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Chemistry

एचपीएलसी क्लेमेटिडिस आर्मंडी कौलिस की प्रामाणिकता की पहचान करने के लिए मल्टी-पैटर्न मान्यता के लिए रासायनिक फिंगरप्रिंटिंग के साथ युग्मित

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64690
Automatic Translation
*1, *1, *2, 2, 2, 2, 1
1School of Pharmacy, The Second Class Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmaceutics, National Administration of Traditional Chinese Medicine, Chengdu Medical College, 2Pengzhou Second People's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो रासायनिक फिंगरप्रिंट मल्टी-पैटर्न मान्यता के साथ मिलकर, जो क्लेमाटिस आर्मंडी कौलिस और इसके मिलावट की वास्तविक किस्मों की प्रभावी ढंग से पहचान करने के लिए एक नई रणनीति प्रदान करता है।

Abstract

चीनी औषधीय सामग्रियों और उनके संबंधित मिलावटों की पहचान करने के लिए एक विधि का निर्माण एक उदाहरण के रूप में क्लेमाटिस अरमान्डी कौलिस (चुआनमुटोंग, एक सार्वभौमिक रूप से उपयोग की जाने वाली पारंपरिक चीनी दवा) को लेकर किया गया था। वास्तविक चुआनमुटोंग किस्मों के दस बैचों और संबंधित मिलावट के पांच बैचों का विश्लेषण किया गया और क्लस्टर विश्लेषण (सीए), प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए), और ऑर्थोगोनल आंशिक कम से कम वर्ग भेदभाव विश्लेषण (ओपीएलएस-डीए) सहित केमोमेट्रिक्स के साथ संयुक्त उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) फिंगरप्रिंट के आधार पर तुलना की गई। इसके अलावा, β-सिटोस्टेरॉल की सामग्री निर्धारित की गई थी। चुआनमुटोंग के नियंत्रण रासायनिक फिंगरप्रिंट की स्थापना की गई थी, और 12 सामान्य चोटियों की पहचान की गई थी। वास्तविक चुआनमुटोंग किस्मों के 10 बैचों के फिंगरप्रिंट और नियंत्रण फिंगरप्रिंट के बीच समानता 0.910-0.989 थी, जबकि मिलावट के पांच बैचों की समानता केवल 0.133-0.720 थी। क्रोमैटोग्राम में आम चोटियों के आधार पर, नमूनों के 15 बैचों को पीसीए द्वारा तीन सामग्री स्तरों में वर्गीकृत किया गया था, और सीए द्वारा चार श्रेणियों में एकत्रित किया गया था, जिससे प्रामाणिक चुआनमुटोंग और चुआनमुटोंग के मिलावट के बीच स्पष्ट अंतर प्राप्त हुआ। इसके अलावा, सात अंतर घटक जो प्रभावी रूप से प्रामाणिक चुआनमुटोंग और चुआनमुटोंग के मिलावट की पहचान कर सकते हैं, ओपीएलएस-डीए के माध्यम से पाए गए थे। वास्तविक चुआनमुटोंग किस्मों के 10 बैचों की β-सिटोस्टेरॉल सामग्री 97.53-161.56 μg / g थी, जबकि मिलावट के पांच बैचों की β-सिटोस्टेरॉल सामग्री बहुत भिन्न थी, जिनमें से क्लेमेटिस पीटरे हैंड की β-सिटोस्टेरोल सामग्री थी। और क्लेमेटिस गौरियाना रॉक्सब। ठीक है । एट विल्स। चुआनमुटोंग की प्रामाणिक किस्मों की तुलना में काफी कम था। इस अध्ययन में स्थापित एचपीएलसी सूचकांक घटक सामग्री और रासायनिक फिंगरप्रिंट मल्टी-पैटर्न मान्यता विधि प्रामाणिक चीनी औषधीय सामग्री और संबंधित मिलावट की प्रभावी ढंग से पहचान करने के लिए एक नई रणनीति प्रदान करती है।

Introduction

- चुआनमुटोंग, क्लेमेटिस आर्मंडी फ्रैंच के सूखे कौलिस। या क्लेमेटिस मोंटाना बुच-हैम, एक पारंपरिक चीनी दवा है जिसका उपयोग आमतौर पर क्लीनिक 1,2,3 में किया जाता है। इसका उपयोग मूत्र संबंधी समस्याओं, एडिमा, जीभ और मुंह पर घावों, दूध के स्राव में कमी, जोड़ों की कठोरता और नम गर्मी के कारण मांसपेशियों में दर्द के इलाज के लिए कियाजाता है। चुआनमुटोंग हमेशा जंगली किस्मों से प्राप्त किया गया है, मुख्य रूप से दक्षिण-पश्चिम चीन में वितरित किया जाता है, विशेष रूप से सिचुआन में, जहां सबसे अच्छी गुणवत्ता 5,6 पाई जा सकती है। प्रामाणिक किस्मों और उनके निकट से संबंधित मिलावट के बीच अंतर करना मुश्किल है क्योंकि उनकी समान विशेषताएं 7,8,9,10 हैं। चीनी फार्माकोपिया के 2020 संस्करण में चुआनमुटोंग का गुणवत्ता मानक केवल सामग्री निर्धारण के बिना गुणों, सूक्ष्म पहचान और पतली परत की पहचान को निर्धारित करता है, जो प्रभावी ढंग से मिलावट की पहचान नहीं कर सकता है, और इसलिए संभावित जोखिम हैं। इसके अलावा, चुआनमुटोंग और संबंधित पौधों की तुलना और पहचान करने वाली कुछ रिपोर्टें हैं। नतीजतन, चुआनमुटोंग की प्रामाणिकता सुनिश्चित करने के लिए एक गुणवत्ता नियंत्रण विधि आगे के अध्ययन के योग्य है।

चुआनमुटोंग के रासायनिक घटक मुख्य रूप से ओलेनेन-प्रकार के पेंटासाइक्लिक ट्राइटरपेनोइड्स और उनके ग्लाइकोसाइड, फ्लेवोनोइड्स और कार्बनिक एसिड 11,12,13,14 से बने होते हैं। उनमें से, ओलेनोलिक एसिड, β-सिटोस्टेरॉल, स्टिग्मास्टेरॉल और एर्गोस्टेरॉल में विभिन्न तीव्रताओं के मूत्रवर्धक प्रभाव होते हैं, जो डायरेसिस को बढ़ावा देने और स्ट्रैंगुरिया15,16 से राहत के लिए संभावित फार्माकोडायनामिक पदार्थ हो सकते हैं। उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी), गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी), आदि द्वारा नमूनों में निहित कई रासायनिक घटकों को अलग करके और पता लगाकर रासायनिक फिंगरप्रिंट प्राप्त किए जाते हैं। चुआनमुटोंग की विशेषताओं का विश्लेषण करने के लिए उचित सांख्यिकीय विश्लेषण विधियों को अपनाने से पारंपरिक चीनी चिकित्सा17,18,19 की समग्र गुणवत्ता नियंत्रण और वैज्ञानिक पहचान निर्धारित की जा सकती है।

