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Chemistry

HPLC gekoppelt mit chemischem Fingerabdruck zur Multimustererkennung zur Identifizierung der Authentizität von Clematidis armandii caulis

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64690
* These authors contributed equally

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in Verbindung mit der Multimustererkennung des chemischen Fingerabdrucks vor, das eine neue Strategie zur effektiven Identifizierung der echten Sorten von Clematidis Armandii Caulis und seiner Verfälschungsmittel bietet.

Abstract

Eine Methode zur Identifizierung chinesischer Arzneimittel und ihrer verwandten Verfälschungsmittel wurde am Beispiel von Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, einer universell verwendeten traditionellen chinesischen Medizin) entwickelt. Zehn Chargen echter Chuanmutong-Sorten und fünf Chargen verwandter Verfälschungsmittel wurden analysiert und verglichen, basierend auf den Fingerabdrücken der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in Kombination mit Chemometrie, einschließlich Clusteranalyse (CA), Hauptkomponentenanalyse (PCA) und orthogonaler partieller Diskriminierungsanalyse der kleinsten Quadrate (OPLS-DA). Zusätzlich wurde der Gehalt an β-Sitosterol bestimmt. Der chemische Kontrollfingerabdruck von Chuanmutong wurde ermittelt und 12 gemeinsame Spitzen identifiziert. Die Ähnlichkeit zwischen dem Fingerabdruck von 10 Chargen echter Chuanmutong-Sorten und dem Kontrollfingerabdruck betrug 0,910-0,989, während die Ähnlichkeit von fünf Chargen von Verfälschungsmitteln nur 0,133-0,720 betrug. Basierend auf den gemeinsamen Peaks im Chromatogramm wurden 15 Probenchargen von PCA in drei Gehaltsstufen eingeteilt und von CA in vier Kategorien aggregiert, wodurch eine klare Unterscheidung zwischen authentischem Chuanmutong und Verfälschungsmitteln von Chuanmutong erreicht wurde. Darüber hinaus wurden sieben differentielle Komponenten, die authentisches Chuanmutong und Verfälschungsmittel von Chuanmutong effektiv identifizieren können, durch OPLS-DA gefunden. Der β-Sitosterin-Gehalt von 10 Chargen echter Chuanmutong-Sorten betrug 97,53-161,56 μg/g, während der β-Sitosterin-Gehalt der fünf Chargen von Verfälschungsmitteln stark variierte, darunter der β-Sitosterin-Gehalt von Clematis peterae Hand.-Mazz. und Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils. war deutlich niedriger als die authentischen Sorten von Chuanmutong. Der Inhalt der HPLC-Indexkomponente und die in dieser Studie etablierte Methode zur Erkennung chemischer Fingerabdrücke mit mehreren Mustern bieten eine neue Strategie zur effektiven Identifizierung authentischer chinesischer Arzneimittel und verwandter Verfälschungsmittel.

Introduction

Chuanmutong, trockener Caulis von Clematis armandii Franch. oder Clematis montana Buch.-Ham., ist eine traditionelle chinesische Medizin, die häufig in den Kliniken 1,2,3 verwendet wird. Es wird zur Behandlung von Harnproblemen, Ödemen, Wunden an Zunge und Mund, verminderter Milchsekretion, Gelenksteifigkeit und Muskelschmerzen durch feuchte Hitze verwendet4. Chuanmutong wurde schon immer aus wilden Sorten gewonnen, die hauptsächlich im Südwesten Chinas verbreitet sind, insbesondere in Sichuan, wo die beste Qualität zu finden ist 5,6. Es ist schwierig, zwischen authentischen Sorten und ihren eng verwandten Verfälschungsmitteln zu unterscheiden, da sie ähnliche Eigenschaften 7,8,9,10 aufweisen. Der Qualitätsstandard von Chuanmutong in der Ausgabe 2020 des chinesischen Arzneibuchs legt nur die Eigenschaften, die mikroskopische Identifizierung und die Dünnschichtidentifizierung ohne Inhaltsbestimmung fest, die Verfälschungsmittel nicht effektiv identifizieren können und daher potenzielle Risiken birgt. Darüber hinaus gibt es nur wenige Berichte, die Chuanmutong und verwandte Pflanzen vergleichen und identifizieren. Folglich ist eine Qualitätskontrollmethode, um die Authentizität von Chuanmutong sicherzustellen, eine weitere Untersuchung wert.

Die chemischen Bestandteile von Chuanmutong bestehen hauptsächlich aus pentacyclischen Triterpenoiden vom Oleanan-Typ und ihren Glykosiden, Flavonoiden und organischen Säuren11,12,13,14. Unter ihnen haben Oleanolsäure, β-Sitosterin, Stigmasterol und Ergosterol harntreibende Wirkungen unterschiedlicher Intensität, die potenzielle pharmakodynamische Substanzen zur Förderung der Diurese und Linderung der Strangurie sein können15,16. Chemische Fingerabdrücke werden durch Trennung und Detektion vieler chemischer Komponenten, die in Proben enthalten sind, durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Gaschromatographie (GC) usw. erhalten. Die Anwendung geeigneter statistischer Analysemethoden zur Analyse der Eigenschaften von Chuanmutong kann die allgemeine Qualitätskontrolle und wissenschaftliche Identifizierung der traditionellen chinesischen Medizinbestimmen 17,18,19.

In dieser Studie wurden 10 Chargen authentischer Chuanmutong-Sorten und fünf Chargen von Verfälschungsmitteln gesammelt. Ihre Qualität wurde durch die HPLC-Fingerabdruckmethode in Kombination mit Multi-Pattern-Erkennung verglichen und analysiert, einschließlich Clusteranalyse (CA), Hauptkomponentenanalyse (PCA), orthogonale partielle Least-Squares-Diskriminierungsanalyse (OPLS-CA) und Inhaltsbestimmung der pharmakodynamischen Komponente. Dieses Protokoll legt eine Methode zur Identifizierung authentischer Sorten mit hoher Spezifität fest, eine neue Strategie für die wissenschaftliche Identifizierung authentischer Sorten und Verfälschungsmittel chinesischer Arzneimittel.

