Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att upprätta högpresterande vätskekromatografi (HPLC), i kombination med kemisk fingeravtrycksigenkänning med flera mönster, vilket ger en ny strategi för att effektivt identifiera de äkta sorterna av Clematidis Armandii Caulis och dess äktenskapsbrytare.
Abstract
En metod för att identifiera kinesiska medicinska material och deras relaterade äktenskapsbrott konstruerades genom att ta Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, en universellt använd traditionell kinesisk medicin) som ett exempel. Tio satser äkta Chuanmutong-sorter och fem satser av relaterade äktenskapsbrytare analyserades och jämfördes baserat på högpresterande vätskekromatografi (HPLC) fingeravtryck i kombination med kemometri, inklusive klusteranalys (CA), huvudkomponentanalys (PCA) och ortogonal partiell minsta-kvadratdiskrimineringsanalys (OPLS-DA). Dessutom bestämdes innehållet i β-sitosterol. Chuanmutongs kontrollkemiska fingeravtryck fastställdes och 12 vanliga toppar identifierades. Likheten mellan fingeravtrycket från 10 satser äkta Chuanmutong-sorter och kontrollfingeravtrycket var 0,910-0,989, medan likheten mellan fem satser äktenskapsbrytare endast var 0,133-0,720. Baserat på de vanliga topparna i kromatogrammet klassificerades 15 satser av prover i tre innehållsnivåer av PCA och aggregerades i fyra kategorier av CA, vilket uppnådde en tydlig skillnad mellan autentiska Chuanmutong och äktenskapsbrytare av Chuanmutong. Vidare hittades sju differentiella komponenter som effektivt kan identifiera autentiska Chuanmutong och äktenskapsbrott i Chuanmutong genom OPLS-DA. Halten β-sitosterol i 10 satser äkta Chuanmutong-sorter var 97,53-161,56 μg/g, medan β-sitosterolhalten i de fem satserna äktenskapsbrott varierade kraftigt, bland annat β-sitosterolhalten i Clematis peterae Hand.-Mazz. och Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils. var betydligt lägre än för autentiska sorter av Chuanmutong. HPLC-indexkomponentinnehållet och den kemiska fingeravtrycksmetoden för flermönsterigenkänning som etablerats i denna studie ger en ny strategi för att effektivt identifiera autentiska kinesiska medicinska material och relaterade äktenskapsbrott.
Introduction
Chuanmutong, torr Caulis av Clematis armandii Franch. eller Clematis montana Buch.-Ham., är en traditionell kinesisk medicin som vanligtvis används i kliniker 1,2,3. Det används för behandling av urinproblem, ödem, sår på tungan och munnen, minskad mjölksekretion, ledstelhet och muskelsmärta orsakad av fuktig värme4. Chuanmutong har alltid erhållits från vilda sorter, främst fördelade i sydvästra Kina, särskilt i Sichuan, där den bästa kvaliteten finns 5,6. Det är svårt att skilja mellan autentiska sorter och deras närbesläktade äktenskapsbrott på grund av deras liknande egenskaper 7,8,9,10. Kvalitetsstandarden för Chuanmutong i 2020 års upplaga av Chinese Pharmacopoeia anger endast egenskaper, mikroskopisk identifiering och tunnskiktsidentifiering utan innehållsbestämning, som inte effektivt kan identifiera äktenskapsbrytare och därmed har potentiella risker. Dessutom, Det finns få rapporter som jämför och identifierar Chuanmutong och relaterade växter. Följaktligen är en kvalitetskontrollmetod för att säkerställa äktheten hos Chuanmutong värd att studera ytterligare.
De kemiska beståndsdelarna i Chuanmutong består huvudsakligen av pentacykliska triterpenoider av oleanansk typ och deras glykosider, flavonoider och organiska syror11,12,13,14. Bland dem har oleanolsyra, β-sitosterol, stigmasterol och ergosterol diuretiska effekter av olika intensiteter, vilket kan vara potentiella farmakodynamiska substanser för att främja diures och lindra strypning15,16. Kemiska fingeravtryck erhålls genom att separera och detektera många kemiska komponenter som ingår i prover genom högpresterande vätskekromatografi (HPLC), gaskromatografi (GC) etc. Att anta lämpliga statistiska analysmetoder för att analysera egenskaperna hos Chuanmutong kan bestämma den övergripande kvalitetskontrollen och vetenskapliga identifieringen av traditionell kinesisk medicin17,18,19.
I denna studie samlades 10 satser av Chuanmutong autentiska sorter och fem satser äktenskapsbrott. Deras kvalitet jämfördes och analyserades med HPLC-fingeravtrycksmetoden i kombination med multimönsterigenkänning, inklusive klusteranalys (CA), huvudkomponentanalys (PCA), ortogonal partiell minsta-kvadratdiskrimineringsanalys (OPLS-CA) och innehållsbestämning av den farmakodynamiska komponenten. I detta protokoll fastställs en metod för att identifiera autentiska sorter med hög specificitet, en ny strategi för vetenskaplig identifiering av autentiska sorter och äktenskapsbrytare av kinesiska medicinska material.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Metoder för kemisk fingeravtrycksdetektering
- Kromatografiska förhållanden
- Förbered acetonitril (A)/vatten (B) mobil fas. Ställ in ett gradientprogram enligt följande i HPLC-programvaran: 0-20 min, 3% A-10% A; 20-25 min, 10% A-13% A; 25-65 min, 13%A-25%A; 65-75 min, 25% A-40% A; 75-76 min, 40%A-3%A; 76-85 min, 3%A-3%A.