इस अध्ययन में, चुआनमुटोंग प्रामाणिक किस्मों के 10 बैच और मिलावट के पांच बैच एकत्र किए गए थे। उनकी गुणवत्ता की तुलना और विश्लेषण एचपीएलसी फिंगरप्रिंट विधि द्वारा मल्टी-पैटर्न मान्यता के साथ संयुक्त किया गया था, जिसमें क्लस्टर विश्लेषण (सीए), प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए), ऑर्थोगोनल आंशिक कम से कम वर्ग भेदभाव विश्लेषण (ओपीएलएस-सीए), और फार्माकोडायनामिक घटक की सामग्री निर्धारण शामिल है। यह प्रोटोकॉल उच्च विशिष्टता के साथ प्रामाणिक किस्मों की पहचान करने के लिए एक विधि स्थापित करता है, चीनी औषधीय सामग्रियों की प्रामाणिक किस्मों और मिलावटों की वैज्ञानिक पहचान के लिए एक नई रणनीति।

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Protocol

1. रासायनिक फिंगरप्रिंट का पता लगाने के तरीके

  1. क्रोमैटोग्राफिक स्थितियां
    1. एसिटोनिट्राइल (ए)/वाटर (बी) मोबाइल चरण तैयार करें। एचपीएलसी सॉफ्टवेयर में निम्नानुसार एक ढाल प्रोग्राम सेट करें: 0-20 मिनट, 3% ए -10%ए; 20-25 मिनट, 10% ए-13% ए; 25-65 मिनट, 13% ए-25% ए; 65-75 मिनट, 25% ए-40% ए; 75-76 मिनट, 40% ए-3% ए; 76-85 मिनट, 3% ए-3% ए।
    2. मोबाइल चरण की प्रवाह दर को 1.0 एमएल / मिनट पर बनाए रखें।
    3. 30 डिग्री सेल्सियस पर बनाए गए सी 18 कॉलम (250 मिमी x 4.6 मिमी, 5 μm) पर क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण का संचालन करें।
    4. इंजेक्शन की मात्रा को 10 μL पर सेट करें।
    5. 205 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर नमूने का पता लगाएं।
      नोट: क्रोमैटोग्राफिक स्थितियों की विशिष्ट सेटिंग्स के लिए, उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (सामग्री की तालिका) के कामकाजी सॉफ्टवेयर की ऑपरेटिंग प्रक्रियाओं को देखें।
  2. नमूना समाधान की तैयारी
    1. कच्चे माल को 850 μm ± 29 μm के आंतरिक व्यास के साथ नायलॉन जाल के माध्यम से पारित करके एक समान कण आकार में पीस लें।
    2. एक स्टॉपर के साथ 50 एमएल शंक्वाकार फ्लास्क में 2 ग्राम ग्राउंड कच्चे माल (सटीक रूप से तौला गया) रखें और 50 एमएल मेथनॉल जोड़ें। स्टॉपर को फ्लास्क और अल्ट्रासोनिकेट (600 डब्ल्यू, 40 किलोहर्ट्ज) पर 30 मिनट के लिए रखें।
    3. फिर, फ्लास्क को कमरे के तापमान (आरटी) पर ठंडा करें। नमूनों को फिर से तौलें, और खोए हुए एक्सट्रैक्टर को बदलकर प्रारंभिक वजन की भरपाई करें।
    4. औषधीय अर्क युक्त मेथनॉल समाधान के 4 एमएल को 10 एमएल वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में डालें। H2O का 6 mL जोड़ें, मिलाएं, और इसे 10 मिनट के लिए बसने दें।
    5. अंत में, 0.45 μm फ़िल्टर झिल्ली के माध्यम से सुपरनैटेंट को फ़िल्टर करें और इसे स्टैंडबाय पर रखें।
  3. फिंगरप्रिंट डिटेक्शन विधियों का सत्यापन
    1. ऊपर वर्णित (चरण 1.2) के अनुसार नमूना तैयार करें और इसे दिन में छह बार एचपीएलसी विश्लेषण (चरण 1.1) के अधीन करें। परिशुद्धता का मूल्यांकन करने के लिए, चरण 1.3.5 में वर्णित सापेक्ष प्रतिधारण समय और सापेक्ष शिखर क्षेत्रों के सापेक्ष मानक विचलन (आरएसडी) की गणना करें।
    2. 0, 2, 4, 6, 8, 12 और 24 घंटे के लिए आरटी में संग्रहीत एक ही नमूना समाधान का विश्लेषण करके नमूना समाधान की स्थिरता का मूल्यांकन करें, और चरण 1.3.5 में वर्णित सापेक्ष प्रतिधारण समय और सापेक्ष शिखर क्षेत्रों के आरएसडी की गणना करें।
    3. एक ही नमूने (सीएमटी -4) की छह प्रतिकृतियां लें, उपरोक्त प्रक्रिया (चरण 1.2) के अनुसार नमूना समाधान तैयार करें, और चरण 1.1 के बाद एचपीएलसी में इसके फिंगरप्रिंट का पता लगाएं। सापेक्ष प्रतिधारण समय और सापेक्ष शिखर क्षेत्रों के आरएसडी की गणना करें, और चरण 1.3.5 में वर्णित इसकी पुनरावृत्ति का मूल्यांकन करें।
    4. फिर संदर्भ शिखर के रूप में चित्रा 1 बी में पीक नंबर 10 का उपयोग करें और चरण 1.3.5 में वर्णित प्रत्येक सामान्य चोटी के सापेक्ष प्रतिधारण समय और सापेक्ष शिखर क्षेत्र के आरएसडी की गणना करें।
    5. प्रत्येक सामान्य चोटी के सापेक्ष प्रतिधारण समय और सापेक्ष शिखर क्षेत्र की गणना करने के लिए नीचे उल्लिखित सूत्रों का उपयोग करें:
      Tre = Tविशेषता/Tसंदर्भ
      Are = एकविशेषता/Aसंदर्भ
      जहां Tre = सापेक्ष प्रतिधारण समय, Tविशेषता = विशेषता शिखर प्रतिधारण समय, Tसंदर्भ = संदर्भ शिखर प्रतिधारण समय, Are = सापेक्ष शिखर क्षेत्र, Aविशेषता = विशेषता शिखर क्षेत्र, और Aसंदर्भ = संदर्भ शिखर क्षेत्र।
      नोट: पारंपरिक चीनी चिकित्सा फिंगरप्रिंट की स्थापना के लिए आम तौर पर एक क्रोमैटोग्राफिक शिखर का चयन करने की आवश्यकता होती है जो प्राप्त करना आसान है और इसमें उच्च रिज़ॉल्यूशन है। यह उंगलियों के निशान की पहचान करने और उनकी स्थिरता और प्रजनन क्षमता की जांच करने के लिए एक संदर्भ शिखर के रूप में उपयोग किया जाता है।

