Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

स्टेंटर कोएरुलस में आदत का अध्ययन

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64692
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of California San Francisco

Summary

हम एक माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड-लिंक्ड उपकरण का उपयोग करके स्टेंटर आदत को निर्धारित करने के लिए एक विधि पेश करते हैं जो एक निर्दिष्ट बल और आवृत्ति पर यांत्रिक दालों को वितरित कर सकता है। हम उपकरण को इकट्ठा करने और प्रयोग को इस तरह से स्थापित करने के तरीकों को भी शामिल करते हैं जो बाहरी गड़बड़ी को कम करता है।

Abstract

सीखना आमतौर पर एक जटिल तंत्रिका तंत्र से जुड़ा होता है, लेकिन इस बात के प्रमाण बढ़ रहे हैं कि सभी स्तरों पर जीवन, एकल कोशिकाओं तक, बुद्धिमान व्यवहार प्रदर्शित कर सकता है। प्राकृतिक और कृत्रिम दोनों प्रणालियों में, सीखना नई जानकारी के आधार पर सिस्टम मापदंडों का अनुकूली अद्यतन है, और बुद्धि कम्प्यूटेशनल प्रक्रिया का एक उपाय है जो सीखने की सुविधा प्रदान करता है। स्टेंटर कोएरुलस एक एककोशिकीय तालाब में रहने वाला जीव है जो आदत प्रदर्शित करता है, सीखने का एक रूप जिसमें बार-बार उत्तेजना के बाद व्यवहार प्रतिक्रिया कम हो जाती है। स्टेंटर यांत्रिक उत्तेजना के जवाब में सिकुड़ता है, जो जलीय शिकारियों से एक स्पष्ट पलायन प्रतिक्रिया है। हालांकि, बार-बार कम-बल गड़बड़ी आदत को प्रेरित करती है, जो संकुचन की संभावना में प्रगतिशील कमी से प्रदर्शित होती है। यहां, हम एक माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड-लिंक्ड उपकरण का उपयोग करके स्टेंटर आदत को निर्धारित करने के लिए एक विधि पेश करते हैं जो एक निर्दिष्ट बल और आवृत्ति पर यांत्रिक दालों को वितरित कर सकता है, जिसमें उपकरण के निर्माण और प्रयोग को इस तरह से स्थापित करने के तरीके शामिल हैं जो बाहरी गड़बड़ी को कम करता है। यांत्रिक रूप से स्टेंटर को उत्तेजित करने के लिए पहले वर्णित दृष्टिकोणों के विपरीत, यह उपकरण एक ही प्रयोग के दौरान कंप्यूटर नियंत्रण के तहत उत्तेजना के बल को भिन्न करने की अनुमति देता है, इस प्रकार इनपुट अनुक्रमों की विविधता में काफी वृद्धि होती है जिसे लागू किया जा सकता है। एकल कोशिका के स्तर पर आदत को समझना सीखने के प्रतिमानों को चिह्नित करने में मदद करेगा जो जटिल सर्किटरी से स्वतंत्र हैं।

Introduction

सीखना आमतौर पर एक जटिल तंत्रिका तंत्र से जुड़ा होता है, लेकिन इस बात के प्रमाण बढ़ रहे हैं कि सभी स्तरों पर जीवन, एकल कोशिकाओं तक, बुद्धिमान व्यवहार प्रदर्शित कर सकता है। प्राकृतिक और कृत्रिम दोनों प्रणालियों में, सीखना नई जानकारी1 के आधार पर सिस्टम मापदंडों का अनुकूली अद्यतन है, और बुद्धि कम्प्यूटेशनल प्रक्रिया का एक उपाय है जो सीखने की सुविधा प्रदान करता है।