- Håll flödeshastigheten för den mobila fasen vid 1,0 ml/min.
- Utför den kromatografiska separationen på en C18-kolonn (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) som hålls vid 30 °C.
- Ställ in injektionsvolymen på 10 μl.
- Upptäck proverna vid en våglängd på 205 nm.
OBS: För de specifika inställningarna för kromatografiska förhållanden, se driftsförfarandena för arbetsprogramvaran för högpresterande vätskekromatografi (materialtabell).
- Beredning av provlösningen
- Mal råvarorna till enhetlig partikelstorlek genom att leda dem genom ett nylonnät med en innerdiameter på 850 μm ± 29 μm.
- Placera 2 g av den malda råvaran (noggrant vägd) i en 50 ml e-kolv med en propp och tillsätt 50 ml metanol. Placera proppen på kolven och ultraljud (600 W, 40 kHz) i 30 min.
- Kyl sedan kolven till rumstemperatur (RT). Väg proverna igen och kompensera för den ursprungliga vikten genom att ersätta det förlorade extraktionsmedlet.
- Häll 4 ml metanollösning som innehåller de medicinska extrakten i en 10 ml mätkolv. Tillsätt 6 ml H2O, blanda och låt det sätta sig i 10 min.
- Slutligen filtrerar du supernatanten genom ett 0,45 μm filtermembran och placerar den i vänteläge.
- Validering av metoder för att upptäcka fingeravtryck
- Bered provet enligt beskrivningen ovan (steg 1.2) och låt det genomgå HPLC-analys (steg 1.1) sex gånger om dagen. För att utvärdera precisionen, beräkna den relativa standardavvikelsen (RSD) för relativ retentionstid och relativa toppareaer enligt beskrivningen i steg 1.3.5.
- Utvärdera provlösningens stabilitet genom att analysera samma provlösning som lagras vid RT i 0, 2, 4, 6, 8, 12 och 24 timmar och beräkna RSD för relativ retentionstid och relativa toppareaer enligt beskrivningen i steg 1.3.5.
- Ta sex replikat av samma prov (CMT-4), bereda provlösningen enligt ovanstående procedur (steg 1.2) och detektera dess fingeravtryck i HPLC efter steg 1.1. Beräkna RSD för relativ retentionstid och relativa toppareaer och utvärdera dess repeterbarhet enligt beskrivningen i steg 1.3.5.
- Använd sedan toppnummer 10 i figur 1B som referenstopp och beräkna RSD för den relativa retentionstiden och den relativa topparean för varje gemensam topp enligt beskrivningen i steg 1.3.5.
- Använd formlerna som nämns nedan för att beräkna den relativa retentionstiden och den relativa topparean för varje gemensam topp:
T re = T-karakteristik/Thänvisning
A re = Enegenskap/A-referens
Där T re =relativ retentionstid, T-karakteristik = karakteristisk toppretentionstid, T-referens = referenstoppretentionstid, A re = relativ topparea, A karakteristik = karakteristisk topparea och A referens = referenstopparea.
OBS: Etableringen av traditionell kinesisk medicin fingeravtryck kräver i allmänhet att man väljer en kromatografisk topp som är lätt att få och har hög upplösning. Detta används som en referenstopp för att identifiera fingeravtrycken och undersöka deras stabilitet och reproducerbarhet.
2. Upprättande av Chuanmutong fingeravtryck och likhetsanalys
- Använd 10 satser autentiska prover och fem satser äktenskapsbrytare som Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang (CC), Clematis apiifolia var. et Wils. (DC), Clematis peterae Hand.-Mazz. (DE), Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils (XS) och Clematis finetiana Levl. et Vaniot. (SMT) som prover för fingeravtrycksanalys.
- Bered provlösningarna enligt beskrivningen i steg 1.2. Utför fingeravtrycksanalys av alla provlösningar med HPLC enligt de villkor som beskrivs i steg 1.1.
- Importera relevanta data till systemet för utvärdering av likheter mellan kromatografiska fingeravtryck från traditionell kinesisk medicin (SESCF-TCM, 2012 års version). Systemet kommer att beteckna topparna med rimlig höjd och god upplösning i kromatogrammen för alla prover som vanliga toppar.
SESCF-TCM-programvaran kan laddas ner efter registrering på webbplatsen för den kinesiska farmakopékommissionen (http://114.247.108.158:8888/login).- I programvaran klickar du på knappen Ange referensspektrum i menyn.
- I fönstret Parameterinställningar ställer du sedan in tidsfönstrets bredd till 0,5 och väljer Kontrollera spektrumgenereringsmetod som medianmetod.
- Klicka på Flerpunktskalibrering i huvudmenyn och välj sedan Toppmatchning som Full Spectrum Peak Matching.
- Slutligen klickar du på Generate Control för att generera referenskromatografiska fingeravtryck av den autentiska arten Chuanmutong.
- Importera retentionstiden och toppområdet för 10 satser autentiska Chuanmutong-prover och fem satser äktenskapsbrott till SESCF-TCM för analys. De specifika operationerna är följande:
- I programvaran klickar du på knappen Ange referensspektrum i huvudmenyn.
- I fönstret Parameterinställningar ställer du in referenskromatografiska fingeravtryck för den autentiska arten av Chuanmutong som referens, väljer Control Spectrum Generation Method som medianmetod och ställer in tidsfönstrets bredd till 0,5.
- Klicka på Flerpunktskalibrering i huvudmenyn och välj sedan Toppmatchning som Full Spectrum Peak Matching.
- Slutligen klickar du på Beräkna likhet för att beräkna likheten baserat på referenskromatogrammets fingeravtryck från Chuanmutong. Slutligen beräkna likheten mellan fingeravtryck med hjälp av Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Evaluation System (2012-versionen).