2. चुआनमुटोंग फिंगरप्रिंट की स्थापना और समानता विश्लेषण

  1. प्रामाणिक नमूनों के 10 बैचों और मिलावटखोरों के पांच बैचों का उपयोग करें जैसे क्लेमेटिस अर्जेंटिलुसीडा (लेवल एट वेंट) डब्ल्यू टी वांग (सीसी), क्लेमेटिस एपिफोलिया वर। एट विल्स। (डीसी), क्लेमेटिस पीटर हैंड । (डीई), क्लेमेटिस गौरियाना रॉक्सब। ठीक है । एट विल्स (एक्सएस), और क्लेमेटिस फाइनटियाना लेवल। और वनिओट। (एसएमटी) फिंगरप्रिंट विश्लेषण के लिए नमूने के रूप में।
  2. चरण 1.2 में वर्णित नमूना समाधान तैयार करें। चरण 1.1 के तहत वर्णित शर्तों के अनुसार एचपीएलसी द्वारा सभी नमूना समाधानों का फिंगरप्रिंट विश्लेषण करें।
  3. पारंपरिक चीनी चिकित्सा (एसईएससीएफ-टीसीएम, 2012 संस्करण) के क्रोमैटोग्राफिक फिंगरप्रिंट की समानता मूल्यांकन प्रणाली में प्रासंगिक डेटा आयात करें। प्रणाली सभी नमूनों के क्रोमैटोग्राम में उचित ऊंचाई और अच्छे रिज़ॉल्यूशन वाली चोटियों को सामान्य चोटियों के रूप में नामित करेगी।
    नोट: एसईएससीएफ-टीसीएम सॉफ्टवेयर चीनी फार्माकोपिया आयोग (http://114.247.108.158:8888/login) की वेबसाइट पर पंजीकरण के बाद डाउनलोड किया जा सकता है।
    1. सॉफ़्टवेयर में, मेनू में संदर्भ स्पेक्ट्रम सेट करें बटन क्लिक करें।
    2. फिर पैरामीटर सेटिंग्स विंडो में, समय विंडो चौड़ाई को 0.5 पर सेट करें और औसत विधि के रूप में नियंत्रण स्पेक्ट्रम जनरेशन विधि का चयन करें।
    3. मुख्य मेनू में मल्टी-पॉइंट कैलिब्रेशन पर क्लिक करें, फिर फुल स्पेक्ट्रम पीक मैचिंग के रूप में पीक मैचिंग का चयन करें।
    4. अंत में, चुआनमुटोंग की प्रामाणिक प्रजातियों के संदर्भ क्रोमैटोग्राफिक फिंगरप्रिंट उत्पन्न करने के लिए जेनरेट कंट्रोल पर क्लिक करें।
  4. विश्लेषण के लिए एसईएससीएफ-टीसीएम में प्रामाणिक चुआनमुटोंग नमूनों के 10 बैचों और मिलावट के पांच बैचों के अवधारण समय और शिखर क्षेत्र को आयात करें। विशिष्ट संचालन निम्नानुसार हैं:
    1. सॉफ्टवेयर में, मुख्य मेनू में संदर्भ स्पेक्ट्रम सेट करें बटन पर क्लिक करें।
    2. पैरामीटर सेटिंग्स विंडो में, संदर्भ के रूप में चुआनमुटोंग की प्रामाणिक प्रजातियों के संदर्भ क्रोमैटोग्राफिक फिंगरप्रिंट सेट करें, मेडियन विधि के रूप में नियंत्रण स्पेक्ट्रम जनरेशन विधि का चयन करें, और समय विंडो चौड़ाई को 0.5 पर सेट करें।
    3. मुख्य मेनू में मल्टी-पॉइंट कैलिब्रेशन पर क्लिक करें, फिर फुल स्पेक्ट्रम पीक मैचिंग के रूप में पीक मैचिंग का चयन करें।
    4. अंत में, चुआनमुटोंग के संदर्भ क्रोमैटोग्राम फिंगरप्रिंट के आधार पर समानता की गणना करने के लिए समानता की गणना करें पर क्लिक करें। अंत में, चीनी चिकित्सा क्रोमैटोग्राफिक फिंगरप्रिंट मूल्यांकन प्रणाली (2012 संस्करण) का उपयोग करके फिंगरप्रिंट की समानता की गणना करें।
      नोट: विशिष्ट संचालन के लिए, चीनी चिकित्सा क्रोमैटोग्राफिक फिंगरप्रिंट मूल्यांकन प्रणाली (2012 संस्करण) के लिए ऑपरेटिंग विनिर्देशों को देखें।

3. चुआनमुटोंग फिंगरप्रिंट का बहु-पैटर्न मान्यता विश्लेषण

  1. क्लस्टर विश्लेषण (सीए)
    1. प्रामाणिक चुआनमुटोंग नमूनों के 10 बैचों के फिंगरप्रिंट में 12 सामान्य चोटियों के शिखर क्षेत्रों का उपयोग करें और चर के रूप में मिलावट के उनके पांच बैच, और उन्हें व्यवस्थित क्लस्टर विश्लेषण (सीए) के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर में इनपुट करें।
    2. समूहों के बीच विधि चुनें और पियरसन सहसंबंध गुणांक का उपयोग वर्गीकरण आधार के रूप में करें ताकि चुआनमुटोंग और उसके मिलावटखोरों का क्लस्टर विश्लेषण आरेख तैयार किया जा सके। विशिष्ट संचालन निम्नानुसार हैं:
      1. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर में, डेटा आयात करने के लिए फ़ाइल पर क्लिक करें।
      2. मेनू में विश्लेषण पर क्लिक करें और फिर वर्गीकरण में सिस्टम क्लस्टरिंग पर क्लिक करें।
      3. चर के रूप में सामान्य शिखर क्षेत्र का चयन करें, और समूहों की संख्या को चार पर सेट करें।
      4. विधि पर क्लिक करें, क्लस्टरिंग विधि को इंटर-ग्रुप कनेक्शन के रूप में चुनें, पियर्सन सहसंबंध के रूप में माप अंतराल का चयन करें, और सीए मानचित्र खींचने के लिए ओके पर क्लिक करें।
  2. प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए)
    1. प्रामाणिक किस्मों और उनके मिलावट के सापेक्ष सामान्य शिखर क्षेत्र को पीसीए विश्लेषण के लिए विश्लेषण सॉफ्टवेयर में आयात करें, और नमूना अंतर के स्कोर मैट्रिक्स मानचित्र का मूल्यांकन करने के लिए पीसीए स्कोर मानचित्र का उपयोग करें। विशिष्ट संचालन निम्नानुसार हैं:
      1. डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें, मेनू पर फ़ाइल पर क्लिक करें और एक नया नियमित प्रोजेक्ट बनाएं। एचपीएलसी सिस्टम से स्प्रेडशीट (जैसे, एक्सेल प्रारूप) में 12 सामान्य चोटियों के शिखर क्षेत्र को आयात करें। फिर डेटा आयात पूरा करने के लिए फिनिश पर क्लिक करें।
      2. पीसीए के साथ मॉडल प्रकार सेट करने के लिए एक नया मॉडल बनाने के लिए नया पर क्लिक करें। ऑटोफिट पर क्लिक करें और डेटा फिट करने के लिए जोड़ें , फिर पीसीए स्कोर मैप प्राप्त करने के लिए स्कोर पर क्लिक करें।
  3. ऑर्थोगोनल आंशिक कम से कम वर्ग भेदभाव विश्लेषण (ओपीएलएस-डीए)
    1. प्रामाणिक चुआनमुटोंग किस्मों और मिलावटों के सापेक्ष सामान्य शिखर क्षेत्र चोटियों का विश्लेषण करने और सभी नमूनों का ओपीएलएस-डीए वर्गीकरण स्कोर मानचित्र तैयार करने के लिए पर्यवेक्षण मोड के साथ ऑर्थोगोनल आंशिक कम से कम वर्ग भेदभाव विश्लेषण विधि का उपयोग करें। विशिष्ट संचालन निम्नानुसार हैं:
      1. डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में, फ़ाइल आयात करने और एक नया नियमित प्रोजेक्ट बनाने के लिए मेनू में फ़ाइल पर क्लिक करें। एचपीएलसी सिस्टम से स्प्रेडशीट में 12 सामान्य चोटियों के शिखर क्षेत्र को आयात करें, फिर डेटा आयात को पूरा करने के लिए फिनिश पर क्लिक करें।
      2. पीसीए के साथ मॉडल प्रकार सेट करने के लिए एक नया मॉडल बनाने के लिए नया पर क्लिक करें। ऑटोफिट पर क्लिक करें और डेटा फिट करने के लिए जोड़ें । फिर पीसीए स्कोर मैप प्राप्त करने के लिए स्कोर पर क्लिक करें।
      3. नए पर क्लिक करें और OPLS-DA के साथ मॉडल प्रकार सेट करने के लिए मॉडल वन के रूप में नया चुनें।
      4. स्केल पर क्लिक करें और सभी के लिए Par के साथ टाइप सेट करें। पहले ऑटोफिट पर क्लिक करें और फिर ओपीएलएस-डीए स्कोर मैप प्राप्त करने के लिए स्कोर पर क्लिक करें।
    2. अपने वर्गीकरण परिणामों पर चुआनमुटोंग में प्रत्येक आम चोटी के प्रभाव और प्रामाणिक चुआनमुटोंग सामग्री और संबंधित मिलावट के बीच अंतर को निर्धारित करने के लिए, विश्लेषण के लिए प्रक्षेपण (वीआईपी) में परिवर्तनीय महत्व का उपयोग करें।
    3. चुआनमुटोंग के विभिन्न घटकों का वीआईपी नक्शा बनाएं। वर्गीकरण पर प्रत्येक चर के प्रभाव का आकलन करने और समूहों के बीच अंतर में महत्वपूर्ण योगदान देने वाले घटकों को स्क्रीन करने के लिए परिणामी वीआईपी मानचित्र का उपयोग करें। विशिष्ट संचालन निम्नानुसार हैं:
      1. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में, मेनू में विश्लेषण पर क्लिक करें और क्रमपरिवर्तन पर क्लिक करें, क्रमपरिवर्तन की संख्या 200 पर सेट करें, और ओपीएलएस-डीए स्कोर मानचित्र के आर 2 और क्यू2 प्राप्त करें।
      2. वीआईपी पर क्लिक करें और वीआईपी मैप प्राप्त करने के लिए वीआईपी प्रेडिक्टिव चुनें।