स्टेंटर कोरुलस एक एककोशिकीय तालाब में रहने वाला जीव है जो आदत प्रदर्शित करता है, सीखने का एक रूप जिसमें बार-बार उत्तेजना के बाद व्यवहार प्रतिक्रिया कम हो जातीहै। स्टेंटर यांत्रिक उत्तेजना 3 के जवाब मेंसिकुड़ता है, जो जलीय शिकारियों से एक स्पष्ट पलायन प्रतिक्रिया है। हालांकि, बार-बार कम-बल गड़बड़ी आदत को प्रेरित करती है, जो संकुचन संभावना 3 में प्रगतिशील कमी से प्रदर्शित होतीहै। उच्च-बल यांत्रिक उत्तेजना4 या फोटिक उत्तेजना 5 प्राप्त करने के बाद भी आदतयुक्त स्टेंटर सिकुड़जाता है। ये अवलोकन, जो जानवरों में आदत के लिए थॉम्पसन और स्पेंसर के क्लासिकमानदंडों के साथ संरेखित हैं, दृढ़ता से सुझाव देते हैं कि मूल सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रिया ह्रास थकान या एटीपी की कमी के बजाय सीखने के कारण है। एक मुक्त-जीवित कोशिका के रूप में, स्टेंटर का अध्ययन आसपास की कोशिकाओं से बहुत हस्तक्षेप के बिना किया जा सकता है, जैसा कि एक बहुकोशिकीय ऊतक में होगा। कई अतिरिक्त विशेषताएं स्टेंटर को सीखने का अध्ययन करने के लिए एक व्यावहारिक प्रणाली बनाती हैं: इसका बड़ा आकार (1 मिमी), इसकी मात्रात्मक आदत प्रतिक्रिया3, इंजेक्शन और माइक्रोमैनिपुलेशन7 में आसानी, पूरी तरह से अनुक्रमित जीनोम8, और आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) उपकरण9 की उपलब्धता। मस्तिष्क या तंत्रिका तंत्र के बिना सेल सीखने का पता लगाने के लिए इस मॉडल जीव का उपयोग करने के लिए स्टेंटर कोशिकाओं को उत्तेजित करने और प्रतिक्रिया को मापने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रक्रिया की आवश्यकता होती है।

यहां, हम एक माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड-लिंक्ड उपकरण का उपयोग करके स्टेंटर आदत को निर्धारित करने के लिए एक विधि पेश करते हैं जो एक निर्दिष्ट बल और आवृत्ति पर यांत्रिक दालों को वितरित कर सकता है, जिसमें उपकरण के निर्माण और प्रयोग को इस तरह से स्थापित करने के तरीके शामिल हैं जो बाहरी गड़बड़ी को कम करता है (चित्रा 1)। एकल कोशिका के स्तर पर आदत को समझना सीखने के प्रतिमानों को चिह्नित करने में मदद करेगा जो जटिल सर्किटरी से स्वतंत्र हैं।

Figure 1
चित्रा 1: आदत प्रयोग सेटअप। स्टेंटर युक्त पेट्री प्लेट को आदत डिवाइस के लचीले धातु शासक के ऊपर रखा जाता है। आदत उपकरण का आर्मेचर तब एक निर्दिष्ट बल और आवृत्ति पर धातु शासक से टकराता है, जिससे कोशिकाओं के क्षेत्र में एक उत्तेजना लहर पैदा होती है। यूएसबी माइक्रोस्कोप कैमरा उत्तेजना के लिए स्टेंटर की प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: आदत प्रयोग वर्कफ़्लो का सारांश। आंकड़ा आदत उपकरण का उपयोग करके स्टेंटर का अध्ययन करने में शामिल बुनियादी चरणों को दर्शाता है। यह आंकड़ा BioRender.com के साथ बनाया गया था। BioRender.com (2022) द्वारा "प्रोसेस फ्लोचार्ट" से अनुकूलित। https://app.biorender.com/biorender-templates से प्राप्त किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Protocol

