Summary
Qui, presentiamo un protocollo per stabilire la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), accoppiata con il riconoscimento multi-pattern delle impronte digitali chimiche, che fornisce una nuova strategia per identificare efficacemente le varietà autentiche di Clematidis Armandii Caulis e dei suoi adulteranti.
Abstract
Un metodo per identificare i materiali medicinali cinesi e i relativi adulteranti è stato costruito prendendo come esempio Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, una medicina tradizionale cinese universalmente usata). Dieci lotti di varietà Chuanmutong autentiche e cinque lotti di adulteranti correlati sono stati analizzati e confrontati sulla base delle impronte digitali della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) combinate con la chemiometria, tra cui l'analisi dei cluster (CA), l'analisi delle componenti principali (PCA) e l'analisi della discriminazione dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS-DA). Inoltre, è stato determinato il contenuto di β-sitosterolo. È stata stabilita l'impronta chimica di controllo di Chuanmutong e sono stati identificati 12 picchi comuni. La somiglianza tra l'impronta digitale di 10 lotti di varietà Chuanmutong autentiche e l'impronta digitale di controllo era 0,910-0,989, mentre la somiglianza di cinque lotti di adulteranti era solo 0,133-0,720. Sulla base dei picchi comuni nel cromatogramma, 15 lotti di campioni sono stati classificati in tre livelli di contenuto dalla PCA e sono stati aggregati in quattro categorie da CA, ottenendo una chiara distinzione tra Chuanmutong autentico e adulteranti di Chuanmutong. Inoltre, sette componenti differenziali che possono identificare efficacemente l'autentico Chuanmutong e gli adulteranti di Chuanmutong sono stati trovati attraverso OPLS-DA. Il contenuto di β-sitosterolo di 10 lotti di varietà Chuanmutong autentiche era 97,53-161,56 μg / g, mentre il contenuto di β-sitosterolo dei cinque lotti di adulteranti variava notevolmente, tra cui il contenuto di β-sitosterolo di Clematis peterae Hand.-Mazz. e Clematis gouriana Roxb. finetii Rehd. et Wils. era significativamente inferiore a quello delle varietà autentiche di Chuanmutong. Il contenuto dei componenti dell'indice HPLC e il metodo di riconoscimento multi-pattern delle impronte digitali chimiche stabilito in questo studio forniscono una nuova strategia per identificare efficacemente i materiali medicinali cinesi autentici e i relativi adulteranti.
Introduction
Chuanmutong, Caulis secco di Clematis armandii Franch. o Clematis montana Buch.-Ham., è una medicina tradizionale cinese comunemente usata nelle cliniche 1,2,3. È usato per il trattamento di problemi urinari, edema, piaghe sulla lingua e sulla bocca, diminuzione della secrezione di latte, rigidità articolare e dolori muscolari causati dal calore umido4. Chuanmutong è sempre stato ottenuto da varietà selvatiche, distribuite principalmente nel sud-ovest della Cina, in particolare nel Sichuan, dove la migliore qualità può essere trovata 5,6. È difficile distinguere tra varietà autentiche e adulteranti strettamente correlati a causa delle loro caratteristiche simili 7,8,9,10. Lo standard di qualità di Chuanmutong nell'edizione 2020 della Farmacopea cinese stabilisce solo le proprietà, l'identificazione microscopica e l'identificazione dello strato sottile senza determinazione del contenuto, che non possono identificare efficacemente gli adulteranti e quindi hanno potenziali rischi. Inoltre, ci sono pochi rapporti che confrontano e identificano Chuanmutong e piante correlate. Di conseguenza, un metodo di controllo della qualità per garantire l'autenticità di Chuanmutong merita ulteriori studi.
I costituenti chimici di Chuanmutong sono composti principalmente da triterpenoidi pentaciclici di tipo oleanano e dai loro glicosidi, flavonoidi e acidi organici11,12,13,14. Tra questi, l'acido oleanolico, il β-sitosterolo, lo stigmasterolo e l'ergosterolo hanno effetti diuretici di diversa intensità, che possono essere potenziali sostanze farmacodinamiche per promuovere la diuresi e alleviare la stranguria15,16. Le impronte digitali chimiche sono ottenute separando e rilevando molti componenti chimici contenuti nei campioni mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), gascromatografia (GC), ecc. L'adozione di appropriati metodi di analisi statistica per analizzare le caratteristiche di Chuanmutong può determinare il controllo complessivo della qualità e l'identificazione scientifica della medicina tradizionale cinese17,18,19.
In questo studio sono stati raccolti 10 lotti di varietà autentiche Chuanmutong e cinque lotti di adulteranti. La loro qualità è stata confrontata e analizzata con il metodo delle impronte digitali HPLC combinato con il riconoscimento multi-pattern, tra cui l'analisi dei cluster (CA), l'analisi delle componenti principali (PCA), l'analisi della discriminazione dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS-CA) e la determinazione del contenuto della componente farmacodinamica. Questo protocollo stabilisce un metodo per identificare varietà autentiche con elevata specificità, una nuova strategia per l'identificazione scientifica di varietà autentiche e adulteranti di materiali medicinali cinesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Metodi per il rilevamento chimico delle impronte digitali
- Condizioni cromatografiche
- Preparare la fase mobile acetonitrile (A)/acqua (B). Impostare un programma di gradiente come segue nel software HPLC: 0-20 min, 3% A-10% A; 20-25 min, 10%A-13%A; 25-65 min, 13%A-25%A; 65-75 min, 25%A-40%A; 75-76 min, 40%A-3%A; 76-85 min, 3%A-3%A.
- Mantenere la portata della fase mobile a 1,0 ml/min.
- Effettuare la separazione cromatografica su una colonna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) mantenuta a 30 °C.
- Impostare il volume di iniezione su 10 μL.
