Automatically Generated

Summary

We introduceren een methode voor het kwantificeren van Stentor-gewenning met behulp van een microcontroller-bordgekoppeld apparaat dat mechanische pulsen kan leveren met een gespecificeerde kracht en frequentie. We nemen ook methoden op voor het assembleren van het apparaat en het opzetten van het experiment op een manier die externe verstoringen minimaliseert.

Abstract

Leren wordt meestal geassocieerd met een complex zenuwstelsel, maar er is steeds meer bewijs dat het leven op alle niveaus, tot aan enkele cellen, intelligent gedrag kan vertonen. In zowel natuurlijke als kunstmatige systemen is leren het adaptief bijwerken van systeemparameters op basis van nieuwe informatie, en intelligentie is een maat voor het computationele proces dat het leren vergemakkelijkt. Stentor coeruleus is een eencellig vijverbewonend organisme dat gewenning vertoont, een vorm van leren waarbij een gedragsrespons afneemt na een herhaalde stimulus. Stentor trekt samen als reactie op mechanische stimulatie, wat een schijnbare ontsnappingsreactie is van aquatische roofdieren. Herhaalde verstoringen met lage kracht induceren echter gewenning, aangetoond door een progressieve vermindering van de contractiekans. Hier introduceren we een methode voor het kwantificeren van Stentor-gewenning met behulp van een microcontroller-bordgekoppeld apparaat dat mechanische pulsen kan leveren met een gespecificeerde kracht en frequentie, inclusief methoden voor het bouwen van het apparaat en het opzetten van het experiment op een manier die externe verstoringen minimaliseert. In tegenstelling tot de eerder beschreven benaderingen voor het mechanisch stimuleren van Stentor, maakt dit apparaat het mogelijk om de kracht van stimulatie te variëren onder computerbesturing in de loop van een enkel experiment, waardoor de verscheidenheid aan invoersequenties die kunnen worden toegepast, aanzienlijk toeneemt. Het begrijpen van gewenning op het niveau van een enkele cel zal helpen bij het karakteriseren van leerparadigma’s die onafhankelijk zijn van complexe circuits.

Introduction

Leren wordt meestal geassocieerd met een complex zenuwstelsel, maar er is steeds meer bewijs dat het leven op alle niveaus, tot aan enkele cellen, intelligent gedrag kan vertonen. In zowel natuurlijke als kunstmatige systemen is leren het adaptief bijwerken van systeemparameters op basis van nieuwe informatie¹, en intelligentie is een maat voor het computationele proces dat leren vergemakkelijkt².

Stentor coeruleus is een eencellig vijverbewonend organisme dat gewenning vertoont, een vorm van leren waarbij een gedragsreactie afneemt na een herhaalde stimulus³. Stentor trekt samen als reactie op mechanische stimulatie³, wat een schijnbare ontsnappingsreactie is van aquatische roofdieren. Herhaalde verstoringen met lage kracht induceren echter gewenning, aangetoond door een progressieve vermindering van de contractiekans³. De gewenning Stentor trekt nog steeds samen na het ontvangen van krachtige mechanische stimulatie⁴ of fotische stimulatie⁵. Deze observaties, die overeenkomen met de klassieke criteria van Thompson en Spencer voor gewenning bij dieren⁶, suggereren sterk dat de oorspronkelijke contractiele responsafname te wijten is aan leren in plaats van vermoeidheid of ATP-uitputting. Als vrijlevende cel kan Stentor worden bestudeerd zonder veel interferentie van omliggende cellen, zoals het geval zou zijn in een meercellig weefsel. Verschillende extra functies maken Stentor een verhandelbaar systeem voor het bestuderen van leren: de grote omvang (1 mm), de kwantificeerbare gewenningsrespons³, het gemak van injectie en micromanipulatie⁷, het volledig gesequencede genoom⁸ en de beschikbaarheid van RNA-interferentie (RNAi) tools⁹. Het gebruik van dit modelorganisme om het leren van cellen zonder hersenen of zenuwstelsel te verkennen, vereist een reproduceerbare procedure voor het stimuleren van Stentor-cellen en het meten van de respons.