4. एचपीएलसी द्वारा चुआनमुटोंग में β-सिटोस्टेरोल का निर्धारण

  1. क्रोमैटोग्राफिक स्थितियां (चरण 1.1 देखें)
    1. मोबाइल चरण तैयार करें: मेथनॉल-पानी (97: 3)।
    2. मोबाइल चरण की प्रवाह दर को 1.0 एमएल / मिनट पर सेट करें।
    3. 30 डिग्री सेल्सियस पर बनाए गए सी 18 कॉलम (250 मिमी x 4.6 मिमी, 5 μm) पर क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण का संचालन करें।
    4. इंजेक्शन की मात्रा को 10 μL पर सेट करें।
    5. 204 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर घटक का पता लगाएं।
  2. नमूना समाधान की तैयारी
    1. मेथनॉल में संबंधित संदर्भ मानक की सटीक रूप से तौलित मात्रा को भंग करके β-सिटोस्टेरॉल (0.1 मिलीग्राम / एमएल) का स्टॉक मानक समाधान तैयार करें।
    2. 180 μm ± 7.6 μm के आंतरिक व्यास के साथ नायलॉन जाल के माध्यम से नमूने को पारित करके कच्चे माल के विश्लेषण नमूने को एक समान कण आकार में पीस लें।
    3. एक गोल तल वाले फ्लास्क में 2 ग्राम ग्राउंड कच्चे माल (सटीक रूप से तौला गया) रखें और इसमें 50 एमएल क्लोरोफॉर्म जोड़ें।
    4. फ्लास्क को रिफ्लक्स कंडेनसर से कनेक्ट करें और इसे 60 मिनट के लिए उबलते पानी के स्नान (मध्यम उबलते) में गर्म करें। निष्कर्षण समाधान को 15-20 μm फ़िल्टर पेपर के साथ फ़िल्टर करें।
    5. लगभग 10 मिनट के लिए उबलते पानी के स्नान (मध्यम उबलते) पर छानने के लिए छानना बंद कर दें।
    6. अवशेषों को घोलें और मेथनॉल का उपयोग करके मात्रा को 5 एमएल तक बनाएं। अंत में, सतह पर तैरने वाले को 0.45 μm फ़िल्टर झिल्ली के माध्यम से पास करें, और इसे स्टैंडबाय पर रखें।
  3. विधि सत्यापन
    1. उप-चरण 4.2.1 में तैयार β-सिटोस्टेरॉल का स्टॉक समाधान लें, इसे 100% मेथनॉल के साथ पतला करें, और 100 μg / mL, 80μg / mL, 60μg / mL, 50μg / mL, 40 μg / mL, 30 `g / mL, और 20 μg / mL सांद्रता के साथ समाधान तैयार करें।
    2. पीक क्षेत्र निर्धारित करने के लिए चरण 4.1 में वर्णित क्रोमैटोग्राफिक स्थितियों के तहत नमूने इंजेक्ट करें, इंजेक्शन की मात्रा के लिए पीक क्षेत्र के साथ प्रतिगमन विश्लेषण करें, और इसकी रैखिकता का मूल्यांकन करने के लिए प्रतिगमन समीकरण और सहसंबंध गुणांक प्राप्त करें।
    3. ऊपर वर्णित (चरण 4.2) के अनुसार नमूने तैयार करें और उन्हें एक ही दिन में छह बार एचपीएलसी विश्लेषण (चरण 4.1) के अधीन करें। फिर परिशुद्धता का मूल्यांकन करने के लिए पीक क्षेत्रों के आरएसडी की गणना करें।
    4. चरण 4.1 में वर्णित 0, 2, 4, 6, 8, 12 और 24 घंटे के लिए आरटी में संग्रहीत समान नमूना समाधानों का विश्लेषण करके नमूना समाधान की स्थिरता का मूल्यांकन करें। फिर चरण 1.3.5 में वर्णित चरम क्षेत्रों के आरएसडी की गणना करें।
    5. चरण 4.2 में वर्णित के रूप में तैयार किए गए एक ही नमूने (सीएमटी -4) को भंग करके पुनरावृत्ति की जांच करें, और उन्हें चरण 4.1 में वर्णित एचपीएलसी विश्लेषण के अधीन करें। फिर छह नमूनों में β-सिटोस्टेरॉल सामग्री के आरएसडी की गणना करें।
    6. मानक अतिरिक्त विधि को नियोजित करके विधि की सटीकता का आकलन करें। इसके लिए, β-सिटोस्टेरॉल सामग्री के 80%, 100%, और 120% पर नमूनों में β-सिटोस्टेरॉल संदर्भ समाधान जोड़ें और चरण 4.1 में वर्णित प्रत्येक स्थिति को तीन बार दोहराएं। औसत वसूली और आरएसडी की गणना करके विधि की सटीकता का मूल्यांकन करें।
      नोट: वसूली की दर (आरआर) की गणना सूत्र निम्नानुसार है:
      RR % = [(Mt - M0)/ Ms] × 100
      जहां एम टी = मानक जोड़ने के बाद β-सिटोस्टेरॉल की गुणवत्ता, एम0 = नमूना समाधान की गुणवत्ता, और एमएस = β-सिटोस्टेरोल की गुणवत्ता।
  4. नमूनों की β-सिटोस्टेरॉल सामग्री का निर्धारण
    1. चरण 4.2 के अनुसार नमूना समाधान तैयार करने के लिए प्रामाणिक चीनी औषधीय सामग्री के 10 बैच और संबंधित मिलावट के पांच बैच लें।
    2. फिर चरण 4.1 में वर्णित शर्तों के तहत शिखर क्षेत्र निर्धारित करने के लिए प्रत्येक नमूना समाधान और β-सिटोस्टेरॉल संदर्भ समाधान इंजेक्ट करें, और बाहरी मानक एक-बिंदु विधि का उपयोग करके प्रत्येक नमूने की β-सिटोस्टेरोल सामग्री की गणना करें।

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Representative Results

चुआनमुटोंग के क्रोमैटोग्राफिक फिंगरप्रिंट और समानता विश्लेषण (एसए)
परिशुद्धता, पुनरावृत्ति और स्थिरता के सापेक्ष प्रतिधारण समय के आरएसडी मान क्रमशः 0.46%, 1.65% और 0.53% से नीचे थे; सापेक्ष पीक क्षेत्र के आरएसडी मान क्रमशः 4.23%, 3.56% और 3.96% से नीचे थे। जैसा कि आंकड़े 1 ए, बी में दिखाया गया है, 10 प्रामाणिक चुआनमुटोंग नमूनों में एचपीएलसी फिंगरप्रिंट में 12 अलग-अलग सामान्य चोटियां (चोटी 1 से शिखर 12 तक) थीं। चूंकि नंबर 10 का शिखर क्षेत्र अपेक्षाकृत बड़ा था, इसलिए रिज़ॉल्यूशन अच्छा था; चूंकि यह प्रत्येक नमूने में मौजूद एक घटक था, इसलिए इसे फिंगरप्रिंट की स्थिरता और प्रजनन क्षमता की जांच करने के लिए एक संदर्भ शिखर के रूप में उपयोग किया गया था। फिर, पीक नंबर 10 को संदर्भ शिखर (एस) के रूप में लिया गया था, और शेष 11 चोटियों के सापेक्ष प्रतिधारण समय की गणना की गई थी।

समानता विश्लेषण में, सहसंबंध गुणांक 1 के जितना करीब होता है, नमूनों के बीच समानता उतनी ही अधिक होती है। जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, चुआनमुटोंग के 10 बैचों की समानता डिग्री 0.910-0.989 थी। इन परिणामों से पता चला है कि चुआनमुटोंग के 10 बैचों में उच्च समानता और अच्छी स्थिरता थी, जिसका उपयोग चुआनमुटोंग की समग्र गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। जैसा कि चित्र 1 सी में दिखाया गया है, इसके मिलावट के पांच बैचों के फिंगरप्रिंट प्राप्त किए गए थे। मिलावट के पांच बैचों के फिंगरप्रिंट और चुआनमुटोंग के नियंत्रण फिंगरप्रिंट के बीच समानता केवल 0.133-0.720 (तालिका 1) थी, यह दर्शाता है कि प्रामाणिक नमूनों और संबंधित मिलावट के बीच स्पष्ट अंतर हैं। अंतर मुख्य रूप से 28-55 मिनट पर क्रोमैटोग्राम पर क्रोमैटोग्राफिक पीक संख्याओं में केंद्रित थे। इस प्रकार, चुआनमुटोंग के नियंत्रण फिंगरप्रिंट प्रभावी रूप से संबंधित मिलावट से प्रामाणिक नमूनों को अलग कर सकते हैं।

इस प्रयोग में सीए विश्लेषण के लिए एसपीएसएस 26 सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था (चित्रा 2 ए); नमूने के 15 बैचों को दो श्रेणियों में विभाजित किया गया था जब वर्गीकरण दूरी 20 थी। पहली श्रेणी चुआनमुटोंग और इसके अभ्यस्त मिलावट (सीसी) के 10 बैच थे। दूसरी श्रेणी डीसी, डीई, एक्सएस और एसएमटी सहित चुआनमुटोंग के मिलावटकर्ता थे। जब वर्गीकरण दूरी चार थी, तो सभी नमूनों को चार श्रेणियों में विभाजित किया गया था। पहली श्रेणी में चुआनमुटोंग के 10 बैच थे, दूसरी श्रेणी सीसी थी, तीसरी श्रेणी एसएमटी और एक्सएस थी, और चौथी श्रेणी डीसी और डीई थी। वर्गीकरण के परिणामों से पता चला कि चुआनमुटोंग की प्रामाणिक किस्मों की गुणवत्ता मूल रूप से समान थी, और सभी मिलावटों के साथ स्पष्ट अंतर थे। इसी समय, अन्य मिलावटों की तुलना में, सीसी चुआनमुटोंग की प्रामाणिक विविधता के करीब था, लेकिन वर्गीकरण दूरी संकुचित होने पर इसे अभी भी अलग किया जा सकता है।

नमूनों के 15 बैचों के सामान्य शिखर क्षेत्रों को पीसीए विश्लेषण के लिए डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में आयात किया गया था, और स्कोर मैट्रिक्स (आर2एक्स = 0.994, क्यू2 = 0.961) (चित्रा 2 बी) ने दिखाया कि नमूनों के 15 बैचों का क्लस्टरिंग प्रभाव स्पष्ट था। वाई-अक्ष के दाईं ओर चुआनमुटोंग और सीसी के 10 बैच थे। उनमें से, सीसी पहले क्वाड्रंट में स्थित था, जो चुआनमुटोंग की प्रामाणिक किस्मों से अलग है। वाई-अक्ष का बाईं ओर एसएमटी, एक्सएस, डीई और डीसी सहित मिलावट थी। उनमें से, एसएमटी और एक्सएस दूसरे क्वाड्रंट में स्थित थे, और डीई और डीसी तीसरे क्वाड्रंट में स्थित थे। चुआनमुटोंग और पारंपरिक मिलावट की प्रामाणिक किस्मों की तुलना करते समय, सीसी और प्रामाणिक किस्मों के बीच का अंतर अपेक्षाकृत छोटा है, जबकि प्रामाणिक और अन्य मिलावट के बीच का अंतर स्पष्ट है।

चुआनमुटोंग और इसके मिलावट के सामान्य शिखर क्षेत्र को एक चर के रूप में इस्तेमाल किया गया था, ओपीएलएस-डीए के लिए डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में आयात किया गया था, और फिर स्कोर मैट्रिक्स तैयार किया गया था (चित्रा 3 ए)। ओपीएलएस-डीए मॉडल का आर2एक्स [1] 0.695 था, और आर2एक्स [2] 0.605 था, जिनमें से दोनों 0.5 से अधिक हैं, यह दर्शाता है कि मॉडल स्थिर और विश्वसनीय है और इसका उपयोग मिलावट से प्रामाणिक नमूनों को अलग करने के लिए किया जा सकता है।