- Rilevare i campioni a una lunghezza d'onda di 205 nm.
NOTA: Per le impostazioni specifiche delle condizioni cromatografiche, fare riferimento alle procedure operative del software funzionante di cromatografia liquida ad alte prestazioni (Tabella dei materiali).
- Preparazione della soluzione campione
- Macinare le materie prime per uniformare la dimensione delle particelle facendole passare attraverso una rete di nylon con un diametro interno di 850 μm ± 29 μm.
- Introdurre 2 g di materia prima macinata (accuratamente pesata) in un matraccio conico da 50 mL con tappo e aggiungere 50 mL di metanolo. Posizionare il tappo sul pallone e ultrasonicare (600 W, 40 kHz) per 30 minuti.
- Quindi, raffreddare il matraccio a temperatura ambiente (RT). Pesare nuovamente i campioni e compensare il peso iniziale sostituendo l'estrattore perso.
- Versare 4 mL della soluzione di metanolo contenente gli estratti medicinali in un matraccio tarato da 10 ml. Aggiungere 6 ml di H2O, mescolare e lasciare riposare per 10 minuti.
- Infine, filtrare il surnatante attraverso una membrana filtrante da 0,45 μm e metterlo in standby.
- Convalida dei metodi di rilevamento delle impronte digitali
- Preparare il campione come descritto sopra (fase 1.2) e sottoporlo ad analisi HPLC (fase 1.1) sei volte al giorno. Per valutare la precisione, calcolare la deviazione standard relativa (RSD) del tempo di ritenzione relativo e delle aree relative di picco come descritto al punto 1.3.5.
- Valutare la stabilità della soluzione campione analizzando la stessa soluzione campione memorizzata in RT per 0, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 ore e calcolare l'RSD del tempo di ritenzione relativo e delle relative aree di picco come descritto nel passaggio 1.3.5.
- Prelevare sei repliche dello stesso campione (CMT-4), preparare la soluzione campione secondo la procedura precedente (fase 1.2) e rilevare la sua impronta digitale in HPLC dopo la fase 1.1. Calcolare l'RSD del tempo di ritenzione relativo e delle aree di picco relative e valutarne la ripetibilità come descritto nel passaggio 1.3.5.
- Quindi utilizzare il picco numero 10 nella Figura 1B come picco di riferimento e calcolare l'RSD del tempo di ritenzione relativo e dell'area relativa del picco di ciascun picco comune come descritto nel passaggio 1.3.5.
- Utilizzare le formule indicate di seguito per calcolare il tempo di ritenzione relativo e l'area relativa del picco di ciascun picco comune:
T re = Caratteristica T/Triferimento
Are = Unacaratteristica/Unriferimento
Dove T re = tempo di ritenzione relativo, T caratteristica = tempo di ritenzione del picco caratteristico, T riferimento = tempo di ritenzione del picco di riferimento, A re = area relativa del picco, A caratteristica = area caratteristica del picco e A riferimento = area del picco di riferimento.
NOTA: L'istituzione delle impronte digitali della medicina tradizionale cinese richiede generalmente la selezione di un picco cromatografico facile da ottenere e ad alta risoluzione. Questo viene utilizzato come picco di riferimento per identificare le impronte digitali ed esaminarne la stabilità e la riproducibilità.
2. Istituzione dell'impronta digitale di Chuanmutong e analisi della somiglianza
- Utilizzare 10 lotti di campioni autentici e cinque lotti di adulteranti come Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang (CC), Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. (DC), Clematis peterae Hand.-Mazz. (DE), Clematis gouriana Roxb. finetii Rehd. et Wils (XS), e Clematis finetiana Levl. et Vaniot. (SMT) come campioni per l'analisi delle impronte digitali.
- Preparare le soluzioni di esempio come descritto al punto 1.2. Eseguire l'analisi delle impronte digitali di tutte le soluzioni campione mediante HPLC in base alle condizioni descritte al punto 1.1.
- Importare i dati rilevanti nel sistema di valutazione della somiglianza delle impronte digitali cromatografiche della medicina tradizionale cinese (SESCF-TCM, versione 2012). Il sistema designerà i picchi con altezza ragionevole e buona risoluzione nei cromatogrammi di tutti i campioni come picchi comuni.
NOTA: Il software SESCF-TCM può essere scaricato dopo la registrazione sul sito web della Commissione della farmacopea cinese (http://114.247.108.158:8888/login).- Nel software, fare clic sul pulsante Imposta spettro di riferimento nel menu.
- Quindi, nella finestra Impostazioni parametri , impostare la larghezza della finestra temporale su 0,5 e selezionare Metodo di generazione dello spettro di controllo come metodo mediano.
- Fare clic su Calibrazione multipunto nel menu principale, quindi selezionare Peak Matching come Full Spectrum Peak Matching.
- Infine, fare clic su Genera controllo per generare l'impronta cromatografica di riferimento della specie autentica di Chuanmutong.
- Importare il tempo di conservazione e l'area di picco di 10 lotti di campioni Chuanmutong autentici e cinque lotti di adulteranti in SESCF-TCM per l'analisi. Le operazioni specifiche sono le seguenti:
- Nel software, fare clic sul pulsante Imposta spettro di riferimento nel menu principale.
- Nella finestra Impostazioni parametri , impostare l'impronta digitale cromatografica di riferimento delle specie autentiche di Chuanmutong come riferimento, selezionare il metodo di generazione dello spettro di controllo come metodo mediano e impostare la larghezza della finestra temporale su 0,5.
- Fare clic su Calibrazione multipunto nel menu principale, quindi selezionare Peak Matching come Full Spectrum Peak Matching.