Hier introduceren we een methode voor het kwantificeren van Stentor-gewenning met behulp van een microcontroller-bordgekoppeld apparaat dat mechanische pulsen kan leveren met een gespecificeerde kracht en frequentie, inclusief methoden voor het bouwen van het apparaat en het opzetten van het experiment op een manier die externe verstoringen minimaliseert (figuur 1). Het begrijpen van gewenning op het niveau van een enkele cel zal helpen bij het karakteriseren van leerparadigma’s die onafhankelijk zijn van complexe circuits.

Figuur 1: Instelling van het gewenningsexperiment. De petriplaat met Stentor wordt bovenop de flexibele metalen liniaal van het gewenningsapparaat geplaatst. De armatuur van het gewenningsapparaat raakt vervolgens de metalen liniaal met een gespecificeerde kracht en frequentie, waardoor een stimulusgolf over het veld van cellen wordt geproduceerd. De USB microscoopcamera registreert de reacties van de Stentor op de stimulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Samenvatting van de workflow van het gewenningsexperiment. De figuur toont de basisstappen die betrokken zijn bij het bestuderen van Stentor met behulp van het gewenningsapparaat. De figuur is gemaakt met BioRender.com. Aangepast van “Process Flowchart”, door BioRender.com (2022). Opgehaald uit https://app.biorender.com/biorender-templates. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Een samenvatting van de workflow van het gewenningsexperiment wordt weergegeven in figuur 2. 1. Het gewenningsapparaat monteren Haak de motordriver aan de motor (zie figuur 3).Verbind de twee draden met het label A van het bestuurdersbord met de blauwe en rode draden op de motor. Verbind de twee draden met het label B van het bestuurdersbord met de groene en zwarte draden op de motor.OPMERKING: Als u van bovenaf op het bestuurdersbord kijkt met de motordraden aan de bovenkant, moeten de vier ingangsdraden in deze volgorde op de motorkabels worden aangesloten: blauw, rood, zwart en groen. Bouw het breadboardcircuit in figuur 4, met speciale zorg om de LED’s in de juiste polariteit aan te sluiten. Verbind de Vcc (+5 V) van het bestuurdersbord naar de bovenste rail van het witte breadboard en de Gnd van het driverboard naar de onderste rail van het breadboard. Sluit de grond van het breadboard aan op de massapen van het microcontrollerbord. Sluit respectievelijk de groene LED, rode LED, schakelaar en knopdraden aan op de digitale pinnen 8, 9, 10 en 11 van het microcontrollerbord. Sluit de microcontroller board digitale pinnen 2 en 3 aan op de driver board draden Step en Dir. Sluit de microcontroller board digitale pinnen 4, 5, 6 en 7 aan op de drivers board draden.Sluit Pin 4 aan op MS1, sluit Pin 5 aan op MS2, sluit Pin 6 aan op MS3 en sluit Pin 7 aan op Enable (Inschakelen). Voed het bestuurdersbord met een 12 V-voeding. Sluit de 12 V-voeding aan op de zwart/groene adapterstekker die met twee rode draden aan de motorbestuurderskaart is bevestigd.OPMERKING: Sluit de 12 V-voeding niet aan op de stekker van de microcontroller. Download het besturingsprogramma (https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino) op het bord van de microcontroller. Gebruik een USB-kabel om het microcontrollerbord aan een computer te bevestigen, die ook zal dienen als de voedingsbron voor het microcontrollerbord. Controleer of de gebruikersbesturingselementen werken.Controleer of de schuifschakelaar de automatische modus in- en uitschakelt. In de automatische modus neemt het systeem een stap met regelmatige intervallen die door de gebruiker zijn opgegeven (zie hieronder). Controleer of de groene LED wordt ingeschakeld wanneer de automatische modus is ingeschakeld. Controleer of de rode LED 1 s knippert voordat de motor een puls uitvoert. De rode LED is een