OBS: För de specifika operationerna, se driftsspecifikationerna för Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Evaluation System (2012 års version).
3. Multimönsterigenkänningsanalys av Chuanmutong-fingeravtryck
- Klusteranalys (CA)
- Använd toppområdena på 12 vanliga toppar i fingeravtrycken av 10 satser autentiska Chuanmutong-prover och deras fem satser av äktenskapsbrott som variabler och mata in dem i statistisk analysprogramvara för systematisk klusteranalys (CA).
- Välj metoden Mellan grupper och använd Pearson-korrelationskoefficienten som klassificeringsbas för att rita ett klusteranalysdiagram över Chuanmutong och dess äktenskapsbrytare. De specifika operationerna är följande:
- I den statistiska analysprogramvaran klickar du på Arkiv för att importera data.
- Klicka på Analys i menyn och klicka sedan på Systemkluster i klassificering.
- Välj det gemensamma toppområdet som en variabel och ange antalet kluster till fyra.
- Klicka på Metod, välj klustringsmetoden som Inter-Group Connection, välj mätintervallet som Pearson Correlation och klicka på OK för att rita CA-kartan.
- Analys av huvudkomponenter (PCA)
- Importera det relativa gemensamma toppområdet för de autentiska sorterna och deras äktenskapsbrytare till analysprogramvaran för PCA-analys och använd PCA-poängkartan för att utvärdera poängmatriskartan över provskillnader. De specifika operationerna är följande:
- Öppna dataanalysprogramvaran, klicka på Arkiv på menyn och skapa ett nytt vanligt projekt. Importera topparean för 12 vanliga toppar i ett kalkylblad (t.ex. Excel-format) från HPLC-systemet. Klicka sedan på Slutför för att slutföra dataimporten.
- Klicka på Ny för att skapa en ny modell för att ställa in modelltypen med PCA. Klicka på Autofit och Lägg till för att passa data och klicka sedan på Poäng för att få PCA-poängkartan.
- Importera det relativa gemensamma toppområdet för de autentiska sorterna och deras äktenskapsbrytare till analysprogramvaran för PCA-analys och använd PCA-poängkartan för att utvärdera poängmatriskartan över provskillnader. De specifika operationerna är följande:
- Ortogonal partiell minsta-kvadrat diskrimineringsanalys (OPLS-DA)
- Använd den ortogonala partiella minstakvadratdiskrimineringsanalysmetoden med övervakningsläge för att ytterligare analysera de relativa gemensamma toppområdestopparna för de autentiska Chuanmutong-sorterna och äktenskapsbrytarna och rita en OPLS-DA-klassificeringspoängkarta över alla prover. De specifika operationerna är följande:
- I dataanalysprogramvara klickar du på Arkiv i menyn för att importera en fil och skapa ett nytt vanligt projekt. Importera topparean med 12 vanliga toppar i ett kalkylblad från HPLC-systemet och klicka sedan på Slutför för att slutföra dataimporten.
- Klicka på Ny för att skapa en ny modell för att ställa in modelltypen med PCA. Klicka på Autofit och Lägg till för att passa data. Klicka sedan på Poäng för att få PCA-poängkartan.
- Klicka på Ny och välj Ny som modell ett för att ställa in modelltypen med OPLS-DA.
- Klicka på Skala och ställ in typ med Par för alla. Klicka på Autopassa först och klicka sedan på Poäng för att få OPLS-DA-poängkartan.
- För att bestämma påverkan av varje vanlig topp i Chuanmutong på dess klassificeringsresultat och skillnaden mellan autentiska Chuanmutong-material och relaterade äktenskapsbrott, använd den varierande betydelsen i projektionen (VIP) för analys.
- Rita VIP-kartan över de olika komponenterna i Chuanmutong. Använd den resulterande VIP-kartan för att bedöma effekten av varje variabel på klassificeringen och för att sålla bort komponenter som bidrar avsevärt till skillnaderna mellan grupper. De specifika operationerna är följande:
- I dataanalysprogramvaran klickar du på Analysera i menyn och klickar på Permutationer, ställer in antalet permutationer till 200 och får R 2 och Q2 i OPLS-DA-poängkartan.
- Klicka på VIP och välj VIP Predictive för att få VIP-kartan.
- Använd den ortogonala partiella minstakvadratdiskrimineringsanalysmetoden med övervakningsläge för att ytterligare analysera de relativa gemensamma toppområdestopparna för de autentiska Chuanmutong-sorterna och äktenskapsbrytarna och rita en OPLS-DA-klassificeringspoängkarta över alla prover. De specifika operationerna är följande:
4. Bestämning av β-sitosterol i Chuanmutong med HPLC
- Kromatografiska förhållanden (se steg 1.1)
- Förbered den mobila fasen: metanol-vatten (97:3).
- Ställ in flödeshastigheten för den mobila fasen till 1,0 ml / min.
- Utför den kromatografiska separationen på en C18-kolonn (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) som hålls vid 30 °C.
- Ställ in injektionsvolymen på 10 μl.
- Detektera komponenten vid en våglängd på 204 nm.
- Beredning av provlösningen
- Bered stamstandardlösningen av β-sitosterol (0,1 mg/ml) genom att lösa upp en noggrant vägd mängd av motsvarande referensstandard i metanol.
- Mal analysprovet av råmaterialet till enhetlig partikelstorlek genom att leda provet genom nylonmaskorna med en innerdiameter på 180 μm ± 7,6 μm.