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Protocol

1. Methoden zur Detektion chemischer Fingerabdrücke

  1. Chromatographische Bedingungen
    1. Bereiten Sie die mobile Phase Acetonitril (A)/Wasser (B) vor. Stellen Sie in der HPLC-Software ein Gradientenprogramm wie folgt ein: 0-20 min, 3%A-10%A; 20-25 min, 10%A-13%A; 25-65 min, 13%A-25%A; 65-75 min, 25%A-40%A; 75-76 min, 40%A-3%A; 76-85 min, 3%A-3%A.
    2. Halten Sie die Durchflussrate der mobilen Phase bei 1,0 ml/min.
    3. Die chromatographische Trennung wird auf einer C18-Säule (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) bei 30 °C durchgeführt.
    4. Stellen Sie das Injektionsvolumen auf 10 μL ein.
    5. Detektieren Sie die Proben bei einer Wellenlänge von 205 nm.
      HINWEIS: Die spezifischen Einstellungen der chromatographischen Bedingungen finden Sie in den Arbeitsverfahren der Arbeitssoftware der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Table of Materials).
  2. Vorbereitung der Probenlösung
    1. Mahlen Sie die Rohstoffe auf eine gleichmäßige Partikelgröße, indem Sie sie durch ein Nylonnetz mit einem Innendurchmesser von 850 μm ± 29 μm leiten.
    2. 2 g des gemahlenen Rohmaterials (genau gewogen) in einen 50-ml-Konikenkolben mit einem Stopfen geben und 50 ml Methanol hinzufügen. Setzen Sie den Stopfen auf den Kolben und ultraschallen Sie (600 W, 40 kHz) für 30 min.
    3. Anschließend kühlen Sie den Kolben auf Raumtemperatur (RT) ab. Wiegen Sie die Proben erneut und gleichen Sie das Ausgangsgewicht aus, indem Sie das verlorene Extraktionsmittel ersetzen.
    4. Gießen Sie 4 mL der Methanollösung, die die medizinischen Extrakte enthält, in einen 10-ml-Messkolben. 6 mlH2Ohinzufügen, mischen und 10 min einwirken lassen.
    5. Zum Schluss filtrieren Sie den Überstand durch eine 0,45 μm Filtermembran und versetzen ihn in den Standby-Modus.
  3. Validierung von Fingerabdruckerkennungsmethoden
    1. Bereiten Sie die Probe wie oben beschrieben vor (Schritt 1.2) und unterziehen Sie sie sechsmal täglich einer HPLC-Analyse (Schritt 1.1). Um die Genauigkeit zu bewerten, berechnen Sie die relative Standardabweichung (RSD) der relativen Retentionszeit und der relativen Spitzenflächen, wie in Schritt 1.3.5 beschrieben.
    2. Bewerten Sie die Stabilität der Probenlösung, indem Sie dieselbe Probenlösung analysieren, die bei RT für 0, 2, 4, 6, 8, 12 und 24 h gelagert wurde, und berechnen Sie die RSD der relativen Retentionszeit und der relativen Peakflächen, wie in Schritt 1.3.5 beschrieben.
    3. Nehmen Sie sechs Replikate derselben Probe (CMT-4), bereiten Sie die Probenlösung gemäß dem obigen Verfahren vor (Schritt 1.2) und erkennen Sie ihren Fingerabdruck in der HPLC nach Schritt 1.1. Berechnen Sie den RSD der relativen Retentionszeit und der relativen Spitzenbereiche und bewerten Sie seine Wiederholbarkeit wie in Schritt 1.3.5 beschrieben.
    4. Verwenden Sie dann den Peak Nummer 10 in Abbildung 1B als Referenzpeak und berechnen Sie den RSD der relativen Retentionszeit und der relativen Peakfläche jedes gemeinsamen Peaks, wie in Schritt 1.3.5 beschrieben.
    5. Verwenden Sie die unten aufgeführten Formeln, um die relative Retentionszeit und die relative Spitzenfläche jedes gemeinsamen Peaks zu berechnen:
      T re = T-Kennlinie/TReferenz
      A re = EinMerkmal/A-Referenz

      Dabei ist T re = relative Retentionszeit, T-Merkmal = charakteristische Peak-Retentionszeit, T-Referenz = Referenz-Peak-Retentionszeit, A re = relative Peak-Fläche, A-Merkmal = charakteristische Peakfläche und AReferenz = Referenz-Peak-Fläche.
      HINWEIS: Die Etablierung von Fingerabdrücken der traditionellen chinesischen Medizin erfordert im Allgemeinen die Auswahl eines chromatographischen Peaks, der leicht zu erhalten ist und eine hohe Auflösung aufweist. Dieser dient als Referenzpeak, um die Fingerabdrücke zu identifizieren und auf ihre Stabilität und Reproduzierbarkeit zu untersuchen.