waarschuwingslampje dat aangeeft wanneer het systeem op het punt staat een mechanische puls af te geven. Test de rode knop, die een stap van 1/16 micro activeert telkens wanneer de knop wordt ingedrukt, ongeacht of het systeem zich in de automatische modus bevindt. Figuur 3: Componenten van het gewenningsapparaat. Alle gelabelde elektronica is nodig om de machine te assembleren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Elektronica schema. Dit is het circuit op het breadboard. De draden die verbinding maken met de microcontrollerkaart zijn genummerd zoals beschreven in het protocol. D1 en D2 zijn respectievelijk de rode en groene LED’s en zijn verbonden met de aarde via 330 Ω weerstanden. De twee schakelaars worden omhoog getrokken met 10 KΩ weerstanden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 2. Het instellen van het gewenningsexperiment Verkrijg Stentor. Bekleed een plaat van 35 mm met 0,01% poly-ornithine-oplossing.Voeg 3 ml van de 0,01% poly-ornithine-oplossing toe aan de plaat en laat een nacht staan. Was de plaat twee keer met ultrapuur water en één keer met gepasteuriseerd bronwater (PSW) (Materiaaltabel). Voeg 3,5 ml PSW toe aan de 35 mm plaat. Was de Stentor in een 6-well plaat (Materiaaltafel).Voeg 3 ml PSW toe aan de eerste put en 5 ml PSW aan de tweede en derde put. Gebruik een P1.000 pipet om 2 ml Stentor uit een kweekschaal toe te voegen aan de eerste put van de 6-well plaat. Identificeer individuele Stentor met een stereomicroscoop (Tabel van Materialen) en gebruik vervolgens een P20-pipet om 100 Stentor van de eerste put naar de tweede put over te brengen. Identificeer individuele Stentor met een stereomicroscoop en gebruik vervolgens een P20-pipet om 100 Stentor van de tweede put naar de derde put over te brengen. Gebruik een P200-pipet om 100 Stentor in een totaal volume van 500 μL van de derde put van de 6-wellplaat over te brengen naar de 35 mm-plaat, zodat het uiteindelijke volume in de 35 mm-plaat 4 ml is. Plak een stuk (7 cm x 7 cm) wit papier vast aan de metalen liniaal op het gewenningsapparaat. Zorg ervoor dat de linkerrand van het papier zich op 2 cm van het uiteinde van de liniaal bevindt die zich het dichtst bij de armatuur bevindt. Gebruik dubbelzijdige tape om de onderkant van de 35 mm-plaat in het midden van de 2 in x 2 in papier bovenop de liniaal op het gewenningsapparaat te bevestigen. Laat de 35 mm plaat minstens 2 uur op de gewenningsinrichting liggen (dit kan worden verlengd tot een nacht) met het deksel gesloten. Gedurende deze acclimatisatieperiode moet u de plaat in omgevingslichtomstandigheden houden die overeenkomen met de experimentele lichtomstandigheden (d.w.z. de cellen niet blootstellen aan licht / donkerfluctuaties). Zorg er bovendien voor dat de plaat geen mechanische verstoringen ondervindt van onbedoelde verdringing. Centreer de USB microscoopcamera (Table of Materials) direct boven de 35 mm plaat van Stentor. Plaats indien nodig een prop zoals een pipetpuntdoos onder de USB-microscoopcamera (Universal Serial Bus) om de hoogte aan te passen. Als alternatief kan een ringstandaard worden gebruikt om de hoogte aan te passen. Installeer de webcamrecordertoepassing op een laptop (materiaaltabel) en gebruik deze om de cellen via de microscoopingang te visualiseren.Open de webcamrecorder-app en selecteer de USB-microscoop in het vervolgkeuzemenu. Pas de scherpstelling op de USB-microscoopcamera aan zodat de cellen duidelijk in beeld zijn. Pas de positie van de USB-microscoopcamera aan om het aantal cellen in het gezichtsveld te maximaliseren. Open de seriële monitor van de microcontrollerkaart: selecteer No Line Ending en stel deze in op 9.600 baud. Gebruik het l-commando op het bordprogramma van de microcontroller om het armatuur te laten zakken totdat het de liniaal