图的R 2和Q2。
- 点击 VIP 并选择VIP 预测获取VIP 地图。
- 采用正交偏最小二乘判别分析方法和监督模式,进一步分析正宗川木通品种和掺杂物的相对常见峰面积峰,绘制所有样品的OPLS-DA分类评分图。具体操作如下:
4. 高效液相色谱法测定川木通β-谷甾醇
- 色谱条件(参见步骤1.1)
- 制备流动相:甲醇-水(97:3)。
- 将流动相的流速设置为1.0 mL/min。
- 在保持在30°C的C18色谱柱(250 mm x 4.6 mm,5 μm)上进行色谱分离。
- 将进样体积设置为 10 μL。
- 检测波长为 204 nm 的组件。
- 样品溶液的制备
- 通过将准确称取量的相应参比标准品溶解在甲醇中,制备β-谷甾醇(0.1 mg/mL)的储备标准溶液。
- 通过将样品穿过内径为180μm±7.6μm的尼龙网,将原材料的分析样品研磨至均匀的粒度。
- 将2g研磨原料(精确称量)放入圆底烧瓶中,并向其中加入50mL氯仿。
- 将烧瓶连接到回流冷凝器,并在沸水浴(中度沸腾)中加热60分钟。用15-20μm滤纸过滤提取溶液。
- 将滤液在沸水浴(中度沸腾)上蒸发至接近干燥约10分钟。
- 溶解残留物并使用甲醇将体积补足至 5 mL。最后,将上清液通过0.45μm滤膜,并将其置于备用状态。
- 方法验证
- 取子步骤4.2.1制备的β-谷甾醇储备溶液,用100%甲醇稀释,制备浓度为100μg/mL、80μg/mL、60μg/mL、50μg/mL、40μg/mL、30μg/mL、20μg/mL的溶液。
- 在步骤4.1所述的色谱条件下进样以确定峰面积,用峰面积与进样体积进行回归分析,得到回归方程和相关系数以评估其线性。
- 如上所述制备样品(步骤4.2),并在同一天进行HPLC分析(步骤4.1)六次。然后计算峰面积的RSD以评估精度。
- 通过分析在室温下储存0、2、4、6、8、12和24小时的相同样品溶液来评估样品溶液的稳定性,如步骤4.1中所述。然后如步骤1.3.5所述计算峰面积的RSD。
- 通过将相同的样品(CMT-4)溶解在六重液中来检查重复性,如步骤4.2中所述制备,并按照步骤4.1中所述对其进行HPLC分析。然后计算六个样品中β-谷甾醇含量的RSD。
- 通过采用标准加法评估方法的准确性。为此,向样品中加入β-谷甾醇对照溶液,含量分别为β-谷甾醇含量的80%、100%和120%,并按照步骤4.1中所述重复每个条件三次。通过计算平均回收率和RSD来评估方法的准确性。
注:回收率(RR)的计算公式如下:
RR % = [(M t - M 0) / Ms] × 100
其中M t = 加入标准品后β-谷甾醇的质量,M 0 = 样品溶液的质量,Ms = 添加β-谷甾醇的质量。
- 样品中β-谷甾醇含量的测定
- 取正宗中药材10批次,相关掺杂物5批次,按步骤4.2配制样品溶液。
- 然后注入各供试品溶液和β-谷甾醇对照品溶液,测定步骤4.1所述条件下的峰面积,并用外标单点法计算各供试品的β-谷甾醇含量。
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Representative Results
川木通色谱指纹图谱及相似度分析(SA)
精密度、重复性和稳定性相对保留时间的RSD值分别低于0.46%、1.65%和0.53%;相对峰面积的RSD值分别低于4.23%、3.56%和3.96%。 如图1A,B所示,10份真品川木通样品的HPLC指纹图中有12个不同的共同峰(从峰1到峰12)。由于10号峰面积比较大,分辨率较好;由于它是每个样品中存在的组分,因此将其用作参考峰来研究指纹图谱的稳定性和重现性。然后以10号峰为参比峰(S),计算其余11个峰的相对保留时间。
在相似性分析中,相关系数越接近1,样本之间的相似度越高。 如表1所示,10批川木通的相似度为0.910-0.989。这些结果表明,10个批次川木通具有较高的相似度和良好的一致性,可用于评价川木通的整体品质。如图 1C所示,获得了五批掺杂物的指纹图谱。5批掺杂物指纹图谱与川木通对照指纹相似度仅为0.133-0.720(表1),说明正品样品与相关掺杂物存在明显差异。差异主要集中在色谱图28-55 min时的色谱峰数上。因此,川木通的对照指纹可以有效地区分真实样品和相关掺杂物。
本实验使用SPSS 26统计软件进行CA分析(图2A);分类距离为20时,将15批次样品分为两类。第一类是10批次川木掺杂物及其惯用掺杂物(CC)。第二类是川木通的掺杂物,包括DC、DE、XS和SMT。 当分类距离为四时,所有样品分为四类。第一类是10批川木通,第二类是CC,第三类是SMT和XS,第四类是DC和DE。分类结果表明,川木通正宗品种品质基本相同,与所有掺杂物均有明显差异。同时,与其他掺杂物相比,CC更接近川木通的正宗品种,但分类距离缩小后仍能区分。
将15批次样品的共同峰面积导入数据分析软件进行PCA分析,评分矩阵(R 2 x = 0.994,Q2 = 0.961)(图2B)显示15批次样品的聚类效应明显。Y轴右侧是10批川木通和CC。其中,CC位于第一象限,与川木通的正宗品种不同。Y轴的左侧是掺杂物,包括SMT,XS,DE和DC。其中,SMT和XS位于第二象限,DE和DC位于第三象限。在比较川木通正宗品种和常规掺杂物时,CC和正宗品种的差异相对较小,而正宗与其他掺杂物的差异是明显的。
以川木通及其掺杂物的共同峰面积为变量,导入OPLS-DA数据分析软件,绘制评分矩阵(图3A)。OPLS-DA模型的R 2 x [1]为0.695,R 2 x [2]为0.605,均大于0.5,表明该模型稳定可靠,可用于区分正品样品和掺杂物。