नोट: आदत प्रयोग वर्कफ़्लो का सारांश चित्रा 2 में दिखाया गया है।

1. आदत उपकरण को इकट्ठा करना

  1. मोटर चालक को मोटर से हुक करें ( चित्र 3 देखें)।
    1. ड्राइवर बोर्ड से ए लेबल वाले दो तारों को मोटर पर नीले और लाल तारों से कनेक्ट करें। ड्राइवर बोर्ड से बी लेबल वाले दो तारों को मोटर पर हरे और काले तारों से कनेक्ट करें।
      नोट: शीर्ष पर मोटर तारों के साथ ऊपर से ड्राइवर बोर्ड पर नीचे देखते हुए, चार इनपुट तारों को इस क्रम में मोटर लीड से जुड़ना चाहिए: नीला, लाल, काला और हरा।
  2. एलईडी को सही ध्रुवीयता में जोड़ने के लिए विशेष देखभाल के साथ चित्रा 4 में दिखाए गए ब्रेडबोर्ड सर्किट का निर्माण करें।
  3. वीसीसी (+5 वी) को ड्राइवर बोर्ड से सफेद ब्रेडबोर्ड की शीर्ष रेल से और जीएनडी को ड्राइवर बोर्ड से ब्रेडबोर्ड की निचली रेल से कनेक्ट करें।
  4. ब्रेडबोर्ड की जमीन को माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड के ग्राउंड पिन से कनेक्ट करें। हरे एलईडी, लाल एलईडी, स्विच और बटन तारों को क्रमशः माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड डिजिटल पिन 8, 9, 10 और 11 से कनेक्ट करें।
  5. माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड डिजिटल पिन 2 और 3 को ड्राइवर बोर्ड के तारों चरण और दीर से कनेक्ट करें।
  6. माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड डिजिटल पिन 4, 5, 6 और 7 को ड्राइवर बोर्ड के तारों से कनेक्ट करें।
    1. पिन 4 को MS1 से कनेक्ट करें, Pin 5 को MS2 से कनेक्ट करें, Pin 6 को MS3 से कनेक्ट करें, और सक्षम करने के लिए Pin 7 कनेक्ट करें।
  7. ड्राइवर बोर्ड को 12 वी बिजली की आपूर्ति के साथ पावर दें। मोटर ड्राइवर बोर्ड पर दो लाल तारों से जुड़े काले / हरे एडाप्टर प्लग में 12 वी की आपूर्ति प्लग करें।
    नोट: माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड प्लग में 12 वी आपूर्ति प्लग न करें।
  8. माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड पर नियंत्रण प्रोग्राम (https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino) डाउनलोड करें।
  9. माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड को कंप्यूटर से जोड़ने के लिए यूएसबी केबल का उपयोग करें, जो माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड के लिए पावर स्रोत के रूप में भी काम करेगा।
  10. जाँचें कि उपयोगकर्ता नियंत्रण कार्य कर रहे हैं.
    1. पुष्टि करें कि स्लाइड स्विच स्वचालित मोड को चालू और बंद कर देता है। स्वचालित मोड में, सिस्टम उपयोगकर्ता द्वारा निर्दिष्ट नियमित अंतराल पर एक कदम उठाएगा (नीचे देखें)।
    2. जांचें कि स्वचालित मोड चालू होने पर हरे रंग का एलईडी चालू हो जाता है।
    3. जांचें कि मोटर द्वारा पल्स लागू करने से पहले लाल एलईडी 1 सेकंड चमकता है। लाल एलईडी एक चेतावनी प्रकाश है जो इंगित करता है कि सिस्टम एक यांत्रिक पल्स देने वाला है।
    4. लाल बटन का परीक्षण करें, जो हर बार बटन को धक्का देने पर 1/16 माइक्रो चरण को ट्रिगर करता है, भले ही सिस्टम स्वचालित मोड में हो।

Figure 3
चित्रा 3: आदत उपकरण के घटक। मशीन को इकट्ठा करने के लिए सभी लेबल किए गए इलेक्ट्रॉनिक्स की आवश्यकता होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: इलेक्ट्रॉनिक्स योजनाबद्ध। यह ब्रेडबोर्ड पर सर्किट है। माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड से जुड़ने वाले तार प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में क्रमांकित हैं। डी 1 और डी 2 क्रमशः लाल और हरे रंग के एलईडी हैं, और 330 Ω प्रतिरोधकों के माध्यम से जमीन से जुड़े हुए हैं। दो स्विच ों को 10 K3 प्रतिरोधकों के साथ खींचा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. आदत प्रयोग स्थापित करना