- Infine, fai clic su Calcola somiglianza per calcolare la somiglianza in base alle impronte digitali del cromatogramma di riferimento di Chuanmutong. Infine, calcola la somiglianza delle impronte digitali utilizzando il sistema di valutazione delle impronte digitali cromatografiche della medicina cinese (versione 2012).
NOTA: Per le operazioni specifiche, fare riferimento alle specifiche operative del Sistema di Valutazione delle Impronte Digitali Cromatografiche di Medicina Cinese (versione 2012).
3. Analisi di riconoscimento multi-pattern dell'impronta digitale Chuanmutong
- Analisi dei cluster (CA)
- Utilizzare le aree di picco di 12 picchi comuni nelle impronte digitali di 10 lotti di campioni Chuanmutong autentici e dei loro cinque lotti di adulteranti come variabili e inserirli nel software di analisi statistica per l'analisi sistematica dei cluster (CA).
- Scegliere il metodo Between-Groups e utilizzare il coefficiente di correlazione di Pearson come base di classificazione per disegnare un diagramma di analisi dei cluster di Chuanmutong e dei suoi adulteranti. Le operazioni specifiche sono le seguenti:
- Nel software di analisi statistica, fare clic su File per importare i dati.
- Fare clic su Analisi nel menu e quindi fare clic su Clustering di sistema in Classificazione.
- Selezionare l'area di picco comune come variabile e impostare il numero di cluster su quattro.
- Fare clic su Metodo (Method), selezionare il metodo di clustering come Inter-Group Connection (Connessione tra gruppi), selezionare l'intervallo di misurazione come Correlazione di Pearson e fare clic su OK per disegnare la mappa CA.
- Analisi delle componenti principali (PCA)
- Importare l'area di picco comune relativa delle varietà autentiche e dei loro adulteranti nel software di analisi per l'analisi PCA e utilizzare la mappa del punteggio PCA per valutare la mappa della matrice di punteggio delle differenze campionarie. Le operazioni specifiche sono le seguenti:
- Apri il software di analisi dei dati, fai clic su File nel menu e crea un nuovo progetto regolare. Importare l'area di picco di 12 picchi comuni in un foglio di calcolo (ad esempio, formato excel) dal sistema HPLC. Quindi fare clic su Fine per completare l'importazione dei dati.
- Fare clic su Nuovo per creare un nuovo modello per impostare il tipo di modello con PCA. Fare clic su Autofit e Aggiungi per adattare i dati, quindi fare clic su Punteggi per ottenere la mappa del punteggio PCA.
- Importare l'area di picco comune relativa delle varietà autentiche e dei loro adulteranti nel software di analisi per l'analisi PCA e utilizzare la mappa del punteggio PCA per valutare la mappa della matrice di punteggio delle differenze campionarie. Le operazioni specifiche sono le seguenti:
- Analisi di discriminazione dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS-DA)
- Utilizzare il metodo di analisi della discriminazione dei minimi quadrati parziali ortogonali con modalità di supervisione per analizzare ulteriormente i picchi relativi dell'area di picco comune delle autentiche varietà Chuanmutong e adulteranti e disegnare una mappa del punteggio di classificazione OPLS-DA di tutti i campioni. Le operazioni specifiche sono le seguenti:
- Nel software di analisi dei dati, fare clic su File nel menu per importare un file e creare un nuovo progetto regolare. Importare l'area di picco di 12 picchi comuni in un foglio di calcolo dal sistema HPLC, quindi fare clic su Fine per completare l'importazione dei dati.
- Fare clic su Nuovo per creare un nuovo modello per impostare il tipo di modello con PCA. Fare clic su Autofit e Aggiungi per adattare i dati. Quindi fare clic su Punteggi per ottenere la mappa del punteggio PCA.
- Fare clic su Nuovo e scegliere Nuovo come modello Uno per impostare il tipo di modello con OPLS-DA.
- Fare clic su Scala e impostare il tipo con Par for All. Fare clic prima su Autofit e quindi su Punteggi per ottenere la mappa dei punteggi OPLS-DA.
- Al fine di determinare l'influenza di ciascun picco comune in Chuanmutong sui risultati della classificazione e la differenza tra materiali Chuanmutong autentici e relativi adulteranti, utilizzare l'importanza variabile nella proiezione (VIP) per l'analisi.
- Disegna la mappa VIP dei diversi componenti di Chuanmutong. Utilizza la mappa VIP risultante per valutare l'impatto di ciascuna variabile sulla classificazione e per escludere i componenti che contribuiscono in modo significativo alle differenze tra i gruppi. Le operazioni specifiche sono le seguenti:
- Nel software di analisi dei dati, fare clic su Analizza nel menu e fare clic su Permutazioni, impostare il numero di permutazioni su 200 e ottenere R 2 e Q2 della mappa del punteggio OPLS-DA.
- Clicca su VIP e scegli VIP Predictive per ottenere la mappa VIP.
- Utilizzare il metodo di analisi della discriminazione dei minimi quadrati parziali ortogonali con modalità di supervisione per analizzare ulteriormente i picchi relativi dell'area di picco comune delle autentiche varietà Chuanmutong e adulteranti e disegnare una mappa del punteggio di classificazione OPLS-DA di tutti i campioni. Le operazioni specifiche sono le seguenti:
4. Determinazione del β-sitosterolo in Chuanmutong mediante HPLC
- Condizioni cromatografiche (fare riferimento al punto 1.1)
- Preparare la fase mobile: metanolo-acqua (97:3).
- Impostare la portata della fase mobile su 1,0 ml/min.
- Effettuare la separazione cromatografica su una colonna C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) mantenuta a 30 °C.
- Impostare il volume di iniezione su 10 μL.
- Rilevare il componente a una lunghezza d'onda di 204 nm.
- Preparazione della soluzione campione
- Preparare la soluzione madre standard di β-sitosterolo (0,1 mg/ml) sciogliendo una quantità accuratamente pesata del corrispondente standard di riferimento in metanolo.