- Placera 2 g av det malda råmaterialet (noggrant vägt) i en rundbottnad kolv och tillsätt 50 ml kloroform till den.
- Anslut kolven till en återloppskylare och värm den i ett kokande vattenbad (måttlig kokning) i 60 minuter. Filtrera extraktionslösningen med ett filterpapper på 15–20 μm.
- Indunsta filtratet till nästan torrhet på ett kokande vattenbad (måttlig kokning) i ca 10 min.
- Lös upp återstoden och fyll på volymen till 5 ml med metanol. Slutligen passera supernatanten genom ett 0,45 μm filtermembran och placera den i vänteläge.
- Validering av metod
- Ta stamlösningen av β-sitosterol framställd i delsteg 4.2.1, späd den med 100 % metanol och bered lösningar med 100 μg/ml, 80 μg/ml, 60 μg/ml, 50 μg/ml, 40 μg/ml, 30 μg/ml och 20 μg/ml.
- Injicera proverna under de kromatografiska förhållanden som beskrivs i steg 4.1 för att bestämma topparean, utför regressionsanalys med topparean till injektionsvolymen och erhålla regressionsekvationen och korrelationskoefficienten för att utvärdera dess linjäritet.
- Bered proverna enligt beskrivningen ovan (steg 4.2) och låt dem genomgå HPLC-analys (steg 4.1) sex gånger samma dag. Beräkna sedan RSD för toppområden för att utvärdera precisionen.
- Utvärdera provlösningens stabilitet genom att analysera samma provlösningar som lagras vid RT i 0, 2, 4, 6, 8, 12 och 24 timmar, enligt beskrivningen i steg 4.1. Beräkna sedan RSD för toppareor enligt beskrivningen i steg 1.3.5.
- Undersök repeterbarheten genom att lösa upp samma prov (CMT-4) i sextuplikat, berett enligt beskrivningen i steg 4.2, och utsätta dem för HPLC-analys enligt beskrivningen i steg 4.1. Beräkna sedan RSD för β-sitosterolhalten i sex prover.
- Bedöm metodens noggrannhet genom att använda standardadditionsmetoden. För detta ändamål, tillsätt β-sitosterolreferenslösningar till proverna vid 80%, 100% och 120% av β-sitosterolhalten och upprepa varje tillstånd tre gånger enligt beskrivningen i steg 4.1. Utvärdera metodens noggrannhet genom att beräkna den genomsnittliga återhämtningen och RSD.
OBS: Beräkningsformeln för återvinningsgraden (RR) är följande:
RR % = [(M t - M 0) / Ms] × 100
Där M t = kvaliteten på β-sitosterol efter tillsats av standarden, M0 = provlösningens kvalitet och Ms = kvaliteten på β-sitosterol tillsatt.
- Bestämning av β-sitosterolhalten i prover
- Ta 10 satser äkta kinesiska medicinska material och fem satser relaterade äktenskapsbrott för att förbereda provlösningar enligt steg 4.2.
- Injicera sedan varje provlösning och β-sitosterolreferenslösning för att bestämma topparean under de förhållanden som beskrivs i steg 4.1 och beräkna β-sitosterolhalten i varje prov med hjälp av den externa standardmetoden med en punkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kromatografiskt fingeravtryck av Chuanmutong och likhetsanalys (SA)
RSD-värdena för den relativa retentionstiden för precision, repeterbarhet och stabilitet var under 0,46%, 1,65% respektive 0,53%; RSD-värdena för den relativa topparean var under 4,23%, 3,56% respektive 3,96%. Som visas i figurerna 1A,B fanns det 12 distinkta gemensamma toppar (från topp 1 till topp 12) i HPLC-fingeravtrycken i de 10 autentiska Chuanmutong-proverna. Eftersom toppområdet på nr 10 var relativt stort var upplösningen bra; Eftersom det var en komponent som fanns i varje prov användes den som en referenstopp för att undersöka fingeravtryckets stabilitet och reproducerbarhet. Därefter togs topp nr 10 som referenstopp (S), och den relativa retentionstiden för de återstående 11 topparna beräknades.
I likhetsanalys, ju närmare korrelationskoefficienten är till 1, desto högre är likheten mellan proverna. Som visas i tabell 1 var likhetsgraderna för 10 satser Chuanmutong 0,910-0,989. Dessa resultat visade att de 10 satserna Chuanmutong hade hög likhet och god konsistens, vilket kan användas för att utvärdera den övergripande kvaliteten på Chuanmutong. Som visas i figur 1C erhölls fingeravtryck från fem satser av dess äktenskapsbrytare. Likheten mellan fingeravtrycken från fem satser äktenskapsbrott och kontrollfingeravtrycken från Chuanmutong var endast 0,133-0,720 (tabell 1), vilket indikerar att det finns uppenbara skillnader mellan de autentiska proverna och de relaterade äktenskapsbrytarna. Skillnaderna koncentrerades huvudsakligen i de kromatografiska toppnumren på kromatogrammet vid 28-55 min. Således kan kontrollfingeravtrycken från Chuanmutong effektivt skilja de autentiska proverna från de relaterade äktenskapsbrytarna.