从 图3A 可以看出,正品和其他掺杂物的样品点是完全分离的,样品点之间没有交集。所有样品分为三个部分。川木桐和CC的正宗品种相似。XS、DC 和 DE 的样本被分组到一类中,SMT 的样本是最后一类。此外,采用投影中可变重要性的判断方法(VIP)(图3B)筛选每个样品指纹图中不同组分的峰。以VIP>1.0为标准筛选出对样本组间分类有较大贡献的seveb变量。根据筛选结果,造成真品样品与掺杂物成分差异的主要标志物成分为9号峰、5号峰、7号峰、6号峰、10号峰、3号峰和2号峰。其余峰的VIP值小于1,对样本的判别影响不大。
采用回归分析法发现β-谷甾醇峰面积与其溶液浓度之间的线性关系。这种依赖性遵循方程 Y = 5.4918 X-4.5563,其中 Y 是 β-谷甾醇峰面积,X 是以 μg/mL 为单位的β-谷甾醇含量。同时,相关系数r=0.9995,符合要求。精密度试验、稳定性试验和重复性试验的RSD分别为1.76%、4.22%和3.85%。结果表明,β-谷甾醇含量测定方法具有良好的线性、精密度和重复性,供试液在24 h内稳定。3个水平的平均回收率分别为101.50%、101.90%和100.72%;相应的RSD分别为2.56%、1.56%和1.68%。理论值和实际确定值之间的良好一致性证实了分析方法的准确性和适用性。β-谷甾醇的液相色谱图如图4所示,测定了15批次样品中β-谷甾醇的含量(表2)。结果表明,10批次正品样品中β-谷甾醇浓度在97.53-161.56 μg/g范围内(相对稳定)。在所有五批掺杂物中均检测到该成分,但含量差异很大。
图1:川木通及其掺杂物 的指纹。 (A) 10批正宗川木通样本的指纹(S1:CMT-1、S2:CMT-2、S3:CMT-3、S4:CMT-4、S5:CMT-5、S6:CMT-6、S7:CMT-7、S8:CMT-8、S9:CMT-9、S10:CMT-10)。(二)川木通正宗样品的参比色谱图谱图谱;相对保留时间为0.18(峰1)、0.22(峰2)、0.29(峰3)、0.72(峰4)、0.75(峰5)、0.82(峰6)、0.86(峰7)、0.92(峰8)、0.96(峰9)、1.00(峰10)、1.02(峰11)、1.37(峰12)。(三)五批川木通掺杂物的指纹图谱(S1:CC、S2:DC、S3:DE、S4:XS、S5:SMT)。(四)正宗川木通样品参比色谱图谱与其5批掺杂物(S1:参比色谱指纹图谱、S2:CC、S3:DC、S4:DE、S5:XS、S6:SMT)的比较。 请点击此处查看此图的大图。
图2:10批次正宗川木通样品和5批次掺杂物的CA和PCA 分析。 (A)CA分析。(B) PCA分析。 请点击此处查看此图的大图。
图3:10批次正宗川木通样品和5批次掺杂物的OPLS-DA评分图和VIP评分图。 (A) OPLS-DA评分图。(二)贵宾评分图。请点击此处查看此图的大图。
图4:β-谷甾醇的液相色谱图。 S1:β-谷甾醇,S2:CMT-4,S3:XS,S4:DC,S5:SMT,S6:CC,S7:DE。 请点击此处查看此图的大图。
样品 | 名字 | 相似 |
川木通正宗品种 | CMT-1 | 0.947 |
CMT-2 | 0.910 | |
CMT-3 | 0.989 | |
CMT-4 | 0.937 | |
CMT-5 | 0.989 | |
CMT-6 | 0.988 | |
CMT-7 | 0.956 | |
CMT-8 | 0.959 | |
CMT-9 | 0.939 | |
CMT-10 | 0.966 | |
掺杂物 | 抄送 | 0.599 |
直流 | 0.720 | |
德 | 0.133 | |
XS时 | 0.694 | |
贴片 | 0.180 |
表1:10批次正宗川木桐样品及其掺杂物的相似性结果。 通过将相关数据导入中药色谱指纹图谱评价系统,计算出10批次正品川木通样品和5批次掺杂物的相似性。
样品 | 名字 | 含量(微克/克) |
川木通正宗品种 | CMT-1 | 103.5 |
CMT-2 | 124.6 | |
CMT-3 | 131 | |
CMT-4 | 121.1 | |
CMT-5 | 97.5 | |
CMT-6 | 113.8 | |
CMT-7 | 105.6 | |
CMT-8 | 161.6 | |
CMT-9 | 118 | |
CMT-10 | 123.5 | |
掺杂物 | 抄送 | 157.4 |
直流 | 165.6 | |
德 | 32.9 | |
XS时 | 69.7 | |
贴片 | 192.2 |
表2:川木通正品样品中β-谷甾醇含量及其掺杂物的测定结果。
附图1:不同样品制备条件和不同色谱条件下的液相色谱。 (A)流动相体系(S1:乙腈-0.1%甲酸溶液,S2:乙腈-0.5%乙酸溶液,S3:乙腈纯水,S4:乙腈-0.05%磷酸溶液,S5:甲醇纯水)。(B)检测波长(S1:205纳米,S2:230纳米,S3:250纳米,S4:300纳米)。(C)柱温(S1:20°C,S2:30°C,S3:40°C)。(D) 流速(S1:0.8毫升/分钟,S2:0.9毫升/分钟,S3:1.0毫升/分钟)。(五)提取方法(S1:超声提取,S2:回流提取)。(六)萃取溶剂(S1:乙酸乙酯,S2:乙醇,S3:氯仿,S4:正丁醇,S5:甲醇)。(G)提取时间(S1:15分钟,S2:30分钟,S3:60分钟)。 请点击此处下载此文件。
补充图2:麦角甾醇、豆甾醇和正宗川木通的液相色谱图。 S1:豆甾醇,S2:麦角甾醇,S3:CMT-4。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
用于研究的样本采集是构建多模式识别识别中药材真伪的第一步。通过市场调研,我们发现四川雅安、凉山、乐山是川木通野生资源的主要产区。同一属的相关品种也具有相同的地理分布6,20;CC、DC、DE、XS和SMT经常被误用为创木通16,21;因此,本研究在上述产地采集了10批次正宗川木桐和5批次混合样品,并确认了品种的准确性。
第二个关键步骤是筛选HPLC指纹的检测条件,它可以显示尽可能多的化学成分信息。本研究附 图1所示,在不同制备条件下获得色谱峰的数量和面积,包括萃取方法、萃取溶剂和萃取时间。确定了川木通样品溶液的最佳制备方法。另一方面,比较了不同色谱条件下样品色谱峰的数量和分离度。流动相系统,如乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.5%乙酸溶液、乙腈纯水、乙腈-0.05%磷酸溶液和甲醇纯水,检测波长如205 nm、230 nm、250 nm和300 nm,柱温,如20°C、30 °C和40 °C,流速,如0.8-1.0 mL/min, 被调查。确定了川木通样品分析的最佳色谱条件。方法论验证了其可行性,成功构建了川木通HPLC指纹图谱检测方法。
第三个关键步骤是分析和发现正宗中药及其掺杂物指纹中的不同信息。本研究首先采用SESCF-TCM(2012版)分析指纹的相似性。结果发现,10批次正品川木通样品指纹与对照特征指纹的相似度极高。相比之下,5批掺杂物指纹与对照特征指纹的相似性显著低于真实样品。然后进一步引入CA、PCA和OPLS-DA分析化学指纹图谱的共同峰信息。CA和PCA结果表明,不同掺杂物中常用的掺杂物CC相对接近真实CC,难以区分。但是,当CA的分类距离修改为4时,可以实现真品和掺杂物之间的有效识别。基于真品材料的12个常见峰,采用OPLS-DA定量评价掺杂物差异峰的贡献值,得到7个差相色谱峰,即9号峰、5号峰、7号峰、6号峰、10号峰、3号峰和2号峰。这些都可以用来有效鉴别川木通的真假材料,是真假鉴别真伪和掺假的主要标志成分。
最新版的《中国药典》尚未包括川木通有效成分的含量测定。为了提高其质量控制,本研究在以前的报道中研究了与利尿作用相关的活性成分如β-谷甾醇、麦角甾醇、谷甾醇和齐墩果酸的含量测定方法22,23,24,25,26。如附图2所示,麦角甾醇在正宗川木通中未检出,柱甾醇在色谱图中难以分离,无法准确定量。最后,建立了β-谷甾醇含量测定方法;检测结果显示,在10批正品川木通样品和5批次掺杂物中检出β-谷甾醇。因此,β-谷甾醇并非真正的药材所独有。虽然可以提供一些关于川木通质量的信息,但今后仍需进一步分析指纹图中的差异色谱峰,看看能否找到与川木通疗效相关的具体成分。
目前,中药往往通过化学指纹谱的相似性来识别。然而,该指标是基于样品色谱峰总体信息的参数,无法提供更多关于不同样品的鉴定和主要差异的信息。因此,本研究进一步采用CA、PCA和OPLS-DA鉴定化学指纹图谱的共峰信息,找出川木通真品与掺假样品的主要差异色谱峰,并成功鉴定。最后,构建了用于多模式识别的HPLC耦合化学指纹图谱。
由于将正宗中药材及其掺杂物(如楸树、香草杖和粳稻)混合使用的情况并不少见,该方法将为明确、科学地鉴定正宗中药材及其掺杂物提供新的策略。这一策略对于保证中药材在临床应用中的质量具有重要意义。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了四川省中医药管理局项目(编号:2020JC0088,编号:2021MS203)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Acetic acid | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017381038 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD5243V | |
β-Sitosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
C18 column | Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China | Welch Ultimate LP | |
Chuanmutong | Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 19020103 | CMT-1 |
Chuanmutong | Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-2 |
Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-3 |
Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-4 |
Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210701 | CMT-5 |
Chuanmutong | Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210401 | CMT-6 |
Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-7 |
Chuanmutong | Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China | 201201 | CMT-8 |
Chuanmutong | Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 201001 | CMT-9 |
Chuanmutong | Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210501 | CMT-10 |
Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang | Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China | - | CC |
Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. | Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China | - | DC |
Clematis peterae Hand.-Mazz. | Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China | - | DE |
Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils | Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | XS |
Clematis finetiana Levl. et Vaniot. | Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | SMT |
Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
Ergosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China | 20210201 | |
Ethanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2021112602 | |
Ethyl acetate | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017042043 | |
Formic acid | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2016062901 | |
High performance liquid chromatography | Agilent, USA. | 1260 | |
IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
Methanol | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD6409V | |
Methanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 202010302 | |
n-butyl alcohol | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020071047 | |
Petroleum ether | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020090125 | |
Phosphoric acid | Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 20200110 | |
SESCF-TCM version 2012 | National Pharmacopoeia Commission, China | - | http://114.247.108.158:8888/login |
Stigmasterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
Trichloromethane | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China | 20200214 | |
Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 | Umetrics, Sweden | - | https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download |
Ultrapure water machine | Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China | UPH-II-10T | |
Ultrasonic cleaner | Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China | KH3200E |
References
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