- Macinare il campione di analisi della materia prima per uniformare la dimensione delle particelle facendo passare il campione attraverso la rete di nylon con un diametro interno di 180 μm ± 7,6 μm.
- Introdurre 2 g di materia prima macinata (accuratamente pesata) in un matraccio a fondo rotondo e aggiungervi 50 ml di cloroformio.
- Collegare il pallone a un condensatore a riflusso e riscaldarlo a bagnomaria bollente (ebollizione moderata) per 60 minuti. Filtrare la soluzione di estrazione con carta da filtro da 15-20 μm.
- Evaporare il filtrato fino quasi all'asciutto a bagnomaria bollente (ebollizione moderata) per circa 10 minuti.
- Sciogliere il residuo e portare il volume a 5 ml usando metanolo. Infine, far passare il surnatante attraverso una membrana filtrante da 0,45 μm e metterlo in standby.
- Convalida del metodo
- Prendere la soluzione madre di β-sitosterolo preparata nella sottofase 4.2.1, diluirla con metanolo al 100% e preparare le soluzioni con concentrazioni di 100 μg/mL, 80 μg/mL, 60 μg/mL, 50 μg/mL, 40 μg/mL, 30 μg/mL e 20 μg/mL.
- Iniettare i campioni nelle condizioni cromatografiche descritte al punto 4.1 per determinare l'area del picco, eseguire l'analisi di regressione con l'area del picco al volume di iniezione e ottenere l'equazione di regressione e il coefficiente di correlazione per valutarne la linearità.
- Preparare i campioni come descritto sopra (fase 4.2) e sottoporli all'analisi HPLC (fase 4.1) sei volte nello stesso giorno. Quindi calcolare l'RSD delle aree di picco per valutare la precisione.
- Valutare la stabilità della soluzione campione analizzando le stesse soluzioni campione memorizzate in RT per 0, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 ore, come descritto al punto 4.1. Quindi calcolare l'RSD delle aree di picco come descritto nel passaggio 1.3.5.
- Esaminare la ripetibilità sciogliendo lo stesso campione (CMT-4) in sessuplicato, preparato come descritto al punto 4.2, e sottoponendolo all'analisi HPLC come descritto nella fase 4.1. Quindi calcolare l'RSD del contenuto di β-sitosterolo in sei campioni.
- Valutare l'accuratezza del metodo utilizzando il metodo di aggiunta standard. Per questo, aggiungere soluzioni di riferimento di β-sitosterolo ai campioni all'80%, 100% e 120% del contenuto di β-sitosterolo e ripetere ogni condizione tre volte come descritto al punto 4.1. Valutare l'accuratezza del metodo calcolando il recupero medio e l'RSD.
NOTA: la formula di calcolo del tasso di recupero (RR) è la seguente:
RR % = [(M t - M 0) / Ms] × 100
Dove M t = la qualità del β-sitosterolo dopo aver aggiunto lo standard, M 0 = la qualità della soluzione del campione e Ms = la qualità del β-sitosterolo aggiunto.
- Determinazione del contenuto di β-sitosterolo dei campioni
- Prendere 10 lotti di autentici materiali medicinali cinesi e cinque lotti di adulteranti correlati per preparare soluzioni campione secondo il passaggio 4.2.
- Quindi iniettare ciascuna soluzione campione e soluzione di riferimento di β-sitosterolo per determinare l'area del picco nelle condizioni descritte al punto 4.1 e calcolare il contenuto di β-sitosterolo di ciascun campione utilizzando il metodo standard esterno a un punto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Impronta digitale cromatografica di Chuanmutong e analisi di similarità (SA)
I valori RSD del tempo di ritenzione relativo di precisione, ripetibilità e stabilità erano inferiori rispettivamente allo 0,46%, 1,65% e 0,53%; i valori RSD dell'area di picco relativa erano inferiori rispettivamente al 4,23%, 3,56% e 3,96%. Come mostrato nelle figure 1A,B, c'erano 12 distinti picchi comuni (dal picco 1 al picco 12) nelle impronte digitali HPLC nei 10 campioni autentici di Chuanmutong. Poiché l'area di picco del n. 10 era relativamente grande, la risoluzione era buona; Poiché era un componente presente in ogni campione, è stato utilizzato come picco di riferimento per studiare la stabilità e la riproducibilità dell'impronta digitale. Quindi, il picco n. 10 è stato preso come picco di riferimento (S) ed è stato calcolato il tempo di ritenzione relativo dei restanti 11 picchi.
Nell'analisi di similarità, più il coefficiente di correlazione è vicino a 1, maggiore è la somiglianza tra i campioni. Come mostrato nella Tabella 1, i gradi di somiglianza di 10 lotti di Chuanmutong erano 0,910-0,989. Questi risultati hanno mostrato che i 10 lotti di Chuanmutong avevano un'elevata somiglianza e una buona consistenza, che può essere utilizzata per valutare la qualità complessiva di Chuanmutong. Come mostrato nella figura 1C, sono state ottenute le impronte digitali di cinque lotti dei suoi adulteranti. La somiglianza tra le impronte digitali di cinque lotti di adulteranti e le impronte digitali di controllo di Chuanmutong era solo 0,133-0,720 (Tabella 1), indicando che ci sono evidenti differenze tra i campioni autentici e i relativi adulteranti. Le differenze erano concentrate principalmente nei numeri di picco cromatografici sul cromatogramma a 28-55 min. Pertanto, le impronte digitali di controllo di Chuanmutong possono distinguere efficacemente i campioni autentici dai relativi adulteranti.