SPSS 26 statistisk programvara användes för CA-analys i detta experiment (figur 2A); 15 partier prover delades in i två kategorier när klassificeringsavståndet var 20. Den första kategorin var 10 satser Chuanmutong och dess vanliga äktenskapsbrytare (CC). Den andra kategorin var äktenskapsbrytarna i Chuanmutong, inklusive DC, DE, XS och SMT. När klassificeringsavståndet var fyra delades alla prover in i fyra kategorier. Den första kategorin var 10 satser Chuanmutong, den andra kategorin var CC, den tredje kategorin var SMT och XS, och den fjärde kategorin var DC och DE. Klassificeringsresultaten visade att kvaliteten på de autentiska sorterna av Chuanmutong i princip var densamma, och det fanns uppenbara skillnader med alla äktenskapsbrytare. Samtidigt, jämfört med andra äktenskapsbrott, var CC närmare den autentiska sorten av Chuanmutong, men det kan fortfarande särskiljas när klassificeringsavståndet minskas.
De gemensamma toppområdena för de 15 satserna av prover importerades till dataanalysprogramvara för PCA-analys, och poängmatrisen (R2x = 0,994, Q2 = 0,961) (Figur 2B) visade att klustringseffekten av de 15 satserna av prover uttalades. På höger sida av Y-axeln fanns 10 satser Chuanmutong och CC. Bland dem var CC belägen i den första kvadranten, som skiljer sig från de autentiska sorterna av Chuanmutong. Den vänstra sidan av Y-axeln var äktenskapsbrytarna, inklusive SMT, XS, DE och DC. Bland dem var SMT och XS belägna i den andra kvadranten, och DE och DC var belägna i den tredje kvadranten. När man jämför de autentiska sorterna av Chuanmutong och de konventionella äktenskapsbrytarna är skillnaden mellan CC och autentiska sorter relativt liten, medan skillnaden mellan de autentiska och andra äktenskapsbrytarna är uppenbar.
Det gemensamma toppområdet för Chuanmutong och dess äktenskapsbrytare användes som en variabel, importerades till dataanalysprogramvaran för OPLS-DA, och sedan ritades poängmatrisen (figur 3A). R 2 x [1] i OPLS-DA-modellen var 0,695 och R 2 x [2] var 0,605, som båda är större än 0,5, vilket indikerar att modellen är stabil och pålitlig och kan användas för att skilja autentiska prover från äktenskapsbrytare.
Det framgår av figur 3A att provpunkterna för de autentiska och andra äktenskapsbrytarna var helt separerade, och det fanns ingen skärningspunkt mellan provpunkterna. Alla prover delades in i tre delar. De autentiska sorterna av Chuanmutong och CC var likartade. Proverna av XS, DC och DE grupperades i en klass, och provet av SMT var den sista klassen. Vidare användes bedömningsmetoden av varierande betydelse i projektionen (VIP) (figur 3B) för att screena topparna för olika komponenter i fingeravtrycket för varje prov. VIP > 1.0 togs som standard för att sålla bort seeb-variabler som i hög grad bidrar till klassificeringen mellan urvalsgrupperna. Enligt screeningresultaten var de viktigaste markörkomponenterna som orsakade skillnaden i sammansättning mellan autentiska prover och äktenskapsbrytarna toppar nr 9, nr 5, nr 7, nr 6, nr 10, nr 3 och nr 2. VIP-värdet för de återstående topparna var mindre än 1, vilket hade liten effekt på diskrimineringen av prover.
Det linjära förhållandet mellan β-sitosteroltopparean och dess lösningskoncentration hittades med hjälp av regressionsanalys. Detta beroende följde en ekvation Y = 5,4918 X-4,5563, där Y är β-sitosteroltopparean och X är β-sitosterolhalten i μg / ml. Samtidigt är korrelationskoefficienten r = 0, 9995, som uppfyller kraven. RSD för precisionstestet, stabilitetstestet och repeterbarhetstestet var 1,76%, 4,22% respektive 3,85%. Resultaten visar att bestämningsmetoden för β-sitosterolhalt hade god linjäritet, precision och repeterbarhet, och provlösningen var stabil inom 24 timmar. Den genomsnittliga procentuella återhämtningen på tre nivåer var 101,50 %, 101,90 % och 100,72 %. motsvarande RSD var 2,56%, 1,56% respektive 1,68%. Goda överenskommelser mellan teoretiska och faktiska bestämda värden bekräftade noggrannheten och tillämpligheten av analysmetoden. Vätskekromatogrammet för β-sitosterol visas i figur 4 och halten av β-sitosterol i 15 satser prover bestämdes (tabell 2). Resultaten visade att koncentrationen av β-sitosterol i 10 satser autentiska prover låg i intervallet 97,53-161,56 μg/g (relativt stabil). Denna komponent upptäcktes i alla fem satser av äktenskapsbrott, men innehållet varierade kraftigt.