2. Etablierung der Chuanmutong-Fingerabdruck- und Ähnlichkeitsanalyse

  1. Verwenden Sie 10 Chargen authentischer Proben und fünf Chargen Verfälschungsmittel wie Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang (CC), Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. (DC), Clematis peterae Hand.-Mazz. (DE), Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils (XS) und Clematis finetiana Levl. et Vaniot. (SMT) als Proben für die Fingerabdruckanalyse.
  2. Bereiten Sie die Beispiellösungen wie in Schritt 1.2 beschrieben vor. Führen Sie eine Fingerabdruckanalyse aller Probenlösungen mittels HPLC gemäß den in Schritt 1.1 beschriebenen Bedingungen durch.
  3. Import der relevanten Daten in das Ähnlichkeitsbewertungssystem chromatographischer Fingerabdrücke der traditionellen chinesischen Medizin (SESCF-TCM, Version 2012). Das System bezeichnet die Peaks mit angemessener Höhe und guter Auflösung in den Chromatogrammen aller Proben als gemeinsame Peaks.
    HINWEIS: Die SESCF-TCM-Software kann nach Registrierung auf der Website der Chinese Pharmacopoeia Commission (http://114.247.108.158:8888/login) heruntergeladen werden.
    1. Klicken Sie in der Software im Menü auf die Schaltfläche Referenzspektrum festlegen .
    2. Legen Sie dann im Fenster Parametereinstellungen die Breite des Zeitfensters auf 0,5 fest und wählen Sie Steuerspektrumgenerierungsmethode als Medianmethode aus.
    3. Klicken Sie im Hauptmenü auf Multi-Point-Kalibrierung und wählen Sie dann Peak Matching als Full Spectrum Peak Matching.
    4. Klicken Sie abschließend auf Kontrolle generieren, um den chromatographischen Referenzfingerabdruck der authentischen Art von Chuanmutong zu generieren .
  4. Importieren Sie die Verweilzeit und den Spitzenbereich von 10 Chargen authentischer Chuanmutong-Proben und fünf Chargen von Verfälschungsmitteln zur Analyse in SESCF-TCM. Die spezifischen Operationen sind wie folgt:
    1. Klicken Sie in der Software im Hauptmenü auf die Schaltfläche Referenzspektrum einstellen .
    2. Legen Sie im Fenster Parametereinstellungen den chromatographischen Referenzfingerabdruck der authentischen Chuanmutong-Art als Referenz fest, wählen Sie die Control Spectrum Generation Method als Medianmethode und legen Sie die Zeitfensterbreite auf 0,5 fest.
    3. Klicken Sie im Hauptmenü auf Multi-Point-Kalibrierung und wählen Sie dann Peak Matching als Full Spectrum Peak Matching.
    4. Klicken Sie abschließend auf Ähnlichkeit berechnen, um die Ähnlichkeit basierend auf den Referenzchromatogramm-Fingerabdrücken von Chuanmutong zu berechnen. Berechnen Sie schließlich die Ähnlichkeit der Fingerabdrücke mit dem Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Evaluation System (Version 2012).
      HINWEIS: Informationen zu den spezifischen Operationen finden Sie in den Betriebsspezifikationen für das Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Evaluation System (Version 2012).

3. Multi-Muster-Erkennungsanalyse des Chuanmutong-Fingerabdrucks

  1. Clusteranalyse (CA)
    1. Verwenden Sie die Spitzenbereiche von 12 gemeinsamen Peaks in den Fingerabdrücken von 10 Chargen authentischer Chuanmutong-Proben und ihrer fünf Chargen von Verfälschungsmitteln als Variablen und geben Sie sie in statistische Analysesoftware für die systematische Clusteranalyse (CA) ein.
    2. Wählen Sie die Between-Groups-Methode und verwenden Sie den Pearson-Korrelationskoeffizienten als Klassifizierungsgrundlage, um ein Clusteranalysediagramm von Chuanmutong und seinen Verfälschungsmitteln zu zeichnen. Die spezifischen Operationen sind wie folgt:
      1. Klicken Sie in der statistischen Analysesoftware auf Datei, um Daten zu importieren.
      2. Klicken Sie im Menü auf Analyse und dann auf System-Clustering in Klassifizierung.
      3. Wählen Sie den gemeinsamen Spitzenbereich als Variable aus und legen Sie die Anzahl der Cluster auf vier fest.
      4. Klicken Sie auf Methode, wählen Sie die Clustering-Methode als Inter-Group Connection aus, wählen Sie das Messintervall als Pearson-Korrelation aus und klicken Sie auf OK, um die CA-Karte zu zeichnen.
  2. Hauptkomponentenanalyse (PCA)
    1. Importieren Sie die relative gemeinsame Peakfläche der authentischen Sorten und ihrer Verfälschungsmittel in die Analysesoftware für die PCA-Analyse und verwenden Sie die PCA-Score-Map, um die Score-Matrix-Karte der Stichprobenunterschiede auszuwerten. Die spezifischen Operationen sind wie folgt:
      1. Öffnen Sie die Datenanalysesoftware, klicken Sie im Menü auf Datei und erstellen Sie ein neues reguläres Projekt. Importieren Sie den Peakbereich von 12 gemeinsamen Peaks in eine Tabelle (z. B. Excel-Format) aus dem HPLC-System. Klicken Sie dann auf Fertig stellen , um den Datenimport abzuschließen.
      2. Klicken Sie auf Neu , um ein neues Modell zu erstellen, um den Modelltyp mit PCA festzulegen. Klicken Sie auf Autofit und Hinzufügen , um die Daten anzupassen, und klicken Sie dann auf Scores , um die PCA-Score-Map zu erhalten.
  3. Orthogonale partielle Least-Squares-Diskriminierungsanalyse (OPLS-DA)
    1. Verwenden Sie die Orthogonal partial least-squares discrimination analysis method with supervision mode, um die relativen gemeinsamen Peak-Area-Peaks der authentischen Chuanmutong-Sorten und Verfälschungsmittel weiter zu analysieren und eine OPLS-DA-Klassifizierungs-Score-Map aller Proben zu zeichnen. Die spezifischen Operationen sind wie folgt:
      1. Klicken Sie in der Datenanalysesoftware im Menü auf Datei, um eine Datei zu importieren und ein neues reguläres Projekt zu erstellen. Importieren Sie den Spitzenbereich von 12 gemeinsamen Spitzen in einer Tabelle aus dem HPLC-System und klicken Sie dann auf Fertig stellen , um den Datenimport abzuschließen.
      2. Klicken Sie auf Neu , um ein neues Modell zu erstellen, um den Modelltyp mit PCA festzulegen. Klicken Sie auf Autofit und Hinzufügen , um die Daten anzupassen. Klicken Sie dann auf Scores , um die PCA-Score-Map zu erhalten.
      3. Klicken Sie auf Neu und wählen Sie Neu als Modell Eins, um den Modelltyp mit OPLS-DA einzustellen.
      4. Klicken Sie auf Skalieren und setzen Sie den Typ mit Par für alle. Klicken Sie zuerst auf Autofit und dann auf Scores , um die OPLS-DA-Score-Map zu erhalten.
    2. Um den Einfluss jedes gemeinsamen Peaks in Chuanmutong auf seine Klassifizierungsergebnisse und den Unterschied zwischen authentischen Chuanmutong-Materialien und verwandten Verfälschungsmitteln zu bestimmen, verwenden Sie die variable Wichtigkeit in der Projektion (VIP) für die Analyse.
    3. Zeichne die VIP-Karte der verschiedenen Komponenten von Chuanmutong. Verwenden Sie die resultierende VIP-Karte, um die Auswirkungen jeder Variablen auf die Klassifizierung zu bewerten und Komponenten auszusortieren, die wesentlich zu den Unterschieden zwischen Gruppen beitragen. Die spezifischen Operationen sind wie folgt:
      1. Klicken Sie in der Datenanalysesoftware im Menü auf Analyse und klicken Sie auf Permutationen, setzen Sie die Anzahl der Permutationen auf 200 und erhalten Sie die R 2 und Q2 der OPLS-DA-Score-Map.
      2. Klicken Sie auf VIP und wählen Sie VIP Predictive, um die VIP-Karte zu erhalten.

4. Bestimmung von β-Sitosterol in Chuanmutong mittels HPLC

  1. Chromatographische Bedingungen (siehe Schritt 1.1)
    1. Bereiten Sie die mobile Phase vor: Methanol-Wasser (97:3).
    2. Stellen Sie die Durchflussrate der mobilen Phase auf 1,0 ml/min ein.
    3. Die chromatographische Trennung wird auf einer C18-Säule (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) bei 30 °C durchgeführt.
    4. Stellen Sie das Injektionsvolumen auf 10 μL ein.
    5. Detektieren Sie das Bauteil bei einer Wellenlänge von 204 nm.
  2. Vorbereitung der Probenlösung
    1. Die Standardlösung von β-Sitosterol (0,1 mg/ml) wird durch Auflösen einer genau gewogenen Menge des entsprechenden Referenzstandards in Methanol hergestellt.
    2. Die Analyseprobe des Rohmaterials wird auf eine gleichmäßige Partikelgröße gemahlen, indem die Probe durch das Nylonnetz mit einem Innendurchmesser von 180 μm ± 7,6 μm geleitet wird.
    3. 2 g des gemahlenen Rohmaterials (genau gewogen) in einen Rundkolben geben und 50 ml Chloroform hinzufügen.
    4. Schließen Sie den Kolben an einen Rückflusskondensator an und erhitzen Sie ihn in einem Siedewasserbad (mäßiges Kochen) für 60 min. Filtern Sie die Extraktionslösung mit einem 15-20 μm Filterpapier.
    5. Das Filtrat wird in einem kochenden Wasserbad (mäßiges Kochen) ca. 10 min bis zur Trockne eingedampft.
    6. Der Rückstand wird gelöst und das Volumen mit Methanol auf 5 ml aufgefüllt. Zum Schluss wird der Überstand durch eine 0,45 μm Filtermembran geleitet und in den Standby-Modus versetzt.
  3. Methodenvalidierung
    1. Man nimmt die in Unterschritt 4.2.1 hergestellte Stammlösung von β-Sitosterol, verdünnt sie mit 100%igem Methanol und stellt Lösungen mit Konzentrationen von 100 μg/ml, 80 μg/ml, 60 μg/ml, 50 μg/ml, 40 μg/ml, 30 μg/ml und 20 μg/ml her.
    2. Injizieren Sie die Proben unter den in Schritt 4.1 beschriebenen chromatographischen Bedingungen, um die Peakfläche zu bestimmen, führen Sie eine Regressionsanalyse mit der Peakfläche zum Injektionsvolumen durch und erhalten Sie die Regressionsgleichung und den Korrelationskoeffizienten, um seine Linearität zu bewerten.
    3. Bereiten Sie die Proben wie oben beschrieben vor (Schritt 4.2) und unterziehen Sie sie am selben Tag sechsmal einer HPLC-Analyse (Schritt 4.1). Berechnen Sie dann die RSD der Spitzenbereiche, um die Genauigkeit zu bewerten.
    4. Bewerten Sie die Stabilität der Probenlösung, indem Sie dieselben Probenlösungen analysieren, die bei RT für 0, 2, 4, 6, 8, 12 und 24 h gespeichert sind, wie in Schritt 4.1 beschrieben. Berechnen Sie dann die RSD der Spitzenbereiche wie in Schritt 1.3.5 beschrieben.
    5. Die Wiederholbarkeit wird untersucht, indem dieselbe Probe (CMT-4) in Hextuplikat aufgelöst wird, die wie in Schritt 4.2 beschrieben hergestellt wurde, und einer HPLC-Analyse gemäß Schritt 4.1 unterzogen wird. Berechnen Sie dann die RSD des β-Sitosterolgehalts in sechs Proben.
    6. Bewerten Sie die Genauigkeit der Methode mithilfe der Standardadditionsmethode. Dazu fügen Sie den Proben β-Sitosterol-Referenzlösungen bei 80%, 100% und 120% des β-Sitosteringehalts hinzu und wiederholen Sie jede Bedingung dreimal, wie in Schritt 4.1 beschrieben. Bewerten Sie die Genauigkeit der Methode, indem Sie die durchschnittliche Wiederfindung und RSD berechnen.
      HINWEIS: Die Berechnungsformel für die Rückgewinnungsrate (RR) lautet wie folgt:
      RR % = [(M t - M 0) / Ms] × 100
      Dabei ist M t = die Qualität von β-Sitosterin nach Zugabe des Standards, M 0 = die Qualität der Probenlösung und Ms = die Qualität des β-Sitosterols.
  4. Bestimmung des β-Sitosteringehalts von Proben
    1. Nehmen Sie 10 Chargen authentischer chinesischer Arzneimittel und fünf Chargen verwandter Verfälschungsmittel, um Probenlösungen gemäß Schritt 4.2 herzustellen.
    2. Dann wird jede Probenlösung und β-Sitosterol-Referenzlösung injiziert, um die Peakfläche unter den in Schritt 4.1 beschriebenen Bedingungen zu bestimmen, und der β-Sitosteringehalt jeder Probe unter Verwendung der externen Standard-Einpunktmethode berechnet.