Il software statistico SPSS 26 è stato utilizzato per l'analisi CA in questo esperimento (Figura 2A); 15 lotti di campioni sono stati divisi in due categorie quando la distanza di classificazione era 20. La prima categoria era costituita da 10 lotti di Chuanmutong e dei suoi adulteranti abituali (CC). La seconda categoria erano gli adulteranti di Chuanmutong, tra cui DC, DE, XS e SMT. Quando la distanza di classificazione era quattro, tutti i campioni erano divisi in quattro categorie. La prima categoria era di 10 lotti di Chuanmutong, la seconda categoria era CC, la terza categoria era SMT e XS e la quarta categoria era DC e DE. I risultati della classificazione hanno mostrato che la qualità delle varietà autentiche di Chuanmutong era fondamentalmente la stessa, e c'erano evidenti differenze con tutti gli adulteranti. Allo stesso tempo, rispetto ad altri adulteranti, CC era più vicino all'autentica varietà di Chuanmutong, ma può ancora essere distinto quando la distanza di classificazione è ridotta.
Le aree di picco comuni dei 15 lotti di campioni sono state importate nel software di analisi dei dati per l'analisi PCA e la matrice del punteggio (R 2 x = 0,994, Q2 = 0,961) (Figura 2B) ha mostrato che l'effetto di clustering dei 15 lotti di campioni è stato pronunciato. Sul lato destro dell'asse Y c'erano 10 lotti di Chuanmutong e CC. Tra questi, CC si trovava nel primo quadrante, che è diverso dalle varietà autentiche di Chuanmutong. Il lato sinistro dell'asse Y era costituito dagli adulteranti, inclusi SMT, XS, DE e DC. Tra questi, SMT e XS si trovavano nel secondo quadrante e DE e DC si trovavano nel terzo quadrante. Confrontando le varietà autentiche di Chuanmutong e gli adulteranti convenzionali, la differenza tra CC e varietà autentiche è relativamente piccola, mentre la differenza tra l'autentico e altri adulteranti è ovvia.
L'area di picco comune di Chuanmutong e dei suoi adulteranti è stata utilizzata come variabile, importata nel software di analisi dei dati per OPLS-DA, e quindi è stata disegnata la matrice del punteggio (Figura 3A). L'R 2 x [1] del modello OPLS-DA era 0,695 e l'R 2 x [2] era 0,605, entrambi maggiori di 0,5, indicando che il modello è stabile e affidabile e può essere utilizzato per distinguere campioni autentici da adulteranti.
Si può vedere dalla figura 3A che i punti campione degli autentici e degli altri adulteranti erano completamente separati e non vi era alcuna intersezione tra i punti campione. Tutti i campioni sono stati divisi in tre parti. Le varietà autentiche di Chuanmutong e CC erano simili. I campioni di XS, DC e DE sono stati raggruppati in un'unica classe e il campione di SMT è stato l'ultima classe. Inoltre, il metodo di giudizio di importanza variabile nella proiezione (VIP) (Figura 3B) è stato utilizzato per esaminare i picchi di diversi componenti nell'impronta digitale di ciascun campione. VIP > 1.0 è stato preso come standard per escludere le variabili seveb che contribuiscono notevolmente alla classificazione tra i gruppi campione. Secondo i risultati dello screening, i principali componenti marcatori che hanno causato la differenza di composizione tra campioni autentici e adulteranti sono stati i picchi n. 9, n. 5, n. 7, n. 6, n. 10, n. 3 e n. 2. Il valore VIP dei picchi rimanenti era inferiore a 1, il che ha avuto scarso effetto sulla discriminazione dei campioni.
La relazione lineare tra l'area del picco del β-sitosterolo e la sua concentrazione in soluzione è stata trovata utilizzando l'analisi di regressione. Questa dipendenza obbediva a un'equazione Y = 5,4918 X-4,5563, dove Y è l'area del picco del β-sitosterolo e X è il contenuto di β-sitosterolo in μg/mL. Allo stesso tempo, il coefficiente di correlazione r = 0,9995, che soddisfa i requisiti. L'RSD del test di precisione, del test di stabilità e del test di ripetibilità erano rispettivamente 1,76%, 4,22% e 3,85%. I risultati mostrano che il metodo di determinazione del contenuto di β-sitosterolo aveva una buona linearità, precisione e ripetibilità e la soluzione del campione era stabile entro 24 ore. La percentuale media di recupero a tre livelli è stata del 101,50%, 101,90% e 100,72%; l'RSD corrispondente era rispettivamente del 2,56%, 1,56% e 1,68%. Buoni accordi tra valori teorici ed effettivi determinati hanno confermato l'accuratezza e l'applicabilità del metodo per l'analisi. Il cromatogramma liquido del β-sitosterolo è mostrato nella Figura 4 ed è stato determinato il contenuto di β-sitosterolo in 15 lotti di campioni (Tabella 2). I risultati hanno mostrato che la concentrazione di β-sitosterolo in 10 lotti di campioni autentici era compresa tra 97,53 e 161,56 μg / g (relativamente stabile). Questo componente è stato rilevato in tutti e cinque i lotti di adulteranti, ma il contenuto variava notevolmente.