  1. स्टेंटर प्राप्त करें।
  2. 0.01% पॉली-ऑर्निथिन समाधान के साथ 35 मिमी प्लेट को कोट करें।
    1. प्लेट में 0.01% पॉली-ऑर्निथिन समाधान के 3 एमएल जोड़ें और रात भर छोड़ दें।
    2. प्लेट को दो बार अल्ट्राप्योर पानी से और एक बार पाश्चुरीकृत स्प्रिंग वाटर (पीएसडब्ल्यू) (सामग्री की तालिका) से धोएं।
  3. 35 मिमी प्लेट में 3.5 एमएल पीएसडब्ल्यू जोड़ें।
  4. स्टेंटर को 6-वेल प्लेट (सामग्री की तालिका) में धो लें।
    1. पहले कुएं में 3 एमएल पीएसडब्ल्यू और दूसरे और तीसरे कुओं में 5 एमएल पीएसडब्ल्यू जोड़ें। 6-वेल प्लेट के पहले कुएं में कल्चर डिश से 2 एमएल स्टेंटर जोड़ने के लिए पी 1,000 पिपेट का उपयोग करें।
    2. स्टीरियो माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका) के साथ व्यक्तिगत स्टेंटर की पहचान करें और फिर पहले कुएं से दूसरे कुएं में 100 स्टेंटर स्थानांतरित करने के लिए पी 20 पिपेट का उपयोग करें।
    3. स्टीरियो माइक्रोस्कोप के साथ व्यक्तिगत स्टेंटर की पहचान करें और फिर दूसरे कुएं से तीसरे कुएं में 100 स्टेंटर स्थानांतरित करने के लिए पी 20 पिपेट का उपयोग करें।
  5. 6-वेल प्लेट के तीसरे कुएं से 35 मिमी प्लेट में 500 μL की कुल मात्रा में 100 स्टेंटर को स्थानांतरित करने के लिए P200 पिपेट का उपयोग करें ताकि 35 मिमी प्लेट में अंतिम मात्रा 4 एमएल हो।
  6. आदत उपकरण पर धातु शासक को सफेद कागज का एक टुकड़ा (7 सेमी x 7 सेमी) टेप करें। सुनिश्चित करें कि कागज का बायां किनारा आर्मेचर के सबसे करीब शासक के अंत से 2 सेमी है।
  7. आदत डिवाइस पर शासक के ऊपर कागज में 2 में x 2 के केंद्र में 35 मिमी प्लेट के निचले हिस्से का पालन करने के लिए डबल-साइडेड टेप का उपयोग करें।
  8. ढक्कन बंद होने के साथ आदत डिवाइस पर 35 मिमी प्लेट को कम से कम 2 घंटे के लिए छोड़ दें (इसे रात भर तक बढ़ाया जा सकता है)। इस अनुकूलन अवधि के दौरान, प्लेट को परिवेश प्रकाश स्थितियों में रखें जो प्रयोगात्मक प्रकाश स्थितियों से मेल खाते हैं (यानी, कोशिकाओं को प्रकाश / अंधेरे के उतार-चढ़ाव के अधीन न करें)। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि प्लेट आकस्मिक धक्का-मुक्की से किसी भी यांत्रिक गड़बड़ी का अनुभव नहीं करती है।
  9. स्टेंटर की 35 मिमी प्लेट के ऊपर सीधे यूएसबी माइक्रोस्कोप कैमरा (सामग्री की तालिका) को केंद्रीकृत करें। यदि आवश्यक हो, तो ऊंचाई को समायोजित करने के लिए सार्वभौमिक सीरियल बस (यूएसबी) माइक्रोस्कोप कैमरे के नीचे पिपेट टिप बॉक्स जैसे प्रोप रखें। वैकल्पिक रूप से, ऊंचाई को समायोजित करने के लिए एक रिंग स्टैंड का उपयोग किया जा सकता है।
  10. एक लैपटॉप (सामग्री की तालिका) पर वेबकैम रिकॉर्डर एप्लिकेशन स्थापित करें और माइक्रोस्कोप इनपुट के माध्यम से कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए इसका उपयोग करें।
    1. वेबकैम रिकॉर्डर ऐप खोलें और ड्रॉपडाउन मेनू से यूएसबी माइक्रोस्कोप का चयन करें। यूएसबी माइक्रोस्कोप कैमरे पर फोकस समायोजित करें ताकि कोशिकाएं स्पष्ट रूप से दिखाई दें।
    2. दृश्य के क्षेत्र में कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम करने के लिए यूएसबी माइक्रोस्कोप कैमरे की स्थिति समायोजित करें।
  11. माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड सीरियल मॉनिटर खोलें: नो लाइन एंडिंग का चयन करें और इसे 9,600 बॉड पर सेट करें।
  12. आर्मेचर को कम करने के लिए माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड प्रोग्राम पर एल कमांड का उपयोग करें जब तक कि यह शासक को मुश्किल से न छू ले। सटीक स्थिति को समायोजित करने के लिए यदि आवश्यक हो तो हाथ को उठाने के लिए आर कमांड का उपयोग करें।
    नोट: यदि आर्मेचर शासक से एक महत्वपूर्ण दूरी पर है, तो मोटर कॉइल करंट को अक्षम करने के लिए डी कमांड टाइप करें ताकि हाथ को मैन्युअल रूप से शासक की ओर ले जाया जा सके। हाथ को मैन्युअल रूप से स्थानांतरित करने के बाद, मोटर कॉइल करंट को सक्षम करने के लिए ई कमांड का उपयोग करें और हाथ को स्थिति में लॉक रखें। जब एक प्रयोग की शुरुआत से पहले ठीक से उतारा जाता है, तो आर्मेचर का निचला सिरा शासक के बाएं किनारे से 1 सेमी दूर होना चाहिए। आर्मेचर शासक को मारकर यांत्रिक पल्स को वितरित करेगा।
  13. आदत डिवाइस पर स्वचालित मोड प्रारंभ करने के लिए i आदेश का उपयोग करें।
  14. आदेश पंक्ति में चरण आकार दर्ज करें। स्तर 5 सबसे छोटा कदम है, और स्तर 1 सबसे बड़ा कदम है। स्तर 4 बेसलाइन आदत प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाने वाला चरण आकार है।
    नोट: एक स्तर 5 उत्तेजना के परिणामस्वरूप शासक का नीचे की ओर विस्थापन ~ 0.5 मिमी होता है; स्तर 4 के परिणामस्वरूप ~ 1 मिमी तक नीचे की ओर विस्थापन होता है; स्तर 3 के परिणामस्वरूप ~ 2 मिमी तक नीचे की ओर विस्थापन होता है; स्तर 2 के परिणामस्वरूप ~ 3-4 मिमी तक नीचे की ओर विस्थापन होता है; और स्तर 1 के परिणामस्वरूप ~ 8 मिमी तक नीचे की ओर विस्थापन होता है। एक स्तर 5 उत्तेजना के परिणामस्वरूप ~ 0.122 एन के शासक के खिलाफ आर्मेचर का नीचे की ओर चरम बल होता है; स्तर 4 के परिणामस्वरूप ~ 0.288 एन का नीचे का शिखर बल होता है; और स्तर 3 के परिणामस्वरूप ~ 0.557 एन का नीचे का शिखर बल होता है। लेवल 1 और लेवल 2 द्वारा उत्पन्न नीचे की ओर के बलों को डायनेमोमीटर के साथ अनुभवजन्य रूप से मापना अधिक कठिन होता है क्योंकि आर्मेचर के संपर्क करने के बाद होने वाले महत्वपूर्ण शासक दोलन होते हैं।
  15. मिनटों में दालों के बीच का समय दर्ज करें। बेसलाइन आदत प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाने वाला अंतराल 1 मिनट है।
  16. लाल रिकॉर्ड बटन दबाकर वेबकैम रिकॉर्डर ऐप का उपयोग करके एक वीडियो लेना शुरू करें। फिर, पहले स्वचालित यांत्रिक पल्स डिलीवरी के साथ प्रयोग शुरू करने के लिए आदत तंत्र पर स्विच को फ्लिप करें।