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Representative Results

Chromatographischer Fingerabdruck von Chuanmutong und Ähnlichkeitsanalyse (SA)
Die RSD-Werte der relativen Retentionszeit von Präzision, Wiederholbarkeit und Stabilität lagen unter 0,46%, 1,65% bzw. 0,53%; die RSD-Werte der relativen Spitzenfläche lagen unter 4,23%, 3,56% bzw. 3,96%. Wie in den Abbildungen 1A,B gezeigt, gab es 12 verschiedene gemeinsame Peaks (von Peak 1 bis Peak 12) in den HPLC-Fingerabdrücken in den 10 authentischen Chuanmutong-Proben. Da die Spitzenfläche von Nr. 10 relativ groß war, war die Auflösung gut; Da es sich um eine Komponente handelte, die in jeder Probe vorhanden war, wurde sie als Referenzpeak verwendet, um die Stabilität und Reproduzierbarkeit des Fingerabdrucks zu untersuchen. Dann wurde der Peak Nr. 10 als Referenzpeak (S) genommen und die relative Retentionszeit der verbleibenden 11 Peaks berechnet.

In der Ähnlichkeitsanalyse gilt: Je näher der Korrelationskoeffizient bei 1 liegt, desto höher ist die Ähnlichkeit zwischen den Stichproben. Wie in Tabelle 1 gezeigt, betrug der Ähnlichkeitsgrad von 10 Chargen von Chuanmutong 0,910-0,989. Diese Ergebnisse zeigten, dass die 10 Chargen von Chuanmutong eine hohe Ähnlichkeit und gute Konsistenz aufwiesen, die zur Beurteilung der Gesamtqualität von Chuanmutong verwendet werden können. Wie in Abbildung 1C dargestellt, wurden die Fingerabdrücke von fünf Chargen seiner Verfälschungsmittel erhalten. Die Ähnlichkeit zwischen den Fingerabdrücken von fünf Chargen von Verfälschungsmitteln und den Kontrollfingerabdrücken von Chuanmutong betrug nur 0,133-0,720 (Tabelle 1), was darauf hindeutet, dass es offensichtliche Unterschiede zwischen den authentischen Proben und den verwandten Verfälschungsmitteln gibt. Die Unterschiede konzentrierten sich hauptsächlich in den chromatographischen Spitzenzahlen auf dem Chromatogramm bei 28-55 min. So können die Kontrollfingerabdrücke von Chuanmutong die authentischen Proben effektiv von den verwandten Verfälschungsmitteln unterscheiden.

Die statistische Software SPSS 26 wurde in diesem Experiment für die CA-Analyse verwendet (Abbildung 2A); 15 Probenchargen wurden in zwei Kategorien eingeteilt, wenn der Klassifizierungsabstand 20 betrug. Die erste Kategorie bestand aus 10 Chargen Chuanmutong und seinen gewohnheitsmäßigen Verfälschungsmitteln (CC). Die zweite Kategorie waren die Verfälschungsmittel von Chuanmutong, einschließlich DC, DE, XS und SMT. Wenn der Klassifizierungsabstand vier betrug, wurden alle Proben in vier Kategorien eingeteilt. Die erste Kategorie bestand aus 10 Chargen von Chuanmutong, die zweite Kategorie war CC, die dritte Kategorie war SMT und XS und die vierte Kategorie war DC und DE. Die Klassifizierungsergebnisse zeigten, dass die Qualität der authentischen Sorten von Chuanmutong im Wesentlichen gleich war und es offensichtliche Unterschiede zu allen Verfälschungsmitteln gab. Gleichzeitig war CC im Vergleich zu anderen Verfälschungsmitteln näher an der authentischen Variante von Chuanmutong, kann aber immer noch unterschieden werden, wenn der Klassifizierungsabstand eingeengt wird.

Die gemeinsamen Spitzenbereiche der 15 Probenchargen wurden für die PCA-Analyse in eine Datenanalysesoftware importiert, und die Score-Matrix (R2x = 0,994, Q2 = 0,961) (Abbildung 2B) zeigte, dass der Clustering-Effekt der 15 Probenchargen ausgeprägt war. Auf der rechten Seite der Y-Achse befanden sich 10 Chargen Chuanmutong und CC. Unter ihnen befand sich CC im ersten Quadranten, der sich von den authentischen Sorten von Chuanmutong unterscheidet. Die linke Seite der Y-Achse waren die Verfälschungsmittel, einschließlich SMT, XS, DE und DC. Unter ihnen befanden sich SMT und XS im zweiten Quadranten und DE und DC im dritten Quadranten. Beim Vergleich der authentischen Sorten von Chuanmutong mit den herkömmlichen Verfälschungsmitteln ist der Unterschied zwischen CC und authentischen Sorten relativ gering, während der Unterschied zwischen den authentischen und anderen Verfälschungsmitteln offensichtlich ist.

Die gemeinsame Peakfläche von Chuanmutong und seinen Verfälschungsmitteln wurde als Variable verwendet, in die Datenanalysesoftware für OPLS-DA importiert und dann die Score-Matrix gezeichnet (Abbildung 3A). Die R2 x [1] des OPLS-DA-Modells betrug 0,695 und die R2x [2] 0,605, die beide größer als 0,5 sind, was darauf hinweist, dass das Modell stabil und zuverlässig ist und verwendet werden kann, um authentische Proben von Verfälschungsmitteln zu unterscheiden.