Figura 1: Impronte digitali di Chuanmutong e dei loro adulteranti. (A) Impronte digitali di 10 lotti di campioni di Chuanmutong autentici (S1: CMT-1, S2: CMT-2, S3: CMT-3, S4: CMT-4, S5: CMT-5, S6: CMT-6, S7: CMT-7, S8: CMT-8, S9: CMT-9, S10: CMT-10). b) le impronte digitali del cromatogramma di riferimento di campioni di Chuanmutong autentici; i tempi di ritenzione relativi sono stati 0,18 (Picco n. 1), 0,22 (Picco n. 2), 0,29 (Picco n. 3), 0,72 (Picco n. 4), 0,75 (Picco n. 5), 0,82 (Picco n. 6), 0,86 (Picco n. 7), 0,92 (Picco n. 8), 0,96 (Picco n. 9), 1,00 (Picco n. 10), 1,02 (Picco n. 11), 1,37 (Picco n. 12). (C) Impronte digitali di cinque lotti di adulteranti Chuanmutong (S1: CC, S2: DC, S3: DE, S4: XS, S5: SMT). (D) Confronto tra le impronte digitali del cromatogramma di riferimento di campioni autentici di Chuanmutong e i cinque lotti dei loro adulteranti (S1: impronte digitali del cromatogramma di riferimento, S2: CC, S3: DC, S4: DE, S5: XS, S6: SMT). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Analisi CA e PCA di 10 lotti di campioni Chuanmutong autentici e cinque lotti di adulteranti . (A) Analisi CA. (B) Analisi APC. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Mappa del punteggio OPLS-DA e mappa del punteggio VIP di 10 lotti di campioni Chuanmutong autentici e cinque lotti di adulteranti. (A) Mappa del punteggio OPLS-DA. (B) Mappa del punteggio VIP. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Il cromatogramma liquido del β-sitosterolo. S1: β-sitosterolo, S2: CMT-4, S3: XS, S4: DC, S5: SMT, S6: CC, S7: DE. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Campioni | Nome | Somiglianza |
| le varietà genuine di Chuanmutong | CMT-1 · | 0.947 |
| CMT-2 · | 0.910 | |
| CMT-3 · | 0.989 | |
| CMT-4 · | 0.937 | |
| CMT-5 · | 0.989 | |
| CMT-6 · | 0.988 | |
| CMT-7 · | 0.956 | |
| CMT-8 · | 0.959 | |
| CMT-9 · | 0.939 | |
| CMT-10 · | 0.966 | |
| adulteranti | CC | 0.599 |
| DC | 0.720 | |
| DE | 0.133 | |
| XS | 0.694 | |
| SMT | 0.180 |
Tabella 1: Risultati della somiglianza di 10 lotti di campioni autentici di Chuanmutong e dei loro adulteranti. Importando i dati rilevanti nel sistema di valutazione delle impronte digitali cromatografiche della medicina cinese, è stata calcolata la somiglianza di 10 lotti di campioni Chuanmutong autentici e cinque lotti di adulteranti.
| Campioni | Nome | Contenuto (μg/g) |
| le varietà genuine di Chuanmutong | CMT-1 · | 103.5 |
| CMT-2 · | 124.6 | |
| CMT-3 · | 131 | |
| CMT-4 · | 121.1 | |
| CMT-5 · | 97.5 | |
| CMT-6 · | 113.8 | |
| CMT-7 · | 105.6 | |
| CMT-8 · | 161.6 | |
| CMT-9 · | 118 | |
| CMT-10 · | 123.5 | |
| adulteranti | CC | 157.4 |
| DC | 165.6 | |
| DE | 32.9 | |
| XS | 69.7 | |
| SMT | 192.2 |
Tabella 2: Risultati della determinazione del contenuto di β-sitosterolo nei campioni autentici di Chuanmutong e dei loro adulteranti.
Figura supplementare 1: cromatografia liquida in diverse condizioni di preparazione del campione e diverse condizioni cromatografiche. (A) I sistemi di fase mobile (S1: soluzione di acido formico acetonitrile-0,1%, S2: soluzione di acido acetonitrile-0,5%, S3: acqua pura di acetonitrile, S4: soluzione di acido fosforico acetonitrile-0,05%, S5: acqua pura di metanolo). (B) Le lunghezze d'onda di rivelazione (S1: 205 nm, S2: 230 nm, S3: 250 nm, S4: 300 nm). (C) Le temperature della colonna (S1: 20 °C, S2: 30 °C, S3: 40 °C). (D) Le portate (S1: 0,8 ml/min, S2: 0,9 mL/min, S3: 1,0 mL/min). (E) I metodi di estrazione (S1: estrazione ad ultrasuoni, S2: estrazione a reflusso). F) I solventi da estrazione (S1: acetato di etile, S2: etanolo, S3: cloroformio, S4: n-butanolo, S5: metanolo). (G) Il tempo di estrazione (S1: 15 min, S2: 30 min, S3: 60 min). Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Il cromatogramma liquido di ergosterolo, stigmasterolo e Chuanmutong autentico. S1: stigmasterolo, S2: ergosterolo, S3: CMT-4. Clicca qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La raccolta di campioni per la ricerca è il primo passo chiave per costruire il riconoscimento multi-pattern nell'identificazione dell'autenticità dei materiali medicinali cinesi. Attraverso ricerche di mercato, abbiamo scoperto che Sichuan Ya'an, Liangshan e Leshan sono le principali aree di produzione delle risorse selvatiche di Chuanmutong. Anche le varietà affini dello stesso genere hanno la stessa distribuzione geografica 6,20; CC, DC, DE, XS e SMT sono spesso usati impropriamente come Chuangmutong16,21; pertanto, in questo studio, 10 lotti di Chuanmutong autentici e cinque lotti di campioni misti sono stati raccolti nei luoghi di origine sopra menzionati e l'accuratezza delle varietà è stata confermata.