nauwelijks raakt. Gebruik het r-commando om de arm indien nodig op te heffen om de exacte positie aan te passen.OPMERKING: Als de armatuur zich op een aanzienlijke afstand van de liniaal bevindt, typt u de opdracht d om de stroom van de motorspoel uit te schakelen, zodat de arm handmatig naar de liniaal kan worden verplaatst. Nadat u de arm handmatig hebt bewogen, gebruikt u het e-commando om de stroom van de motorspoel in te schakelen en de arm op zijn plaats te houden. Wanneer het correct wordt neergelaten vóór het begin van een experiment, moet de onderste punt van het armatuur zich op 1 cm afstand van de linkerrand van de liniaal bevinden. De armatuur levert de mechanische puls door de liniaal te raken. Gebruik de opdracht i om de automatische modus op het gewenningsapparaat te initialiseren. Voer de stapgrootte in de opdrachtregel in. Niveau 5 is de kleinste stap en niveau 1 is de grootste stap. Niveau 4 is de stapgrootte die wordt gebruikt voor gewenningsexperimenten bij baseline.OPMERKING: Een niveau 5-stimulus resulteert in een neerwaartse verplaatsing van de liniaal met ~ 0,5 mm; Niveau 4 resulteert in een neerwaartse verplaatsing met ~ 1 mm; Niveau 3 resulteert in een neerwaartse verplaatsing met ~ 2 mm; Niveau 2 resulteert in een neerwaartse verplaatsing met ~ 3-4 mm; en niveau 1 resulteert in een neerwaartse verplaatsing met ~ 8 mm. Een niveau 5 stimulus resulteert in een neerwaartse piekkracht van de armatuur tegen de liniaal van ~0,122 N; Niveau 4 resulteert in een neerwaartse piekkracht van ~0,288 N; en Niveau 3 resulteert in een neerwaartse piekkracht van ~0,557 N. De neerwaartse krachten gegenereerd door niveau 1 en niveau 2 zijn moeilijker empirisch te kwantificeren met een rollenbank vanwege de significante liniaaloscillaties die optreden nadat de armatuur contact maakt. Voer de tijd tussen pulsen in minuten in. Het interval dat wordt gebruikt voor gewenningsexperimenten bij baseline is 1 min. Begin met het maken van een video met de webcamrecorder-app door op de rode opnameknop te drukken. Draai vervolgens de schakelaar op het gewenningsapparaat om het experiment met de eerste geautomatiseerde mechanische pulsafgifte te beginnen. 3. De experimentvideo analyseren Vlak voordat de eerste mechanische puls op de video verschijnt, pauzeer en tel je het aantal Stentors dat beide aan de onderkant van de 35 mm plaat zijn verankerd en in een langwerpige, trompetachtige vorm zijn uitgeschoven (figuur 5A, video 1). Tel direct na de eerste puls het aantal Stentors dat zowel aan de onderkant van de plaat is verankerd als in een balachtige vorm is samengetrokken (Figuur 5B, Video 1).OPMERKING: Gecontracteerde cellen zijn gemakkelijk te onderscheiden van langwerpige cellen omdat Stentor hun lichaamslengte met meer dan 50% verkort binnen 10 ms tijdens een contractiegebeurtenis3. Deel de tweede telling door de eerste telling om de fractie van Stentor te bepalen die is samengetrokken als reactie op de mechanische stimulus. Herhaal stap 3.1-3.3 voor alle mechanische pulsen in de experimentvideo. Figuur 5: Stentor trekt samen na ontvangst van een mechanische stimulus. (A) De Stentor bevinden zich in hun langwerpige toestand en zijn verankerd aan de onderkant van de petriplaat. (B) De Stentor zijn samengetrokken na het ontvangen van een niveau 4 mechanische stimulatie van het gewenningsapparaat. De beelden zijn gemaakt met een USB-microscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Video 1: Video van Stentor contracteren. De Stentor ontvangt elke minuut een level 4 mechanische stimulus van het gewenningsapparaat. Deze cellen zijn nog niet gewend, dus trekken ze samen na ontvangst van de pols. De cellen bevinden zich in de petriplaat die bovenop het gewenningsapparaat is geplaatst. Klik hier om deze video te downloaden.