3. प्रयोग वीडियो का विश्लेषण

  1. वीडियो पर पहली यांत्रिक पल्स दिखाई देने से तुरंत पहले, स्टेंटर की संख्या को रोकें और गिनते हैं जो दोनों 35 मिमी प्लेट के निचले भाग में लंगर डाले हुए हैं और एक लम्बी, तुरही जैसे आकार में विस्तारित हैं (चित्रा 5 ए, वीडियो 1)।
  2. पहली पल्स के तुरंत बाद, स्टेंटर की संख्या की गणना करें जो दोनों प्लेट के निचले भाग में लंगर डाले हुए हैं और गेंद जैसे आकार में अनुबंधित हैं (चित्रा 5 बी, वीडियो 1)।
    नोट: अनुबंधित कोशिकाएं लम्बी कोशिकाओं से आसानी से समझ में आती हैं क्योंकि स्टेंटर संकुचन की घटना के दौरान 10 एमएस के भीतर अपने शरीर की लंबाई को 50% से अधिक कम करदेता है।
  3. यांत्रिक उत्तेजना के जवाब में अनुबंधित स्टेंटर के अंश को निर्धारित करने के लिए दूसरी गिनती को पहली गिनती से विभाजित करें।
  4. प्रयोग वीडियो में सभी यांत्रिक दालों के लिए चरण 3.1-3.3 दोहराएं।