Il secondo passo fondamentale è quello di esaminare le condizioni di rilevamento dell'impronta digitale HPLC, che può visualizzare quante più informazioni possibili sui componenti chimici. In questo studio, come mostrato nella figura supplementare 1, il numero e l'area dei picchi cromatografici sono stati ottenuti in diverse condizioni di preparazione, compresi i metodi di estrazione, i solventi di estrazione e il tempo di estrazione. È stato determinato il metodo di preparazione ottimale della soluzione campione di Chuanmutong. D'altra parte, sono stati confrontati il numero e la risoluzione dei picchi cromatografici dei campioni in diverse condizioni cromatografiche. I sistemi di fase mobile, come la soluzione di acido formico acetonitrile-0,1%, la soluzione di acido acetico acetitrile-0,5%, l'acqua pura di acetonitrile, la soluzione di acido fosforico acetonitrile-0,05% e l'acqua pura di metanolo, le lunghezze d'onda di rilevamento, come 205 nm, 230 nm, 250 nm e 300 nm, le temperature della colonna, come 20 °C, 30 °C e 40 °C, e le portate, come 0,8-1,0 ml / min, sono stati indagati. Sono state determinate le condizioni cromatografiche ottimali per l'analisi dei campioni di Chuanmutong. Inoltre, la sua fattibilità è stata confermata dalla convalida metodologica e il metodo di rilevamento dell'impronta digitale HPLC di Chuanmutong è stato costruito con successo.
Il terzo passo chiave è analizzare e trovare le informazioni diverse nelle impronte digitali dell'autentica medicina cinese e dei suoi adulteranti. In questo studio, in primo luogo, la somiglianza delle impronte digitali è stata analizzata utilizzando SESCF-TCM (versione 2012). È stato riscontrato che la somiglianza tra le impronte digitali di 10 lotti di campioni autentici di Chuanmutong e l'impronta digitale caratteristica di controllo era molto elevata. In confronto, la somiglianza tra le impronte digitali di cinque lotti di adulteranti e l'impronta digitale caratteristica del controllo era significativamente inferiore a quella dei campioni autentici. CA, PCA e OPLS-DA sono stati poi ulteriormente introdotti per analizzare le informazioni di picco comuni delle impronte chimiche. Entrambi i risultati CA e PCA mostrano che il CC adulterante comunemente usato tra i diversi adulteranti è relativamente più vicino a quello autentico, che è difficile da distinguere. Tuttavia, quando la distanza di classificazione di CA viene modificata a quattro, è possibile ottenere l'identificazione effettiva tra l'autentico e l'adulterante. Sulla base dei 12 picchi comuni di materiali autentici, i valori di contributo dei picchi differenziali degli adulteranti sono stati valutati quantitativamente da OPLS-DA e hanno ottenuto sette picchi cromatografici differenziali, vale a dire picco n. 9, picco n. 5, picco n. 7, picco n. 6, picco n. 10, picco n. 3 e picco n. 2. Questi possono essere utilizzati per identificare efficacemente i materiali autentici e falsi di Chuanmutong, che sono i principali componenti marcati della differenza tra l'autentico e l'adulterante.
L'ultima edizione della farmacopea cinese non ha ancora incluso la determinazione del contenuto dei componenti efficaci di Chuanmutong. Al fine di migliorare il suo controllo di qualità, questo studio ha studiato i metodi di determinazione del contenuto di componenti attivi come β-sitosterolo, ergosterolo, sitosterolo e acido oleanolico correlati all'azione diuretica nei precedenti rapporti 22,23,24,25,26. Come mostrato nella figura supplementare 2, l'ergosterolo non è stato rilevato nel Chuanmutong autentico e lo stigmasterolo era difficile da separare nel cromatogramma e non poteva essere quantificato con precisione. Infine, è stato stabilito il metodo di determinazione del contenuto di β-sitosterolo; i risultati del rilevamento hanno mostrato che il β-sitosterolo è stato trovato in 10 lotti di autentici campioni di Chuanmutong e cinque lotti di adulteranti. Pertanto, il β-sitosterolo non era unico per i materiali medicinali genuini. Sebbene possano essere fornite alcune informazioni sulla qualità di Chuanmutong, è ancora necessario analizzare ulteriormente i picchi cromatografici differenziali nelle impronte digitali in futuro per vedere se i componenti specifici relativi all'efficacia di Chuanmutong possono essere trovati.
Allo stato attuale, le medicine tradizionali cinesi sono spesso identificate dalla somiglianza dello spettro delle impronte digitali chimiche. Tuttavia, questo indicatore è un parametro basato sulle informazioni complessive dei picchi cromatografici del campione, che non possono fornire ulteriori informazioni sull'identificazione e sulle principali differenze dei diversi campioni. Pertanto, questo studio ha ulteriormente utilizzato CA, PCA e OPLS-DA per identificare le informazioni di picco comuni delle impronte digitali chimiche, ha trovato i principali picchi cromatografici differenziali tra campioni autentici e adulterati di Chuanmutong e li ha identificati con successo. Infine, è stato costruito il fingerprinting chimico accoppiato HPLC per il riconoscimento multi-pattern.
Poiché non è raro mescolare autentici materiali medicinali cinesi e i loro adulteranti, come Fritillaria thunbergii, Herba Asari e Lonicera japonica, questo metodo fornirà una nuova strategia per l'identificazione chiara e scientifica di autentici materiali medicinali cinesi e dei loro adulteranti. Questa strategia sarà di grande importanza per garantire la qualità dei materiali medicinali cinesi nell'applicazione clinica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto della Sichuan Traditional Chinese Medicine Administration (n. 2020JC0088, n. 2021MS203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017381038 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD5243V | |
| β-Sitosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| C18 column | Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China | Welch Ultimate LP | |
| Chuanmutong | Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 19020103 | CMT-1 |
| Chuanmutong | Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-2 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-3 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-4 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210701 | CMT-5 |
| Chuanmutong | Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210401 | CMT-6 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-7 |
| Chuanmutong | Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China | 201201 | CMT-8 |
| Chuanmutong | Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 201001 | CMT-9 |
| Chuanmutong | Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210501 | CMT-10 |
| Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang | Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China | - | CC |
| Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. | Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China | - | DC |
| Clematis peterae Hand.-Mazz. | Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China | - | DE |
| Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils | Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | XS |
| Clematis finetiana Levl. et Vaniot. | Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | SMT |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Ergosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China | 20210201 | |
| Ethanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2021112602 | |
| Ethyl acetate | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017042043 | |
| Formic acid | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2016062901 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent, USA. | 1260 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD6409V | |
| Methanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 202010302 | |
| n-butyl alcohol | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020071047 | |
| Petroleum ether | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020090125 | |
| Phosphoric acid | Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 20200110 | |
| SESCF-TCM version 2012 | National Pharmacopoeia Commission, China | - | http://114.247.108.158:8888/login |
| Stigmasterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China | 20200214 | |
| Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 | Umetrics, Sweden | - | https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download |
| Ultrapure water machine | Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China | UPH-II-10T | |
| Ultrasonic cleaner | Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China | KH3200E |
References
- Chen, C. R. Chinese Medicine Specimen Picture Book. , Shanghai World Book Company. Shanghai. 116 (1935).