Figur 1: Fingeravtryck av Chuanmutong och deras äktenskapsbrytare. (A) Fingeravtryck av 10 satser autentiska Chuanmutong-prover (S1: CMT-1, S2: CMT-2, S3: CMT-3, S4: CMT-4, S5: CMT-5, S6: CMT-6, S7: CMT-7, S8: CMT-8, S9: CMT-9, S10: CMT-10). B) Referenskromatogrammets fingeravtryck av autentiska Chuanmutong-prover. relativa retentionstider var 0,18 (topp nr 1), 0,22 (topp nr 2), 0,29 (topp nr 3), 0,72 (topp nr 4), 0,75 (topp nr 5), 0,82 (topp nr 6), 0,86 (topp nr 7), 0,92 (topp nr 8), 0,96 (topp nr 9), 1,00 (topp nr 10), 1,02 (topp nr 11), 1,37 (topp nr 12). C) Fingeravtryck från fem satser chuanmutongäktenskapsbrott (S1: CC, S2: DC, S3: DE, S4: XS, S5: SMT). D) Jämförelse mellan referenskromatogramfingeravtryck från autentiska Chuanmutongprover och de fem satserna av deras äktenskapsbrytare (S1: fingeravtryck av referenskromatogram, S2: CC, S3: DC, S4: DE, S5: XS, S6: SMT). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: CA- och PCA-analys av 10 satser autentiska Chuanmutong-prover och fem satser äktenskapsbrott . (A) Analys av certifikatutfärdare. B) PCA-analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: OPLS-DA-poängkarta och VIP-poängkarta över 10 satser autentiska Chuanmutong-prover och fem satser äktenskapsbrott. (A) OPLS-DA-poängkarta. (B) VIP-poängkarta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Vätskekromatogrammet för β-sitosterol. S1: β-sitosterol, S2: CMT-4, S3: XS, S4: DC, S5: SMT, S6: CC, S7: DE. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Prover | Namn | Likhet |
| de äkta sorterna av Chuanmutong | CMT-1 | 0.947 |
| CMT-2 | 0.910 | |
| CMT-3 | 0.989 | |
| CMT-4 | 0.937 | |
| CMT-5 | 0.989 | |
| CMT-6 | 0.988 | |
| CMT-7 | 0.956 | |
| CMT-8 | 0.959 | |
| CMT-9 | 0.939 | |
| CMT-10 | 0.966 | |
| äktenskapsbrytare | KUBIKCENTIMETER | 0.599 |
| DOMÄNKONTROLLANT | 0.720 | |
| DE | 0.133 | |
| XS | 0.694 | |
| SMT | 0.180 |
Tabell 1: Resultat av likhet mellan 10 satser autentiska Chuanmutong-prover och deras äktenskapsbrott. Genom att importera relevanta data till Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Evaluation System beräknades likheten mellan 10 satser autentiska Chuanmutong-prover och fem satser äktenskapsbrott.
| Prover | Namn | Innehåll (μg/g) |
| de äkta sorterna av Chuanmutong | CMT-1 | 103.5 |
| CMT-2 | 124.6 | |
| CMT-3 | 131 | |
| CMT-4 | 121.1 | |
| CMT-5 | 97.5 | |
| CMT-6 | 113.8 | |
| CMT-7 | 105.6 | |
| CMT-8 | 161.6 | |
| CMT-9 | 118 | |
| CMT-10 | 123.5 | |
| äktenskapsbrytare | KUBIKCENTIMETER | 157.4 |
| DOMÄNKONTROLLANT | 165.6 | |
| DE | 32.9 | |
| XS | 69.7 | |
| SMT | 192.2 |
Tabell 2: Bestämningsresultat av β-sitosterolhalten i de autentiska Chuanmutong-proverna och deras äktenskapsbrytare.
Kompletterande figur 1: Vätskekromatografi under olika provberedningsbetingelser och olika kromatografiska förhållanden. A) De mobila fassystemen (S1: acetonitril-0,1% myrsyralösning, S2: acetonitril-0,5% ättiksyralösning, S3: acetonitrilrent vatten, S4: acetonitril-0,05% fosforsyralösning, S5: metanolrent vatten). B) Detektionsvåglängderna (S1: 205 nm, S2: 230 nm, S3: 250 nm, S4: 300 nm). C) Kolonnens temperaturer (S1: 20 °C, S2: 30 °C, S3: 40 °C). D) Flödena (S1: 0,8 ml/min, S2: 0,9 ml/min, S3: 1,0 ml/min). E) Extraktionsmetoderna (S1: ultraljudsextraktion, S2: återflödesextraktion). F) Extraktionsmedel (S1: etylacetat, S2: etanol, S3: kloroform, S4: n-butanol, S5: metanol). (G) Extraktionstiden (S1: 15 min, S2: 30 min, S3: 60 min). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Det flytande kromatogrammet av ergosterol, stigmasterol och äkta Chuanmutong. S1: stigmasterol, S2: ergosterol, S3: CMT-4. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Provsamlingen för forskning är det första viktiga steget för att konstruera igenkänning av flera mönster för att identifiera äktheten hos kinesiska medicinska material. Genom marknadsundersökningar fann vi att Sichuan Ya'an, Liangshan och Leshan är de viktigaste produktionsområdena för vilda resurser i Chuanmutong. De besläktade sorterna av samma släkte har också samma geografiska fördelning 6,20; CC, DC, DE, XS och SMT missbrukas ofta som Chuangmutong16,21; I denna studie samlades därför 10 satser äkta Chuanmutong och fem satser blandade prover på ovannämnda ursprungsorter, och sorternas noggrannhet bekräftades.
Det andra viktiga steget är att screena detekteringsförhållandena för HPLC-fingeravtrycket, som kan visa så mycket information som möjligt om de kemiska komponenterna. I denna studie, som visas i kompletterande figur 1, erhölls antalet och arean av kromatografiska toppar under olika beredningsbetingelser, inklusive extraktionsmetoder, extraktionsmedel och extraktionstid. Den optimala beredningsmetoden för Chuanmutong-provlösningen bestämdes. Å andra sidan jämfördes antalet och upplösningen av kromatografiska toppar av proverna under olika kromatografiska förhållanden. De mobila fassystemen, såsom acetonitril-0,1% myrsyralösning, acetonitril-0,5% ättiksyralösning, acetonitrilrent vatten, acetonitril-0,05% fosforsyralösning och metanolrent vatten, detektionsvåglängderna, såsom 205 nm, 230 nm, 250 nm och 300 nm, kolonntemperaturerna, såsom 20 °C, 30 °C och 40 °C, och flödeshastigheterna, såsom 0,8-1,0 ml/min, undersöktes. De optimala kromatografiska betingelserna för analys av proverna från Chuanmutong bestämdes. Vidare bekräftades dess genomförbarhet genom metodologisk validering, och detektionsmetoden för HPLC-fingeravtrycket från Chuanmutong konstruerades framgångsrikt.