Representative Results

De hierboven beschreven methode, waarbij gebruik wordt gemaakt van de mechanische puls van niveau 4 met een frequentie van 1 tik/min, moet resulteren in een geleidelijke vermindering van de contractiekans van de Stentor binnen 1 uur. Dit is indicatief voor gewenning (zie figuur 6, video 2). Figuur 6: Baseline gewenning. De contractiekans van Stentor neemt geleidelijk af in de loop van 1 uur na ontvangst van niveau 4 mechanische pulsen met een frequentie van 1 tik / min (n = 22-27). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Filmpje 2. Video van de gewende Stentor. De cellen ontvangen een niveau 4 mechanische stimulus na 1 uur ontvangen van mechanische pulsen van dezelfde kracht met een frequentie van 1 tik / min. De meeste cellen zijn gedurende het uur gewend geraakt aan de prikkels en trekken dus niet samen. Klik hier om deze video te downloaden. Het veranderen van de kracht en/of frequentie van de mechanische pulsafgifte kan de gewenningsdynamiek van de Stentor veranderen. Als u bijvoorbeeld de niveau 2-puls op een frequentie van 1 tik/min gebruikt, wordt gewenning in de loop van 1 uur uitgesloten (zie figuur 7). Een niveau 5-puls zou contracties moeten uitlokken in weinig tot nul Stentor. Figuur 7: Gebrek aan gewenning binnen 1 uur voor sterkere krachten. De contractiekans van Stentor neemt niet merkbaar af in de loop van 1 uur na ontvangst van niveau 2 mechanische pulsen met een frequentie van 1 tik / min (n = 7-33). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De meest kritische stappen in het protocol hebben betrekking op het waarborgen dat de Stentor in optimale omstandigheden blijft voor weeën. De contractierespons in de gewenningstest vereist dat Stentors aan een oppervlak worden verankerd met behulp van hun kleverige holdfast, omdat ze zelden samentrekken wanneer ze vrij zwemmen. Het bodemoppervlak van de petriplaat van 35 mm die wordt gebruikt voor gewenningsexperimenten is echter meestal niet bevorderlijk voor verankering, tenzij bedekt met poly-ornithine. Bovendien kan de Stentor niet worden blootgesteld aan mechanische verstoring gedurende minimaal 2 uur voor aanvang van het gewenningsexperiment, omdat de Stentor vergeettijdschaal 2-6 uur³ is. Als Stentor mechanische stimulatie ontvangt binnen 2 uur na de starttijd van het gewenningsexperiment, bestaat de mogelijkheid dat deze voorafgaande stimulatie voorafgaand aan het experiment een licht niveau van gewenning induceert, waardoor de contractiekans wordt verminderd nadat het gewenningsapparaat de eerste mechanische puls heeft geleverd. Ten slotte is het tijdens de analysefase belangrijk om alleen het aantal Stentor te tellen dat samentrekt na een puls – in plaats van incidentele spontane contracties die optreden voorafgaand aan de pulsafgifte – om een nauwkeurige uitlezing te verkrijgen van de fractie cellen die is samengetrokken als reactie op de mechanische stimulatie.

Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast om verschillende soorten gewenningsdynamiek te bestuderen door de kracht en frequentie van de mechanische pulsen die door het gewenningsapparaat worden geleverd, te veranderen. Dit biedt ook de mogelijkheid om andere vormen van leren te verkennen, zoals sensibilisatie, die in Stentor kunnen voorkomen. De programmacode van het microcontrollerbord zelf kan ook worden aangepast om verschillende patronen van mechanische kranen aan de Stentor te leveren.

Een mogelijk probleem om op te lossen met dit protocol is de lage frequentie van Stentor-verankering , wat het aantal Stentor dat kan worden waargenomen in het gewenningsexperiment kan beperken. De verankeringsfrequentie wordt soms verminderd in Stentorculturen die niet recent zijn gevoed of besmet zijn. Om dit probleem aan te pakken, moet men een verse partij Stentor wassen om een nieuwe cultuur te starten en ze regelmatig voeren volgens het protocol beschreven in Lin et ^al.10.

Dit protocol is beperkt in die zin dat slechts één plaat Stentor tegelijk kan worden getest, wat resulteert in relatief lage doorvoermetingen. Bovendien maakt de huidige software de automatisering van eencellige beeldanalyse niet mogelijk. De meeste verkregen gegevens bevinden zich dus op populatieniveau. Toekomstige modellen van het gewenningsapparaat en beeldanalysetools kunnen experimenten met een hoge doorvoersnelheid vergemakkelijken.

Gewenning in Stentor is eerder bestudeerd met behulp van methoden beschreven door Wood³, maar dit nieuwe protocol maakt het mogelijk om experimenten te automatiseren. Automatisering stelt de onderzoeker niet alleen in staat om reproductief mechanische pulsen van een bepaalde kracht en frequentie af te leveren, maar vergemakkelijkt ook langdurige gewenningsexperimenten, omdat het apparaat dagenlang zonder toezicht kan worden laten draaien. Bovendien vermindert het gebruik van een stappenmotor in plaats van de solenoïde die wordt gebruikt in Wood’s experimenten³ het risico op demagnetisatie in de loop van de tijd en maakt het ook mogelijk om de sterkte van de stimulus te variëren in de loop van een enkel experiment.

Het bestuderen van cellulaire gewenning kan klinische inzichten onthullen voor aandoeningen zoals attention-deficit / hyperactivity disorder (ADHD) en het syndroom van Gilles de la Tourette waarbij de gewenning is aangetast¹¹. Stentor-gewenningsmechanismen kunnen ook nieuwe niet-synaptische leerparadigma’s onthullen die onafhankelijk zijn van complexe cellulaire circuits. Ten slotte kunnen inzichten over eencellig leren methoden inspireren voor het herprogrammeren van cellen in meercellige weefsels – een andere potentiële manier om ziekten te bestrijden.

Materials

0.01% Poly-ornithine	Millipore Sigma	P4957	Used to coat Petri plate
35-mm Petri plate	Benz Microscope Optics Center Inc.	L331	Contains Stentor during experiments
6-well plate	StemCell Technologies	38016	Used to wash Stentor
Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1)	Thorlabs	MB424	Used to construct habituation device
Big easy driver stepper motor driver board (x1)	Sparkfun	ROB-12859	Used to construct habituation device
Construction rail, 1" x 5'' (x2)	Newport	Newport CR-1	Used to construct habituation device
Laptop	Apple Store	https://www.apple.com/macbook-air-m1/	Connect laptop to USB microscope to visualize experiments
Large right-angle bracket (x1)	Thorlabs	AP90RL	Used to construct habituation device
Microcontroller board	Arduino	A000066	Used to control habituation device
Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead	Stepperonline.com	5-17HS19-2004S1	Used to construct habituation device
Pasteurized spring water	Carolina	132458	Media for Stentor experiments
Right-angle bracket (x3)	Thorlabs	AP90	Used to construct habituation device
Stemi 2000 stereo microscope	Zeiss		Used to visualize Stentor during wash steps
Stentor coeruleus	Carolina	131598	These are the cells used for habituation experiments
USB microscope	Celestron	44308	Used to visualize and record experiments
Webcam recorder	Apple Store	https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12	Install this application to take videos of experiments