- Xiong, J., et al. Lignans from the stems of Clematis armandii ("Chuan-Mu-Tong") and their anti-neuroinflammatory activities. Journal of Ethnopharmacology. 153 (3), 737-743 (2014).
- Pan, L. L., et al. a lignan from the Chinese medicinal plant Clematis armandii, inhibits A431 cell growth via blocking p70S6/S6 kinase pathway. Integrative Cancer Therapies. 16 (3), 351-359 (2017).
- Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of The People's Republic of China: (Edition 2020). , The Medicine Science and Technology Press of China. China., Beijing. 38 (2020).
- Wang, D. G., Guo, J. L. Textual research on the materia medica and authenticity of Clematidis armandii. Lishizhen Medicine and Materia Medicine Research. 18 (11), 2696 (2007).
- Fang, Q. M., Zhang, M., Zhong, Y. Y. The natural resources and exploitation of Caulis Clematidis Armandii in Sichuan. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 20 (5), 404-406 (2005).
- Bai, M. N., Dai, Y. X., Wang, Y., Ren, Y. Y., Tan, R. Study on the identification of Caulis Clematidis Armandii. Research and Practice on Chinese Medicines. 31 (3), 13-16 (2017).
- Zhou, P. J., Li, X. F., Fu, D. H., Pu, X. Y., Zhu, G. Q. Pharmacognosy identification of Ethnomedicine Clematis ranunculoides Franchet. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 34 (3), 432-436 (2017).
- Guo, J. L., Tang, Y., Pei, J., Wang, D. G. Study on random amplified polymorphic DNA and sequence characterized amplified regions of Caulis Clematidis Armandii. Journal of Chengdu Medical College. 6 (4), 283-286 (2011).
- Liu, M. Z., Li, M. N., Yao, H., Liu, P. Molecular identification of Clematidis Armandii Caulis and its adulterants and closely related species by ITS2 sequence. Global Traditional Chinese Medicine. 4 (6), 446-450 (2011).
- Liu, J. J., Chen, X., Wei, Z. Q., Li, B. Chemical constituents and identification of the caules of Clematis armandii Franch.and Clematis montana Buch.-Ham. Natural Product Research and Development. 22 (6), 998-1000 (2010).
- Yang, T. R., Xu, Z., Shi, Y. N. Studies on four compounds from Clematis Montana. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 10 (4), 142-143 (2008).
- Yan, L. H., Xu, L. Z., Zhou, Z. M., Yang, S. L. Chemical constituents from stems of Clematis armandii(I). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 38 (3), 340-342 (2007).
- Li, X., et al. Traditional uses, phytochemistry, pharmacology, and toxicology of Akebiae Caulis and its synonyms: A review. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114245 (2021).
- Ye, X., et al. Diuretic effect and material basis of Clematidis Armandii Caulis in rats. China Journal of Chinese Materia Medica. 44 (9), 1889-1894 (2019).
- Kuang, Y., et al. Consistency study of Caulis Clematidis Armandii and its traditionally used products and counterfeit species based on efficacy and pharmacognosy. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 36 (3), 115-121 (2020).
- Li, Y., et al. Quality assessment of Asarum heterotropoides var. mandshuricum based on HPLC multi-component determination and multiple pattern recognition method of fingerprint. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 238-243 (2022).
- Li, Y., et al. Determination of multi-components of Paeoniae Alba Radix based on fingerprints and chemical pattern recognition. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 231-237 (2022).
- Li, H. H., et al. Comparative investigation for raw and processed products of Euodiae Fructus based on high-performance liquid chromatography fingerprints and chemical pattern recognition. Chemistry & Biodiversity. 18 (8), 2100281 (2021).
- Dong, L. J., et al. Study on suitable distribution areas of Kawa Kimichi produced in Sichuan province-based on remote sensing and GIS-A case study of Clematis Armandii. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 17 (11), 2398-2404 (2015).
- Tang, S. W., Pei, J., Li, F. Y. Morphological and histological identification of Chuanmutong. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 15 (1), 19-21 (2000).
- Li, B., Chen, X., Fang, Q. M., Zhang, B. J., Wei, Z. Q. Quality Research of Chuanmutong. Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine. 27 (6), 58-60 (2009).
- Wu, W. J., Wan, M. M., Cao, Y. H., Tan, R., Song, L. K. Research on the Quality Standard of Chuanmutong. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 33 (2), 313-315 (2015).
- Wei, Z. Q., Chen, X., Li, B., Dong, X. P. Determination of stigmasterol in Clematis armandii Franch and Clematis montana Buch-Ham. by HPLC. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 20 (3), 574-575 (2009).
- Qing, L. S., et al. Determination of oleanolic acid in Caulis clematidis armandii by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (3), 273-274 (2006).
- Yang, S. D., Wang, R., Fu, D. Y., Guo, J. J., Tan, W. Y. Determination on oleanolic acid in caulis clematidis armandii by microwave assisted extraction-HPLC/MS. Anhui Academy of Agricultural Sciences. 38 (13), 6929-6931 (2010).