Det tredje viktiga steget är att analysera och hitta informationen annorlunda i fingeravtrycken från autentisk kinesisk medicin och dess äktenskapsbrott. I denna studie analyserades för det första likheten mellan fingeravtryck med hjälp av SESCF-TCM (2012-versionen). Det visade sig att likheten mellan fingeravtrycken från 10 satser autentiska Chuanmutong-prover och kontrollkarakteristikens fingeravtryck var mycket hög. Som jämförelse var likheten mellan fingeravtrycken från fem partier äktenskapsbrytare och det kontrollkarakteristiska fingeravtrycket betydligt lägre än för autentiska prover. CA, PCA och OPLS-DA introducerades sedan ytterligare för att analysera den gemensamma toppinformationen för de kemiska fingeravtrycken. Både CA- och PCA-resultat visar att den vanliga äktenskapsbrytande CC bland olika äktenskapsbrytare är relativt närmare den autentiska, vilket är svårt att skilja. Men när klassificeringsavståndet för CA ändras till fyra kan den effektiva identifieringen mellan den autentiska och den förfalskade uppnås. Baserat på de 12 vanliga topparna av autentiska material utvärderades bidragsvärdena för differentiella toppar av äktenskapsbrytare kvantitativt av OPLS-DA och erhöll sju differentiella kromatografiska toppar, nämligen topp nr.9, topp nr 5, topp nr 7, topp nr 6, topp nr 10, topp nr 3 och topp nr 2. Dessa kan användas för att effektivt identifiera de autentiska och falska materialen i Chuanmutong, som är de viktigaste markerade komponenterna i skillnaden mellan det autentiska och det äktenskapsbrytande.
Den senaste upplagan av kinesisk farmakopé har ännu inte inkluderat innehållsbestämning av de effektiva komponenterna i Chuanmutong. För att förbättra sin kvalitetskontroll undersökte denna studie innehållsbestämningsmetoder för aktiva komponenter såsom β-sitosterol, ergosterol, sitosterol och oleanolsyra relaterad till den diuretiska verkan i tidigare rapporter22,23,24,25,26. Som visas i kompletterande figur 2 detekterades inte ergosterol i autentisk Chuanmutong, och stigmasterol var svårt att separera i kromatogrammet och kunde inte kvantifieras exakt. Slutligen fastställdes metoden för bestämning av innehållet för β-sitosterol; detektionsresultaten visade att β-sitosterol hittades i 10 satser autentiska Chuanmutong-prover och fem satser äktenskapsbrott. Därför var β-sitosterol inte unikt för äkta medicinska material. Även om viss information om kvaliteten på Chuanmutong kan tillhandahållas, är det fortfarande nödvändigt att ytterligare analysera de differentiella kromatografiska topparna i fingeravtrycken i framtiden för att se om de specifika komponenterna relaterade till effekten av Chuanmutong kan hittas.
För närvarande identifieras traditionella kinesiska läkemedel ofta av likheten mellan det kemiska fingeravtrycksspektrumet. Denna indikator är emellertid en parameter baserad på den övergripande informationen om provkromatografiska toppar, som inte kan ge mer information om identifieringen och de viktigaste skillnaderna i olika prover. Därför använde denna studie vidare CA, PCA och OPLS-DA för att identifiera den vanliga toppinformationen för kemiska fingeravtryck, hittade de viktigaste differentiella kromatografiska topparna mellan autentiska och förfalskade prover av Chuanmutong och identifierade dem framgångsrikt. Slutligen konstruerades HPLC-kopplad kemisk fingeravtryckstagning för igenkänning av flera mönster.
Eftersom det inte är ovanligt att blanda autentiska kinesiska medicinska material och deras äktenskapsbrott, såsom Fritillaria thunbergii, Herba Asari och Lonicera japonica, kommer denna metod att ge en ny strategi för tydlig och vetenskaplig identifiering av autentiska kinesiska medicinska material och deras äktenskapsbrott. Denna strategi kommer att vara av stor betydelse för att säkerställa kvaliteten på kinesiska medicinska material i klinisk tillämpning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av projektet Sichuan Traditional Chinese Medicine Administration (nr 2020JC0088, nr 2021MS203).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017381038 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD5243V | |
| β-Sitosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| C18 column | Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China | Welch Ultimate LP | |
| Chuanmutong | Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 19020103 | CMT-1 |
| Chuanmutong | Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-2 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200701 | CMT-3 |
| Chuanmutong | Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-4 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210701 | CMT-5 |
| Chuanmutong | Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210401 | CMT-6 |
| Chuanmutong | Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 200901 | CMT-7 |
| Chuanmutong | Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China | 201201 | CMT-8 |
| Chuanmutong | Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China | 201001 | CMT-9 |
| Chuanmutong | Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China | 210501 | CMT-10 |
| Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang | Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China | - | CC |
| Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. | Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China | - | DC |
| Clematis peterae Hand.-Mazz. | Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China | - | DE |
| Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils | Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | XS |
| Clematis finetiana Levl. et Vaniot. | Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China | - | SMT |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Ergosterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China | 20210201 | |
| Ethanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2021112602 | |
| Ethyl acetate | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2017042043 | |
| Formic acid | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 2016062901 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent, USA. | 1260 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| Methanol | Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd., Shanghai, China | WXBD6409V | |
| Methanol | Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China | 202010302 | |
| n-butyl alcohol | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020071047 | |
| Petroleum ether | Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 2020090125 | |
| Phosphoric acid | Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China | 20200110 | |
| SESCF-TCM version 2012 | National Pharmacopoeia Commission, China | - | http://114.247.108.158:8888/login |
| Stigmasterol | Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China | 20210201 | |
| Trichloromethane | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China | 20200214 | |
| Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 | Umetrics, Sweden | - | https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download |
| Ultrapure water machine | Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China | UPH-II-10T | |
| Ultrasonic cleaner | Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China | KH3200E |
References
- Chen, C. R. Chinese Medicine Specimen Picture Book. , Shanghai World Book Company. Shanghai. 116 (1935).
- Xiong, J., et al. Lignans from the stems of Clematis armandii ("Chuan-Mu-Tong") and their anti-neuroinflammatory activities. Journal of Ethnopharmacology. 153 (3), 737-743 (2014).
- Pan, L. L., et al. a lignan from the Chinese medicinal plant Clematis armandii, inhibits A431 cell growth via blocking p70S6/S6 kinase pathway. Integrative Cancer Therapies. 16 (3), 351-359 (2017).
- Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of The People's Republic of China: (Edition 2020). , The Medicine Science and Technology Press of China. China., Beijing. 38 (2020).
- Wang, D. G., Guo, J. L. Textual research on the materia medica and authenticity of Clematidis armandii. Lishizhen Medicine and Materia Medicine Research. 18 (11), 2696 (2007).
- Fang, Q. M., Zhang, M., Zhong, Y. Y. The natural resources and exploitation of Caulis Clematidis Armandii in Sichuan. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 20 (5), 404-406 (2005).
- Bai, M. N., Dai, Y. X., Wang, Y., Ren, Y. Y., Tan, R. Study on the identification of Caulis Clematidis Armandii. Research and Practice on Chinese Medicines. 31 (3), 13-16 (2017).
- Zhou, P. J., Li, X. F., Fu, D. H., Pu, X. Y., Zhu, G. Q. Pharmacognosy identification of Ethnomedicine Clematis ranunculoides Franchet. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 34 (3), 432-436 (2017).
- Guo, J. L., Tang, Y., Pei, J., Wang, D. G. Study on random amplified polymorphic DNA and sequence characterized amplified regions of Caulis Clematidis Armandii. Journal of Chengdu Medical College. 6 (4), 283-286 (2011).
- Liu, M. Z., Li, M. N., Yao, H., Liu, P. Molecular identification of Clematidis Armandii Caulis and its adulterants and closely related species by ITS2 sequence. Global Traditional Chinese Medicine. 4 (6), 446-450 (2011).
- Liu, J. J., Chen, X., Wei, Z. Q., Li, B. Chemical constituents and identification of the caules of Clematis armandii Franch.and Clematis montana Buch.-Ham. Natural Product Research and Development. 22 (6), 998-1000 (2010).
- Yang, T. R., Xu, Z., Shi, Y. N. Studies on four compounds from Clematis Montana. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 10 (4), 142-143 (2008).
- Yan, L. H., Xu, L. Z., Zhou, Z. M., Yang, S. L. Chemical constituents from stems of Clematis armandii(I). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 38 (3), 340-342 (2007).
- Li, X., et al. Traditional uses, phytochemistry, pharmacology, and toxicology of Akebiae Caulis and its synonyms: A review. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114245 (2021).
- Ye, X., et al. Diuretic effect and material basis of Clematidis Armandii Caulis in rats. China Journal of Chinese Materia Medica. 44 (9), 1889-1894 (2019).
- Kuang, Y., et al. Consistency study of Caulis Clematidis Armandii and its traditionally used products and counterfeit species based on efficacy and pharmacognosy. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 36 (3), 115-121 (2020).
- Li, Y., et al. Quality assessment of Asarum heterotropoides var. mandshuricum based on HPLC multi-component determination and multiple pattern recognition method of fingerprint. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 238-243 (2022).
- Li, Y., et al. Determination of multi-components of Paeoniae Alba Radix based on fingerprints and chemical pattern recognition. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 231-237 (2022).
- Li, H. H., et al. Comparative investigation for raw and processed products of Euodiae Fructus based on high-performance liquid chromatography fingerprints and chemical pattern recognition. Chemistry & Biodiversity. 18 (8), 2100281 (2021).
- Dong, L. J., et al. Study on suitable distribution areas of Kawa Kimichi produced in Sichuan province-based on remote sensing and GIS-A case study of Clematis Armandii. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 17 (11), 2398-2404 (2015).
- Tang, S. W., Pei, J., Li, F. Y. Morphological and histological identification of Chuanmutong. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 15 (1), 19-21 (2000).
- Li, B., Chen, X., Fang, Q. M., Zhang, B. J., Wei, Z. Q. Quality Research of Chuanmutong. Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine. 27 (6), 58-60 (2009).
- Wu, W. J., Wan, M. M., Cao, Y. H., Tan, R., Song, L. K. Research on the Quality Standard of Chuanmutong. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 33 (2), 313-315 (2015).
- Wei, Z. Q., Chen, X., Li, B., Dong, X. P. Determination of stigmasterol in Clematis armandii Franch and Clematis montana Buch-Ham. by HPLC. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 20 (3), 574-575 (2009).
- Qing, L. S., et al. Determination of oleanolic acid in Caulis clematidis armandii by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (3), 273-274 (2006).
- Yang, S. D., Wang, R., Fu, D. Y., Guo, J. J., Tan, W. Y. Determination on oleanolic acid in caulis clematidis armandii by microwave assisted extraction-HPLC/MS. Anhui Academy of Agricultural Sciences. 38 (13), 6929-6931 (2010).