Figure 5
चित्र 5: यांत्रिक उत्तेजना प्राप्त करने के बाद स्टेंटर सिकुड़ जाता है। (A) स्टेंटर अपनी लम्बी अवस्था में होते हैं और पेट्री प्लेट के तल पर लंगर डाले जाते हैं। (बी) स्टेंटर आदत उपकरण से स्तर 4 यांत्रिक उत्तेजना प्राप्त करने के बाद अनुबंधित हो गए हैं। छवियों को एक यूएसबी माइक्रोस्कोप के साथ लिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1: स्टेंटर अनुबंध का वीडियो। स्टेंटर को हर मिनट आदत डिवाइस से एक स्तर 4 यांत्रिक उत्तेजना प्राप्त होती है। इन कोशिकाओं को अभी तक आदत नहीं है, इसलिए वे नाड़ी प्राप्त करने के बाद अनुबंधित होते हैं। कोशिकाएं पेट्री प्लेट में होती हैं जिन्हें आदत डिवाइस के ऊपर रखा जाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

ऊपर वर्णित विधि, 1 टैप / मिनट की आवृत्ति पर स्तर 4 यांत्रिक पल्स का उपयोग करके, 1 घंटे के भीतर स्टेंटर की संकुचन संभावना में प्रगतिशील कमी होनी चाहिए। यह आदत का संकेत है ( चित्र 6, वीडियो 2 देखें)।

Figure 6
चित्र 6: आधारभूत आदत। स्टेंटर की संकुचन संभावना 1 टैप/मिनट (एन = 22-27) की आवृत्ति पर स्तर 4 यांत्रिक दालें प्राप्त करने के बाद 1 घंटे के दौरान उत्तरोत्तर कम हो जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 2. आदत वाले स्टेंटर का वीडियो। कोशिकाओं को 1 टैप/मिनट की आवृत्ति पर समान बल की यांत्रिक दालें प्राप्त करने के 1 घंटे के बाद स्तर 4 यांत्रिक उत्तेजना प्राप्त होती है। अधिकांश कोशिकाओं ने घंटे के दौरान उत्तेजनाओं की आदत डाल ली है और इस प्रकार, अनुबंध नहीं करते हैं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

यांत्रिक पल्स डिलीवरी के बल और / या आवृत्ति को बदलने से स्टेंटर आदत गतिशीलता बदल सकती है। उदाहरण के लिए, 1 टैप/मिनट की आवृत्ति पर स्तर 2 पल्स का उपयोग करना 1 घंटे के दौरान आदत को रोकता है ( चित्र 7 देखें)। एक स्तर 5 पल्स को कुछ से शून्य स्टेंटर में संकुचन प्राप्त करना चाहिए।