चित्रा 3 ए से यह देखा जा सकता है कि प्रामाणिक और अन्य मिलावट के नमूना बिंदु पूरी तरह से अलग हो गए थे, और नमूना बिंदुओं के बीच कोई चौराहा नहीं था। सभी नमूनों को तीन भागों में विभाजित किया गया था। चुआनमुटोंग और सीसी की प्रामाणिक किस्में समान थीं। एक्सएस, डीसी और डीई के नमूनों को एक वर्ग में वर्गीकृत किया गया था, और एसएमटी का नमूना अंतिम कक्षा था। इसके अलावा, प्रक्षेपण (वीआईपी) (चित्रा 3 बी) में परिवर्तनीय महत्व की निर्णय विधि का उपयोग प्रत्येक नमूने के फिंगरप्रिंट में विभिन्न घटकों की चोटियों को स्क्रीन करने के लिए किया गया था। वीआईपी > 1.0 को नमूना समूहों के बीच वर्गीकरण में बहुत योगदान देने वाले सेवेब चर को स्क्रीन करने के लिए मानक के रूप में लिया गया था। स्क्रीनिंग परिणामों के अनुसार, मुख्य मार्कर घटक जो प्रामाणिक नमूनों और मिलावट के बीच संरचना में अंतर का कारण बने, वे चोटी नंबर 9, नंबर 5, नंबर 7, नंबर 6, नंबर 10, नंबर 3 और नंबर 2 थे। शेष चोटियों का वीआईपी मूल्य 1 से कम था, जिसका नमूनों के भेदभाव पर बहुत कम प्रभाव पड़ा।

प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग करके β-सिटोस्टेरॉल पीक क्षेत्र और इसके समाधान एकाग्रता के बीच रैखिक संबंध पाया गया था। इस निर्भरता ने समीकरण Y = 5.4918 X-4.5563 का पालन किया, जहां Y β-सिटोस्टेरोल शिखर क्षेत्र है और X μg/mL में β-सिटोस्टेरॉल सामग्री है। इसके साथ ही, सहसंबंध गुणांक आर = 0.9995, जो आवश्यकताओं को पूरा करता है। सटीक परीक्षण, स्थिरता परीक्षण और पुनरावृत्ति परीक्षण का आरएसडी क्रमशः 1.76%, 4.22% और 3.85% था। परिणाम बताते हैं कि β-सिटोस्टेरॉल सामग्री की निर्धारण विधि में अच्छी रैखिकता, परिशुद्धता और पुनरावृत्ति थी, और नमूना समाधान 24 घंटे के भीतर स्थिर था। तीन स्तरों पर औसत प्रतिशत वसूली 101.50%, 101.90% और 100.72% थी; संबंधित आरएसडी क्रमशः 2.56%, 1.56% और 1.68% था। सैद्धांतिक और वास्तविक निर्धारित मूल्यों के बीच अच्छे समझौतों ने विश्लेषण के लिए विधि की सटीकता और प्रयोज्यता की पुष्टि की। β-सिटोस्टेरॉल के तरल क्रोमैटोग्राम को चित्रा 4 में दिखाया गया है, और नमूनों के 15 बैचों में β-सिटोस्टेरॉल की सामग्री निर्धारित की गई थी (तालिका 2)। परिणामों से पता चला है कि प्रामाणिक नमूनों के 10 बैचों में β-सिटोस्टेरॉल की एकाग्रता 97.53-161.56 μg / g (अपेक्षाकृत स्थिर) की सीमा में थी। इस घटक को मिलावट के सभी पांच बैचों में पाया गया था, लेकिन सामग्री बहुत भिन्न थी।

Figure 1
चित्र 1: चुआनमुटोंग और उनके मिलावट के फिंगरप्रिंट। (ए) प्रामाणिक चुआनमुटोंग नमूनों के 10 बैचों के फिंगरप्रिंट (एस 1: सीएमटी -1, एस 2: सीएमटी -2, एस 3: सीएमटी -3, एस 4: सीएमटी -4, एस 5: सीएमटी -5, एस 6: सीएमटी -6, एस 7: सीएमटी -7, एस 8: सीएमटी -8, एस 9: सीएमटी -9, एस 10: सीएमटी -10)। (बी) प्रामाणिक चुआनमुटोंग नमूनों के संदर्भ क्रोमैटोग्राम फिंगरप्रिंट; सापेक्ष प्रतिधारण समय 0.18 (पीक नंबर 1), 0.22 (पीक नंबर 2), 0.29 (पीक नंबर 3), 0.72 (पीक नंबर 4), 0.75 (पीक नंबर 5), 0.82 (पीक नंबर 6), 0.86 (पीक नंबर 7), 0.92 (पीक नंबर 8), 0.96 (पीक नंबर 9), 1.00 (पीक नंबर 10), 1.00 (पीक नंबर 10), 1.00 (पीक नंबर 10), 1.00 (पीक नंबर 10), 1.00 (पीक नंबर 10), 1.00 (पीक नंबर 10), 1.00 (पीक नंबर 10), 1.00 (पीक नंबर 4), 0.75 (पीक नंबर 5), 0.82 (पीक नंबर 6), 0.86 (पीक नंबर 7), 0.92 (पीक नंबर 1), 0.00 (पीक नंबर 10), 1.00 (पीक नंबर 10), 1.00 (पीक नंबर 10), 1.00 (पीक नंबर 10), 1.00 (पीक नंबर 10), 1.00 (पीक नंबर 10), 1.00 (पीक नंबर 10), 1.00 (पीक नंबर 10), 0.02 (पीक नंबर 4), 0.75 (पीक नंबर 5), 0.82 (पीक नंबर 6), 0.86 (पीक नंबर 7), 0.92 (पीक नंबर 8), 0.96 (पीक नंबर 9), 1.00 (पीक नंबर 10), 1.00 (पीक नंबर 10), 1.00 (पीक नंबर 10), 1.00 (पीक नंबर 10), (सी) चुआनमुटोंग मिलावट के पांच बैचों के फिंगरप्रिंट (एस 1: सीसी, एस 2: डीसी, एस 3: डीई, एस 4: एक्सएस, एस 5: एसएमटी)। (डी) प्रामाणिक चुआनमुटोंग नमूनों के संदर्भ क्रोमैटोग्राम फिंगरप्रिंट और उनके मिलावट के पांच बैचों के बीच तुलना (एस 1: संदर्भ क्रोमैटोग्राम फिंगरप्रिंट, एस 2: सीसी, एस 3: डीसी, एस 4: डीई, एस 5: एक्सएस, एस 6: एसएमटी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: सीए और पीसीए प्रामाणिक चुआनमुटोंग नमूनों के 10 बैचों और मिलावट के पांच बैचों का विश्लेषण। (बी) पीसीए विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: ओपीएलएस-डीए स्कोर मानचित्र और प्रामाणिक चुआनमुटोंग नमूनों के 10 बैचों और मिलावट के पांच बैचों का वीआईपी स्कोर मानचित्र। (बी) वीआईपी स्कोर मैप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: β-सिटोस्टेरॉल का तरल क्रोमैटोग्राम। एस 1: β-सिटोस्टेरॉल, एस 2: सीएमटी -4, एस 3: एक्सएस, एस 4: डीसी, एस 5: एसएमटी, एस 6: सीसी, एस 7: डीई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नमूने नाम समानता
चुआनमुटोंग की वास्तविक किस्में सीएमटी -1 0.947
सीएमटी -2 0.910
सीएमटी -3 0.989
सीएमटी -4 0.937
सीएमटी -5 0.989
सीएमटी -6 0.988
सीएमटी -7 0.956
सीएमटी -8 0.959
सीएमटी -9 0.939
सीएमटी -10 0.966
व्यभिचारी प्रतिलिपि 0.599
डीसी 0.720
डी 0.133
XS 0.694
श्रीमती 0.180

तालिका 1: प्रामाणिक चुआनमुटोंग नमूनों और उनके मिलावट के 10 बैचों की समानता के परिणाम। चीनी चिकित्सा क्रोमैटोग्राफिक फिंगरप्रिंट मूल्यांकन प्रणाली में प्रासंगिक डेटा आयात करके, प्रामाणिक चुआनमुटोंग नमूनों के 10 बैचों और मिलावट के पांच बैचों की समानता की गणना की गई थी।

नमूने नाम सामग्री (μg/g)
चुआनमुटोंग की वास्तविक किस्में सीएमटी -1 103.5
सीएमटी -2 124.6
सीएमटी -3 131
सीएमटी -4 121.1
सीएमटी -5 97.5
सीएमटी -6 113.8
सीएमटी -7 105.6
सीएमटी -8 161.6
सीएमटी -9 118
सीएमटी -10 123.5
व्यभिचारी प्रतिलिपि 157.4
डीसी 165.6
डी 32.9
XS 69.7
श्रीमती 192.2

तालिका 2: प्रामाणिक चुआनमुटोंग नमूनों और उनके मिलावट में β-सिटोस्टेरॉल सामग्री के निर्धारण परिणाम।

पूरक चित्रा 1: विभिन्न नमूना तैयारी स्थितियों और विभिन्न क्रोमैटोग्राफिक स्थितियों के तहत तरल क्रोमैटोग्राफी। (ए) मोबाइल चरण प्रणाली (एस 1: एसिटोनिट्राइल -0.1% फॉर्मिक एसिड समाधान, एस 2: एसिटोनिट्राइल -0.5% एसिटिक एसिड समाधान, एस 3: एसिटोनिट्राइल-शुद्ध पानी, एस 4: एसिटोनिट्राइल -0.05% फॉस्फोरिक एसिड समाधान, एस 5: मेथनॉल-शुद्ध पानी)। (बी) डिटेक्शन तरंग दैर्ध्य (एस 1: 205 एनएम, एस 2: 230 एनएम, एस 3: 250 एनएम, एस 4: 300 एनएम)। (सी) कॉलम तापमान (एस 1: 20 डिग्री सेल्सियस, एस 2: 30 डिग्री सेल्सियस, एस 3: 40 डिग्री सेल्सियस)। (डी) प्रवाह दर (एस 1: 0.8 एमएल / मिनट, एस 2: 0.9 एमएल / मिनट, एस 3: 1.0 एमएल / मिनट)। (ई) निष्कर्षण विधियां (एस 1: अल्ट्रासोनिक निष्कर्षण, एस 2: रिफ्लक्स निष्कर्षण)। (एफ) निष्कर्षण सॉल्वैंट्स (एस 1: एथिल एसीटेट, एस 2: इथेनॉल, एस 3: क्लोरोफॉर्म, एस 4: एन-बुटानॉल, एस 5: मेथनॉल)। (जी) निष्कर्षण समय (एस 1: 15 मिनट, एस 2: 30 मिनट, एस 3: 60 मिनट)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: एर्गोस्टेरॉल, स्टिग्मास्टेरॉल और प्रामाणिक चुआनमुटोंग का तरल क्रोमैटोग्राम। एस 1: स्टिग्मास्टेरॉल, एस 2: एर्गोस्टेरॉल, एस 3: सीएमटी -4। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

अनुसंधान के लिए नमूना संग्रह चीनी औषधीय सामग्रियों की प्रामाणिकता की पहचान करने में बहु-पैटर्न मान्यता के निर्माण के लिए पहला महत्वपूर्ण कदम है। बाजार अनुसंधान के माध्यम से, हमने पाया कि सिचुआन यान, लियांगशान और लेशान चुआनमुटोंग के जंगली संसाधनों के मुख्य उत्पादन क्षेत्र हैं। एक ही जीनस की संबंधित किस्मों का भौगोलिक वितरण भीसमान है 6,20; सीसी, डीसी, डीई, एक्सएस और एसएमटी का अक्सर चुआंगमुटोंग16,21 के रूप में दुरुपयोग किया जाता है; इसलिए, इस अध्ययन में, प्रामाणिक चुआनमुटोंग के 10 बैच और मिश्रित नमूनों के पांच बैच मूल के उपर्युक्त स्थानों में एकत्र किए गए थे, और किस्मों की सटीकता की पुष्टि की गई थी।

दूसरा महत्वपूर्ण कदम एचपीएलसी फिंगरप्रिंट की पहचान की स्थिति को स्क्रीन करना है, जो रासायनिक घटकों के बारे में जितना संभव हो उतना जानकारी प्रदर्शित कर सकता है। इस अध्ययन में, जैसा कि पूरक चित्र 1 में दिखाया गया है, क्रोमैटोग्राफिक चोटियों की संख्या और क्षेत्र विभिन्न तैयारी स्थितियों के तहत प्राप्त किए गए थे, जिसमें निष्कर्षण विधियां, निष्कर्षण सॉल्वैंट्स और निष्कर्षण समय शामिल थे। चुआनमुटोंग नमूना समाधान की इष्टतम तैयारी विधि निर्धारित की गई थी। दूसरी ओर, विभिन्न क्रोमैटोग्राफिक स्थितियों के तहत नमूनों के क्रोमैटोग्राफिक चोटियों की संख्या और रिज़ॉल्यूशन की तुलना की गई थी। मोबाइल चरण प्रणालियां, जैसे एसिटोनिट्राइल -0.1% फॉर्मिक एसिड समाधान, एसिटोनिट्राइल -0.5% एसिटिक एसिड समाधान, एसिटोनिट्राइल-शुद्ध पानी, एसिटोनिट्राइल -0.05% फॉस्फोरिक एसिड समाधान, और मेथनॉल-शुद्ध पानी, डिटेक्शन तरंग दैर्ध्य, जैसे 205 एनएम, 230 एनएम, 250 एनएम, और 300 एनएम, कॉलम तापमान, जैसे 20 डिग्री सेल्सियस, 30 डिग्री सेल्सियस, और 40 डिग्री सेल्सियस। जांच की गई। चुआनमुटोंग के नमूनों का विश्लेषण करने के लिए इष्टतम क्रोमैटोग्राफिक स्थितियां निर्धारित की गईं। इसके अलावा, इसकी व्यवहार्यता की पुष्टि पद्धतिगत सत्यापन द्वारा की गई थी, और चुआनमुटोंग के एचपीएलसी फिंगरप्रिंट की पहचान विधि का सफलतापूर्वक निर्माण किया गया था।

तीसरा महत्वपूर्ण कदम प्रामाणिक चीनी चिकित्सा और उसके मिलावट के फिंगरप्रिंट में अलग-अलग जानकारी का विश्लेषण और खोज करना है। इस अध्ययन में, सबसे पहले, एसईएससीएफ-टीसीएम (2012 संस्करण) का उपयोग करके फिंगरप्रिंट की समानता का विश्लेषण किया गया था। यह पाया गया कि प्रामाणिक चुआनमुटोंग नमूनों के 10 बैचों के फिंगरप्रिंट और नियंत्रण विशेषता फिंगरप्रिंट के बीच समानता बहुत अधिक थी। इसकी तुलना में, मिलावट के पांच बैचों के फिंगरप्रिंट और नियंत्रण विशेषता फिंगरप्रिंट के बीच समानता प्रामाणिक नमूनों की तुलना में काफी कम थी। सीए, पीसीए और ओपीएलएस-डीए को रासायनिक फिंगरप्रिंट की सामान्य चरम जानकारी का विश्लेषण करने के लिए आगे पेश किया गया था। सीए और पीसीए दोनों परिणामों से पता चलता है कि विभिन्न मिलावटों के बीच आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला मिलावट सीसी प्रामाणिक के अपेक्षाकृत करीब है, जिसे भेद करना मुश्किल है। हालांकि, जब सीए की वर्गीकरण दूरी को चार में संशोधित किया जाता है, तो प्रामाणिक और मिलावट के बीच प्रभावी पहचान प्राप्त की जा सकती है। प्रामाणिक सामग्री की 12 सामान्य चोटियों के आधार पर, मिलावटखोरों के अंतर चोटियों के योगदान मूल्यों का मात्रात्मक मूल्यांकन ओपीएलएस-डीए द्वारा किया गया था, और सात अंतर क्रोमैटोग्राफिक चोटियों, अर्थात् पीक नंबर 9, पीक नंबर 5, पीक नंबर 7, पीक नंबर 6, पीक नंबर 10, पीक नंबर 3 और पीक नंबर 2 प्राप्त किए गए थे। इनका उपयोग चुआनमुटोंग की प्रामाणिक और नकली सामग्रियों की प्रभावी ढंग से पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जो प्रामाणिक और मिलावट के बीच अंतर के मुख्य चिह्नित घटक हैं।

चीनी फार्माकोपिया के नवीनतम संस्करण में अभी तक चुआनमुटोंग के प्रभावी घटकों की सामग्री निर्धारण शामिल नहीं है। अपने गुणवत्ता नियंत्रण में सुधार करने के लिए, इस अध्ययन ने सक्रिय घटकों जैसे β-सिटोस्टेरॉल, एर्गोस्टेरॉल, सिटोस्टेरॉल और ओलेनोलिक एसिड के सामग्री निर्धारण विधियों की जांच की, जो पिछलीरिपोर्टों 22,23,24,25,26 में मूत्रवर्धक कार्रवाई से संबंधित थे। जैसा कि पूरक चित्र 2 में दिखाया गया है, प्रामाणिक चुआनमुटोंग में एर्गोस्टेरॉल का पता नहीं लगाया गया था, और क्रोमैटोग्राम में स्टिग्मास्टेरोल को अलग करना मुश्किल था और इसे सटीक रूप से परिमाणित नहीं किया जा सकता था। अंत में, β-सिटोस्टेरॉल की सामग्री निर्धारण विधि स्थापित की गई थी; पता लगाने के परिणामों से पता चला है कि प्रामाणिक चुआनमुटोंग नमूनों के 10 बैचों और मिलावट के पांच बैचों में β-सिटोस्टेरॉल पाया गया था। इसलिए, β-सिटोस्टेरॉल वास्तविक औषधीय सामग्रियों के लिए अद्वितीय नहीं था। यद्यपि चुआनमुटोंग की गुणवत्ता के बारे में कुछ जानकारी प्रदान की जा सकती है, फिर भी भविष्य में उंगलियों के निशान में अंतर क्रोमैटोग्राफिक चोटियों का विश्लेषण करना आवश्यक है, यह देखने के लिए कि क्या चुआनमुटोंग की प्रभावकारिता से संबंधित विशिष्ट घटक पाए जा सकते हैं।

वर्तमान में, पारंपरिक चीनी दवाओं को अक्सर रासायनिक फिंगरप्रिंट स्पेक्ट्रम की समानता से पहचाना जाता है। हालांकि, यह संकेतक नमूना क्रोमैटोग्राफिक चोटियों की समग्र जानकारी के आधार पर एक पैरामीटर है, जो पहचान और विभिन्न नमूनों के मुख्य अंतर के बारे में अधिक जानकारी प्रदान नहीं कर सकता है। इसलिए, इस अध्ययन ने रासायनिक उंगलियों के निशान की सामान्य चरम जानकारी की पहचान करने के लिए सीए, पीसीए और ओपीएलएस-डीए का उपयोग किया, चुआनमुटोंग के प्रामाणिक और मिलावटी नमूनों के बीच मुख्य अंतर क्रोमैटोग्राफिक चोटियों को पाया, और सफलतापूर्वक उनकी पहचान की। अंत में, बहु-पैटर्न मान्यता के लिए एचपीएलसी-युग्मित रासायनिक फिंगरप्रिंटिंग का निर्माण किया गया था।

चूंकि प्रामाणिक चीनी औषधीय सामग्रियों और उनके मिलावटखोरों को मिलाना असामान्य नहीं है, जैसे कि फ्रिटिलारिया थुनबर्गी, हर्बा असारी, और लोनिकेरा जापोनिका, यह विधि प्रामाणिक चीनी औषधीय सामग्रियों और उनके मिलावट की स्पष्ट और वैज्ञानिक पहचान के लिए एक नई रणनीति प्रदान करेगी। नैदानिक अनुप्रयोग में चीनी औषधीय सामग्री की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए यह रणनीति बहुत महत्वपूर्ण होगी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को सिचुआन पारंपरिक चीनी चिकित्सा प्रशासन की परियोजना (संख्या 2020 जेसी0088, संख्या 2021एमएस 203) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2017381038
Acetonitrile Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, China WXBD5243V
β-Sitosterol Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China 20210201
 C18 column Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China Welch Ultimate LP
Chuanmutong Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China  19020103 CMT-1
Chuanmutong Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200701 CMT-2
Chuanmutong Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200701 CMT-3
Chuanmutong Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200901 CMT-4
Chuanmutong Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  210701 CMT-5
Chuanmutong Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  210401 CMT-6
Chuanmutong Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200901 CMT-7
Chuanmutong Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China  201201 CMT-8
Chuanmutong Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China  201001 CMT-9
Chuanmutong Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 210501 CMT-10
Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China  - CC
Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China  - DC
Clematis peterae Hand.-Mazz. Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China  - DE
Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China  - XS
Clematis finetiana Levl. et Vaniot. Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China  - SMT
Electronic balance Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai,  China  FA1204
Ergosterol Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China 20210201
Ethanol Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 2021112602
Ethyl acetate Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2017042043
Formic acid Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 2016062901
High performance liquid chromatography Agilent, USA. 1260
IBM SPSS Statistics version 26.0 International Business Machines Corporation, USA -
Methanol Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, China WXBD6409V
Methanol Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 202010302
n-butyl alcohol Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2020071047
Petroleum ether Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2020090125
Phosphoric acid Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 20200110
SESCF-TCM version 2012 National Pharmacopoeia Commission, China - http://114.247.108.158:8888/login
Stigmasterol Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China 20210201
Trichloromethane Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China 20200214
Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 Umetrics, Sweden - https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download
Ultrapure water machine Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China UPH-II-10T
Ultrasonic cleaner Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China KH3200E

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References

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