Aus Abbildung 3A ist ersichtlich, dass die Stichprobenpunkte der authentischen und anderer Verfälschungsmittel vollständig getrennt waren und es keinen Schnittpunkt zwischen den Stichprobenpunkten gab. Alle Proben wurden in drei Teile unterteilt. Die authentischen Sorten von Chuanmutong und CC waren ähnlich. Die Stichproben von XS, DC und DE wurden in einer Klasse zusammengefasst, und die Stichprobe von SMT war die letzte Klasse. Darüber hinaus wurde die Beurteilungsmethode von variabler Bedeutung in der Projektion (VIP) (Abbildung 3B) verwendet, um die Spitzen verschiedener Komponenten im Fingerabdruck jeder Probe zu screenen. VIP > 1.0 wurde als Standard verwendet, um mehrere Variablen auszusortieren, die wesentlich zur Klassifizierung zwischen den Stichprobengruppen beitragen. Nach den Screening-Ergebnissen waren die Hauptmarkerkomponenten, die den Unterschied in der Zusammensetzung zwischen authentischen Proben und den Verfälschungsmitteln verursachten, die Peaks Nr. 9, Nr. 5, Nr. 7, Nr. 6, Nr. 10, Nr. 3 und Nr. 2. Der VIP-Wert der verbleibenden Spitzen betrug weniger als 1, was wenig Einfluss auf die Unterscheidung der Proben hatte.

Die lineare Beziehung zwischen der β-Sitosterol-Peakfläche und ihrer Lösungskonzentration wurde mittels Regressionsanalyse gefunden. Diese Abhängigkeit gehorchte einer Gleichung Y = 5,4918 X-4,5563, wobei Y die β-Sitosterol-Peakfläche und X der β-Sitosterin-Gehalt in μg/ml ist. Gleichzeitig ist der Korrelationskoeffizient r = 0,9995, der die Anforderungen erfüllt. Die RSD des Präzisionstests, des Stabilitätstests und des Wiederholbarkeitstests betrug 1,76%, 4,22% bzw. 3,85%. Die Ergebnisse zeigen, dass die Bestimmungsmethode des β-Sitosterolgehalts eine gute Linearität, Präzision und Wiederholbarkeit aufwies und die Probenlösung innerhalb von 24 h stabil war. Die durchschnittliche prozentuale Rückgewinnung auf drei Ebenen betrug 101,50 %, 101,90 % und 100,72 %; der entsprechende RSD betrug 2,56%, 1,56% bzw. 1,68%. Gute Übereinstimmungen zwischen theoretischen und tatsächlich ermittelten Werten bestätigten die Genauigkeit und Anwendbarkeit der Analysemethode. Das flüssige Chromatogramm von β-Sitosterol ist in Abbildung 4 dargestellt, und der Gehalt an β-Sitosterin in 15 Probenchargen wurde bestimmt (Tabelle 2). Die Ergebnisse zeigten, dass die Konzentration von β-Sitosterol in 10 Chargen authentischer Proben im Bereich von 97,53-161,56 μg/g lag (relativ stabil). Diese Komponente wurde in allen fünf Chargen von Verfälschungsmitteln nachgewiesen, aber der Inhalt variierte stark.

Figure 1
Abbildung 1: Fingerabdrücke von Chuanmutong und ihren Verfälschungsmitteln. (A) Fingerabdrücke von 10 Chargen authentischer Chuanmutong-Proben (S1: CMT-1, S2: CMT-2, S3: CMT-3, S4: CMT-4, S5: CMT-5, S6: CMT-6, S7: CMT-7, S8: CMT-8, S9: CMT-9, S10: CMT-10). (B) die Referenz-Chromatogramm-Fingerabdrücke von authentischen Chuanmutong-Proben; Die relativen Retentionszeiten betrugen 0,18 (Peak Nr. 1), 0,22 (Peak Nr. 2), 0,29 (Peak Nr. 3), 0,72 (Peak Nr. 4), 0,75 (Peak Nr. 5), 0,82 (Peak Nr. 6), 0,86 (Peak Nr. 7), 0,92 (Peak Nr. 8), 0,96 (Peak Nr. 9), 1,00 (Peak Nr. 10), 1,02 (Peak Nr. 11), 1,37 (Peak Nr. 12). (C) Fingerabdrücke von fünf Chargen von Chuanmutong-Verfälschungsmitteln (S1: CC, S2: DC, S3: DE, S4: XS, S5: SMT). (D) Vergleich zwischen Referenzchromatogramm-Fingerabdrücken authentischer Chuanmutong-Proben und den fünf Chargen ihrer Verfälschungsmittel (S1: Referenz-Chromatogramm-Fingerabdrücke, S2: CC, S3: DC, S4: DE, S5: XS, S6: SMT). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: CA- und PCA-Analyse von 10 Chargen authentischer Chuanmutong-Proben und fünf Chargen von Verfälschungsmitteln. (A) CA-Analyse. (B) PCA-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: OPLS-DA-Score-Karte und VIP-Score-Karte von 10 Chargen authentischer Chuanmutong-Proben und fünf Chargen von Verfälschungsmitteln. (A) OPLS-DA-Score-Map. (B) VIP-Punktekarte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Das flüssige Chromatogramm von β-Sitosterol. S1: β-sitosterol, S2: CMT-4, S3: XS, S4: DC, S5: SMT, S6: CC, S7: DE. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Proben Name Ähnlichkeit
die echten Sorten von Chuanmutong CMT-1 0.947
CMT-2 0.910
CMT-3 0.989
CMT-4 0.937
CMT-5 0.989
CMT-6 0.988
CMT-7 0.956
CMT-8 0.959
CMT-9 0.939
CMT-10 0.966
Beimischungen CC 0.599
GLEICHSTROM 0.720
EN 0.133
XS 0.694
SMT 0.180

Tabelle 1: Ergebnisse der Ähnlichkeit von 10 Chargen authentischer Chuanmutong-Proben und ihrer Verfälschungsmittel. Durch den Import der relevanten Daten in das Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Evaluation System wurde die Ähnlichkeit von 10 Chargen authentischer Chuanmutong-Proben und fünf Chargen von Verfälschungsmitteln berechnet.

Proben Name Inhalt (μg/g)
die echten Sorten von Chuanmutong CMT-1 103.5
CMT-2 124.6
CMT-3 131
CMT-4 121.1
CMT-5 97.5
CMT-6 113.8
CMT-7 105.6
CMT-8 161.6
CMT-9 118
CMT-10 123.5
Beimischungen CC 157.4
GLEICHSTROM 165.6
EN 32.9
XS 69.7
SMT 192.2

Tabelle 2: Bestimmungsergebnisse des β-Sitosterolgehalts in den authentischen Chuanmutong-Proben und deren Verfälschungsmitteln.

Ergänzende Abbildung 1: Flüssigkeitschromatographie unter verschiedenen Probenvorbereitungsbedingungen und unterschiedlichen chromatographischen Bedingungen. (A) Die mobilen Phasensysteme (S1: Acetonitril-0,1%ige Ameisensäurelösung, S2: Acetonitril-0,5%ige Essigsäurelösung, S3: Acetonitril-reines Wasser, S4: Acetonitril-0,05%ige Phosphorsäurelösung, S5: methanolreines Wasser). (B) Die Detektionswellenlängen (S1: 205 nm, S2: 230 nm, S3: 250 nm, S4: 300 nm). (C) Die Säulentemperaturen (S1: 20 °C, S2: 30 °C, S3: 40 °C). (D) Die Durchflussraten (S1: 0,8 ml/min, S2: 0,9 ml/min, S3: 1,0 ml/min). (E) Die Extraktionsmethoden (S1: Ultraschallextraktion, S2: Rückflussextraktion). (F) Die Extraktionslösungsmittel (S1: Ethylacetat, S2: Ethanol, S3: Chloroform, S4: n-Butanol, S5: Methanol). (G) Die Extraktionszeit (S1: 15 min, S2: 30 min, S3: 60 min). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Das flüssige Chromatogramm von Ergosterol, Stigmasterol und authentischem Chuanmutong. S1: Stigmasterin, S2: Ergosterol, S3: CMT-4. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Die Probenentnahme für die Forschung ist der erste wichtige Schritt zum Aufbau einer Multimustererkennung zur Identifizierung der Authentizität chinesischer Arzneimittel. Durch Marktforschung fanden wir heraus, dass Sichuan Ya'an, Liangshan und Leshan die Hauptproduktionsgebiete für wilde Ressourcen von Chuanmutong sind. Die verwandten Sorten derselben Gattung haben auch die gleiche geographische Verbreitung 6,20; CC, DC, DE, XS und SMT werden oft als Chuangmutong16,21 missbraucht; Daher wurden in dieser Studie 10 Chargen authentischer Chuanmutong und fünf Chargen gemischter Proben an den oben genannten Ursprungsorten gesammelt, und die Genauigkeit der Sorten wurde bestätigt.

Der zweite wichtige Schritt besteht darin, die Nachweisbedingungen des HPLC-Fingerabdrucks zu überprüfen, der so viele Informationen wie möglich über die chemischen Komponenten anzeigen kann. In dieser Studie, wie in der ergänzenden Abbildung 1 gezeigt, wurden die Anzahl und Fläche der chromatographischen Peaks unter verschiedenen Zubereitungsbedingungen erhalten, einschließlich der Extraktionsmethoden, der Extraktionslösungsmittel und der Extraktionszeit. Die optimale Präparationsmethode der Chuanmutong-Probenlösung wurde bestimmt. Zum anderen wurden die Anzahl und Auflösung der chromatographischen Peaks der Proben unter verschiedenen chromatographischen Bedingungen verglichen. die mobilen Phasensysteme, wie Acetonitril-0,1%ige Ameisensäurelösung, Acetonitril-0,5%ige Essigsäurelösung, Acetonitril-reines Wasser, Acetonitril-0,05%ige Phosphorsäurelösung und Methanol-reines Wasser, die Detektionswellenlängen, wie 205 nm, 230 nm, 250 nm und 300 nm, die Säulentemperaturen, wie 20 °C, 30 °C und 40 °C, und die Durchflussraten, wie 0,8-1,0 ml/min, untersucht. Die optimalen chromatographischen Bedingungen für die Analyse der Proben von Chuanmutong wurden bestimmt. Darüber hinaus wurde seine Machbarkeit durch methodische Validierung bestätigt, und die Nachweismethode des HPLC-Fingerabdrucks von Chuanmutong wurde erfolgreich konstruiert.

Der dritte wichtige Schritt besteht darin, die Informationen in den Fingerabdrücken der authentischen chinesischen Medizin und ihrer Verfälschungsmittel zu analysieren und zu finden. In dieser Studie wurde zunächst die Ähnlichkeit von Fingerabdrücken mittels SESCF-TCM (Version 2012) analysiert. Es wurde festgestellt, dass die Ähnlichkeit zwischen den Fingerabdrücken von 10 Chargen authentischer Chuanmutong-Proben und dem charakteristischen Fingerabdruck der Kontrolle sehr hoch war. Im Vergleich dazu war die Ähnlichkeit zwischen den Fingerabdrücken von fünf Chargen von Verfälschungsmitteln und dem Kontrollmerkmal Fingerabdruck signifikant geringer als die von authentischen Proben. CA, PCA und OPLS-DA wurden dann weiter eingeführt, um die gemeinsamen Peakinformationen der chemischen Fingerabdrücke zu analysieren. Sowohl CA- als auch PCA-Ergebnisse zeigen, dass das häufig verwendete Verfälschungsmittel CC unter verschiedenen Verfälschungsmitteln relativ näher an dem authentischen ist, was schwer zu unterscheiden ist. Wenn jedoch der Klassifizierungsabstand von CA auf vier geändert wird, kann die effektive Identifizierung zwischen dem Echtstoff und dem Verfälschungsmittel erreicht werden. Basierend auf den 12 gemeinsamen Peaks authentischer Materialien wurden die Beitragswerte der differentiellen Peaks von Verfälschungsmitteln von OPLS-DA quantitativ ausgewertet und erhielten sieben differentielle chromatographische Peaks, nämlich Peak No.9, Peak No.5, Peak No.7, Peak No.6, Peak No.10, Peak No.3 und Peak No.2. Diese können verwendet werden, um die authentischen und gefälschten Materialien von Chuanmutong effektiv zu identifizieren, die die Hauptmerkmale des Unterschieds zwischen dem authentischen und dem verfälschenden sind.

Die neueste Ausgabe des chinesischen Arzneibuchs enthält noch nicht die Gehaltsbestimmung der wirksamen Bestandteile von Chuanmutong. Um die Qualitätskontrolle zu verbessern, untersuchte diese Studie Methoden zur Bestimmung des Gehalts von aktiven Komponenten wie β-Sitosterin, Ergosterol, Sitosterol und Oleanolsäure im Zusammenhang mit der harntreibenden Wirkung in früheren Berichten 22,23,24,25,26. Wie in der ergänzenden Abbildung 2 gezeigt, wurde Ergosterin im authentischen Chuanmutong nicht nachgewiesen, und Stigmasterol war im Chromatogramm schwer zu trennen und konnte nicht genau quantifiziert werden. Schließlich wurde die Methode zur Bestimmung des Gehalts von β-Sitosterol festgelegt; Die Nachweisergebnisse zeigten, dass β-Sitosterol in 10 Chargen authentischer Chuanmutong-Proben und fünf Chargen von Verfälschungsmitteln gefunden wurde. Daher war β-Sitosterol nicht auf echte medizinische Materialien beschränkt. Obwohl einige Informationen über die Qualität von Chuanmutong zur Verfügung gestellt werden können, ist es immer noch notwendig, die differentiellen chromatographischen Spitzen in den Fingerabdrücken in Zukunft weiter zu analysieren, um zu sehen, ob die spezifischen Komponenten, die mit der Wirksamkeit von Chuanmutong zusammenhängen, gefunden werden können.

Gegenwärtig werden traditionelle chinesische Arzneimittel oft durch die Ähnlichkeit des chemischen Fingerabdruckspektrums identifiziert. Dieser Indikator ist jedoch ein Parameter, der auf den Gesamtinformationen der chromatographischen Peaks der Probe basiert und keine weiteren Informationen über die Identifizierung und die Hauptunterschiede verschiedener Proben liefern kann. Daher verwendete diese Studie CA, PCA und OPLS-DA, um die gemeinsamen Peakinformationen chemischer Fingerabdrücke zu identifizieren, die wichtigsten differentiellen chromatographischen Peaks zwischen authentischen und verfälschten Proben von Chuanmutong zu finden und erfolgreich zu identifizieren. Schließlich wurde HPLC-gekoppelter chemischer Fingerabdruck zur Multimustererkennung konstruiert.

Da es nicht ungewöhnlich ist, authentische chinesische Arzneimittel und ihre Verfälschungsmittel wie Fritillaria thunbergii, Herba Asari und Lonicera japonica zu mischen, wird diese Methode eine neue Strategie zur eindeutigen und wissenschaftlichen Identifizierung authentischer chinesischer Arzneimittel und ihrer Verfälschungsmittel bieten. Diese Strategie wird von großer Bedeutung sein, um die Qualität chinesischer Arzneimittel in der klinischen Anwendung sicherzustellen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom Projekt der Sichuan Traditional Chinese Medicine Administration (Nr. 2020JC0088, Nr. 2021MS203) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2017381038
Acetonitrile Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, China WXBD5243V
β-Sitosterol Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China 20210201
 C18 column Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China Welch Ultimate LP
Chuanmutong Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China  19020103 CMT-1
Chuanmutong Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200701 CMT-2
Chuanmutong Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200701 CMT-3
Chuanmutong Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200901 CMT-4
Chuanmutong Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  210701 CMT-5
Chuanmutong Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  210401 CMT-6
Chuanmutong Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200901 CMT-7
Chuanmutong Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China  201201 CMT-8
Chuanmutong Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China  201001 CMT-9
Chuanmutong Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 210501 CMT-10
Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China  - CC
Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China  - DC
Clematis peterae Hand.-Mazz. Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China  - DE
Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China  - XS
Clematis finetiana Levl. et Vaniot. Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China  - SMT
Electronic balance Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai,  China  FA1204
Ergosterol Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China 20210201
Ethanol Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 2021112602
Ethyl acetate Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2017042043
Formic acid Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 2016062901
High performance liquid chromatography Agilent, USA. 1260
IBM SPSS Statistics version 26.0 International Business Machines Corporation, USA -
Methanol Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, China WXBD6409V
Methanol Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 202010302
n-butyl alcohol Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2020071047
Petroleum ether Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2020090125
Phosphoric acid Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 20200110
SESCF-TCM version 2012 National Pharmacopoeia Commission, China - http://114.247.108.158:8888/login
Stigmasterol Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China 20210201
Trichloromethane Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China 20200214
Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 Umetrics, Sweden - https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download
Ultrapure water machine Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China UPH-II-10T
Ultrasonic cleaner Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China KH3200E

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Chemie Ausgabe 189 chemischer Fingerabdruck Multimustererkennung Clusteranalyse Hauptkomponentenanalyse orthogonale partielle Kleinste-Quadrate-Diskriminierungsanalyse chinesische Arzneimittel Clematidis Armandii Caulis
HPLC gekoppelt mit chemischem Fingerabdruck zur Multimustererkennung zur Identifizierung der Authentizität von <em>Clematidis armandii caulis</em>
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Wang, F., Qian, Z., Liao, G., Zeng,More

Wang, F., Qian, Z., Liao, G., Zeng, J., Huang, D., Liu, Q., Xie, X. HPLC Coupled with Chemical Fingerprinting for Multi-Pattern Recognition for Identifying the Authenticity of Clematidis Armandii Caulis. J. Vis. Exp. (189), e64690, doi:10.3791/64690 (2022).

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