Figure 7
चित्र 7: मजबूत बलों के लिए 1 घंटे के भीतर आदत की कमी। स्टेंटर की संकुचन संभावना 1 टैप/मिनट (एन = 7-33) की आवृत्ति पर स्तर 2 यांत्रिक दालें प्राप्त करने के बाद 1 घंटे के दौरान काफी कम नहीं होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करने से संबंधित हैं कि स्टेंटर संकुचन होने के लिए इष्टतम परिस्थितियों में रहता है। आदत परख में संकुचन प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है कि स्टेंटर्स को उनके चिपचिपे होल्डफास्ट का उपयोग करके सतह पर लंगर डाला जाता है क्योंकि जब वे स्वतंत्र रूप से तैर रहे होते हैं तो वे शायद ही कभी अनुबंध करते हैं। हालांकि, आदत प्रयोगों के लिए उपयोग की जाने वाली 35 मिमी पेट्री प्लेट की निचली सतह आमतौर पर लंगर डालने के लिए अनुकूल नहीं होती है जब तक कि पॉली-ऑर्निथिन के साथ लेपित न हो। इसके अलावा, स्टेंटर को आदत प्रयोग की शुरुआत से पहले कम से कम 2 घंटे के लिए किसी भी यांत्रिक गड़बड़ी के संपर्क में नहीं लाया जा सकता है क्योंकि स्टेंटर भूलने का टाइमस्केल 2-6 घंटे3 है। यदि स्टेंटर को आदत प्रयोग शुरू होने के समय के 2 घंटे के भीतर यांत्रिक उत्तेजना प्राप्त होती है, तो संभावना है कि यह पूर्व उत्तेजना प्रयोग से पहले आदत के मामूली स्तर को प्रेरित करेगी, जिससे आदत उपकरण द्वारा पहली यांत्रिक पल्स देने के बाद संकुचन की संभावना कम हो जाएगी। अंत में, विश्लेषण चरण के दौरान, केवल पल्स डिलीवरी से पहले होने वाले किसी भी आकस्मिक सहज संकुचन के बजाय पल्स के बाद अनुबंधित स्टेंटर की संख्या की गणना करना महत्वपूर्ण है - यांत्रिक उत्तेजना के जवाब में अनुबंधित कोशिकाओं के अंश का सटीक रीडआउट प्राप्त करने के लिए।

प्रोटोकॉल को आदत उपकरण द्वारा वितरित यांत्रिक दालों के बल और आवृत्ति को बदलकर विभिन्न प्रकार की आदत गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है। यह अन्य प्रकार के सीखने का पता लगाने का अवसर भी प्रदान करता है, जैसे कि संवेदीकरण, जो स्टेंटर में हो सकता है। माइक्रोकंट्रोलर बोर्ड प्रोग्राम कोड को स्टेंटर को यांत्रिक नल के विभिन्न पैटर्न देने के लिए भी समायोजित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल के साथ समस्या निवारण करने के लिए एक संभावित मुद्दा स्टेंटर एंकरिंग की कम आवृत्ति है, जो स्टेंटर की संख्या को बाधित कर सकता है जिसे आदत प्रयोग में देखा जा सकता है। एंकरिंग आवृत्ति कभी-कभी स्टेंटर संस्कृतियों में कम हो जाती है जिन्हें हाल ही में खिलाया नहीं गया है या दूषित हैं। इस समस्या को हल करने के लिए, एक नई संस्कृति शुरू करने के लिए स्टेंटर के एक नए बैच को धोना चाहिए और लिन एट अल .10 में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार उन्हें नियमित रूप से खिलाना चाहिए।

यह प्रोटोकॉल सीमित है कि स्टेंटर की केवल एक प्लेट का एक समय में परीक्षण किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अपेक्षाकृत कम-थ्रूपुट माप होते हैं। इसके अलावा, वर्तमान सॉफ्टवेयर एकल-सेल छवि विश्लेषण के स्वचालन के लिए अनुमति नहीं देता है। इसलिए, प्राप्त किए गए अधिकांश डेटा जनसंख्या स्तर पर हैं। आदत डिवाइस और छवि विश्लेषण उपकरण के भविष्य के मॉडल उच्च-थ्रूपुट एकल-सेल प्रयोगों की सुविधा प्रदान कर सकते हैं।

स्टेंटर में आदत का अध्ययन पहले वुड3 द्वारा वर्णित तरीकों का उपयोग करके किया गया है, लेकिन यह नया प्रोटोकॉल प्रयोगों को स्वचालित होने की अनुमति देता है। स्वचालन न केवल शोधकर्ता को एक निर्दिष्ट बल और आवृत्ति की यांत्रिक दालों को पुन: वितरित करने की अनुमति देता है, बल्कि दीर्घकालिक आदत प्रयोगों की सुविधा भी देता है क्योंकि डिवाइस को दिनों तक पर्यवेक्षण के बिना चलाया जा सकता है। इसके अलावा, वुड केप्रयोगों 3 में नियोजित सोलनॉइड के बजाय स्टेपर मोटर का उपयोग करने से समय के साथ डिमैग्नेटाइजेशन का खतरा कम हो जाता है और एकल प्रयोग के दौरान उत्तेजना की ताकत को विविध होने की अनुमति मिलती है।

सेलुलर आदत का अध्ययन करने से ध्यान-घाटे / अति सक्रियता विकार (एडीएचडी) और टॉरेट सिंड्रोम जैसी स्थितियों के लिए नैदानिक अंतर्दृष्टि प्रकट हो सकती है जिसमेंआदत बिगड़ा हुआ है। स्टेंटर आदत तंत्र जटिल सेलुलर सर्किटरी से स्वतंत्र नए गैर-सिनैप्टिक सीखने के प्रतिमानों का भी अनावरण कर सकते हैं। अंत में, एकल-कोशिका सीखने के बारे में अंतर्दृष्टि बहुकोशिकीय ऊतकों के भीतर कोशिकाओं को पुन: प्रोग्राम करने के तरीकों को प्रेरित कर सकती है - बीमारी से लड़ने के लिए एक और संभावित एवेन्यू।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम स्टेंटर सीखने के बारे में असंख्य चर्चाओं के लिए तात्याना माकुशोक को धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनएसएफ अनुदान एमसीबी-2012647 और एनआईएच अनुदान आर 35 जीएम 130327 द्वारा वित्त पोषित किया गया था, साथ ही फाउंडेशन फोरमेंटिन-गिल्बर्ट से आई 2सेल पुरस्कार द्वारा भी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01% Poly-ornithine  Millipore Sigma P4957 Used to coat Petri plate
35-mm Petri plate Benz Microscope Optics Center Inc. L331 Contains Stentor during experiments
6-well plate StemCell Technologies 38016 Used to wash Stentor
Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1) Thorlabs MB424 Used to construct habituation device
Big easy driver stepper motor driver board (x1) Sparkfun ROB-12859 Used to construct habituation device
Construction rail, 1" x 5'' (x2) Newport Newport CR-1 Used to construct habituation device
Laptop Apple Store https://www.apple.com/macbook-air-m1/ Connect laptop to USB microscope to visualize experiments
Large right-angle bracket (x1) Thorlabs AP90RL Used to construct habituation device
Microcontroller board Arduino A000066 Used to control habituation device
Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead  Stepperonline.com 5-17HS19-2004S1 Used to construct habituation device
Pasteurized spring water Carolina 132458 Media for Stentor experiments
Right-angle bracket (x3) Thorlabs AP90 Used to construct habituation device
Stemi 2000 stereo microscope Zeiss Used to visualize Stentor during wash steps
Stentor coeruleus Carolina 131598 These are the cells used for habituation experiments
USB microscope Celestron 44308 Used to visualize and record experiments
Webcam recorder Apple Store https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12 Install this application to take videos of experiments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dussutour, A. Learning in single cell organisms. Biochemical and Biophysical Research Communications. 564, 92-102 (2021).
  2. Sternberg, R. J. Intelligence. Dialogues in Clinical Neuroscience. 14 (1), 19-27 (2012).
  3. Wood, D. C. Parametric studies of the response decrement produced by mechanical stimuli in the protozoan, Stentor coeruleus. Journal of Neurobiology. 1 (3), 345-360 (1969).
  4. Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Cell learning. Current Biology. 28 (20), 1180-1184 (2018).
  5. Wood, D. C. Stimulus specific habituation in a protozoan. Physiology and Behavior. 11 (3), 349-354 (1973).
  6. Thompson, R. F., Spencer, W. A. Habituation: A model phenomenon for the study of neuronal substrates of behavior. Psychological Review. 73 (1), 16-43 (1966).
  7. Slabodnick, M. M., Marshall, W. M. Stentor coeruleus. Current Biology. 24 (17), 783-784 (2014).
  8. Slabodnick, M. M., et al. The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell. Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).
  9. Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLoS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).
  10. Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments. (136), e57759 (2018).
  11. McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 80, 286-305 (2017).

Tags

जीव विज्ञान अंक 191
<em>स्टेंटर कोएरुलस</em> में आदत का अध्ययन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rajan, D., Chudinov, P., Marshall,… More

Rajan, D., Chudinov, P., Marshall, W. Studying Habituation in Stentor coeruleus. J. Vis. Exp. (191), e64692, doi:10.3791/64692 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter