Summary
特定の力と周波数で機械的パルスを送出できるマイクロコントローラ基板リンク装置を用いて 、ステントの 馴化を定量化する手法を紹介します。また、装置を組み立て、外部摂動を最小限に抑える方法で実験を設定する方法も含まれています。
Abstract
学習は通常、複雑な神経系に関連していますが、単一細胞に至るまで、あらゆるレベルの生命がインテリジェントな行動を示すことができるという証拠が増えています。自然システムと人工システムの両方で、学習は新しい情報に基づくシステムパラメータの適応更新であり、インテリジェンスは学習を容易にする計算プロセスの尺度です。 ステントル・コエルレウス は単細胞の池に生息する生物で、刺激を繰り返すと行動反応が低下する学習形態である慣れを示します。 ステントーター は機械的刺激に応答して収縮しますが、これは水生捕食者からの明らかな脱出反応です。しかし、繰り返される低力摂動は慣れを誘発し、収縮確率の漸進的な減少によって実証されます。ここでは、特定の力と周波数で機械的パルスを送出できるマイクロコントローラ基板連動装置を用いて、外部摂動を最小化するような装置の構築方法や実験設定方法など 、ステンター の馴化を定量化する手法を紹介します。 機械的にステンターを刺激するための前述のアプローチとは対照的に、この装置は、単一の実験の過程でコンピュータ制御下で刺激の力を変えることを可能にし、したがって適用することができる入力シーケンスの多様性を大幅に増加させる。単一セルのレベルで慣れを理解することは、複雑な回路に依存しない学習パラダイムを特徴付けるのに役立ちます。
Introduction
学習は通常、複雑な神経系に関連していますが、単一細胞に至るまで、あらゆるレベルの生命がインテリジェントな行動を示すことができるという証拠が増えています。自然系と人工系の両方で、学習は新しい情報1に基づくシステムパラメータの適応更新であり、知能は学習を容易にする計算プロセスの尺度です2。
ステントル・コエルレウス は単細胞の池に生息する生物で、刺激を繰り返すと行動反応が低下する学習形態である慣れを示します3。 ステントーは 機械的刺激に応答して収縮し3、これは水生捕食者からの明らかな脱出応答である。しかし、繰り返される低力摂動は慣れを誘発し、収縮確率の漸進的な減少によって実証される3。慣れた ステンター は、高強度の機械的刺激4 または光刺激5を受けた後も収縮します。これらの観察結果は、動物6の慣れに関するトンプソンとスペンサーの古典的な基準と一致しており、元の収縮反応の減少は、疲労やATPの枯渇ではなく学習によるものであることを強く示唆しています。自由生活細胞として、 ステントール は、多細胞組織の場合のように、周囲の細胞からの干渉をあまり受けずに研究することができます。 Stentor は、その大きなサイズ(1 mm)、定量化可能な慣れ反応3、注射とマイクロマニピュレーションの容易さ7、完全に配列決定されたゲノム8、RNA干渉(RNAi)ツール9の可用性など、いくつかの追加機能により、学習を研究するための扱いやすいシステムとなっています。このモデル生物を使用して、脳や神経系なしで細胞学習を探索するには、 ステント 細胞を刺激して応答を測定するための再現可能な手順が必要です。
ここでは、特定の力と周波数で機械的パルスを送出できるマイクロコントローラ基板連動装置を用いて、外部摂動を最小化するような装置の構築方法や実験設定方法など 、ステンター の馴化を定量化する手法を紹介します(図1)。単一セルのレベルで慣れを理解することは、複雑な回路に依存しない学習パラダイムを特徴付けるのに役立ちます。
図1:慣れ実験のセットアップ。ステントを含むペトリプレートは、馴化装置の柔軟な金属定規の上に置かれる。次に、馴化装置の電機子は、指定された力と周波数で金属定規に当たり、細胞のフィールド全体に刺激波を生成します。USB顕微鏡カメラは、刺激に対するステントーターの反応を記録します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:馴化実験ワークフローのまとめ。 図は、慣れ装置を使用して ステントール を研究することに関連する基本的なステップを示しています。図は BioRender.com で作成されました。BioRender.com(2022)による「プロセスフローチャート」から適応。https://app.biorender.com/biorender-templates から取得。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
注:馴化実験ワークフローの概要を 図2に示します。
1.馴化装置の組み立て
- モータードライバーをモーターに接続します ( 図3を参照)。
- ドライバーボードからのAというラベルの付いた2本のワイヤーをモーターの青と赤のワイヤーに接続します。ドライバーボードのBというラベルの付いた2本のワイヤーをモーターの緑と黒のワイヤーに接続します。
注意: モーターワイヤーを上にしてドライバーボードを上から見下ろすと、4本の入力線が青、赤、黒、緑の順にモーターリードに接続する必要があります。
- ドライバーボードからのAというラベルの付いた2本のワイヤーをモーターの青と赤のワイヤーに接続します。ドライバーボードのBというラベルの付いた2本のワイヤーをモーターの緑と黒のワイヤーに接続します。
- 図4に示すブレッドボード回路を構築し、LEDを正しい極性で接続するように特に注意します。
- ドライバボードからのVcc(+5 V)を白いブレッドボードの上部レールに接続し、ドライバボードからのGndをブレッドボードの下部レールに接続します。
- ブレッドボードのグランドをマイクロコントローラボードのグランドピンに接続します。緑色のLED、赤色のLED、スイッチ、ボタンの各ワイヤを、マイクロコントローラボードのデジタルピン8、9、10、および11に接続します。
- マイクロコントローラボードのデジタルピン2と3をドライバボードのステップとディレクトリの配線に接続します。
- マイクロコントローラボードのデジタルピン4、5、6、および7をドライバボードのワイヤに接続します。
- ピン4をMS1に接続し、ピン5をMS2に接続し、ピン6をMS3に接続し、ピン7をイネーブルに接続します。
- ドライバ・ボードに12V電源で電源を供給します。12V電源を、モータードライバーボードに2本の赤いワイヤーで接続されている黒/緑のアダプタープラグに差し込みます。
メモ: 12 V 電源をマイクロコントローラボードのプラグに差し込まないでください。 - 制御プログラム(https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino)をマイコンボードにダウンロードします。
- USBケーブルを使用して、マイクロコントローラボードをコンピュータに接続し、コンピュータはマイクロコントローラボードの電源としても機能します。
- ユーザー コントロールが機能していることを確認します。
- スライドスイッチが自動モードのオンとオフを切り替えることを確認します。自動モードでは、システムはユーザーが指定した一定の間隔でステップを実行します(以下を参照)。
- 自動モードがオンのときに緑色のLEDが点灯することを確認します。
- モーターがパルスを印加する1秒前に赤いLEDが点滅することを確認してください。赤色のLEDは、システムが機械的なパルスを送達しようとしていることを示す警告灯です。
- システムが自動モードであるかどうかに関係なく、ボタンを押すたびに1/16マイクロステップをトリガーする赤いボタンをテストします。
図3:馴化装置の構成要素。 機械を組み立てるには、ラベルの付いたすべての電子機器が必要です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:電子機器の回路図これはブレッドボード上の回路です。マイクロコントローラボードに接続するワイヤには、プロトコルに記載されているように番号が付けられています。D1とD2はそれぞれ赤と緑のLEDで、330個のΩ抵抗を介してグランドに接続されています。2つのスイッチは10KΩの抵抗でプルアップされます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2.慣れ実験のセットアップ
- ステンターを入手してください。
- 35 mmプレートを0.01%ポリオルニチン溶液でコーティングします。
- 3 mLの0.01%ポリオルニチン溶液をプレートに加え、一晩放置します。
- プレートを超純水で2回、低温殺菌湧水(PSW)で1回洗浄します(材料表)。
- 35 mmプレートに3.5 mLのPSWを追加します。
- ステントーを6ウェルプレートで洗浄します(材料表)。
- 最初のウェルに3 mLのPSWを追加し、2番目と3番目のウェルに5 mLのPSWを追加します。P1,000ピペットを使用して、培養皿から2 mLの ステントを 6ウェルプレートの最初のウェルに追加します。
- 実体顕微鏡(材料表)で個々のステントーを識別し、P20ピペットを使用して100個のステントーターを最初のウェルから2番目のウェルに移します。
- 実体顕微鏡で個々のス テント ーを識別し、P20ピペットを使用して100個の ステントー を2番目のウェルから3番目のウェルに移します。
- P200ピペットを使用して、35 mmプレートの最終容量が4 mLになるように、6ウェルプレートの3番目のウェルから35 mmプレートに合計500 μLの 100 Stentor を移します。
- 白い紙(7 cm x 7 cm)を慣れ装置の金属製定規にテープで留めます。用紙の左端がアーマチュアに最も近い定規の端から2 cm離れていることを確認します。
- 両面テープを使用して、35 mmプレートの下部を、慣れ装置の定規の上にある2インチx2インチの紙の中心に接着します。
- 蓋を閉めた状態で、35 mmプレートを馴化装置に少なくとも2時間(これは一晩延長できます)放置します。この順応期間を通して、プレートを実験的な光条件に一致する周囲光条件に保ちます(つまり、細胞を明暗変動にさらさないでください)。さらに、プレートに偶発的な衝撃による機械的摂動が発生していないことを確認してください。
- USB顕微鏡カメラ(材料表)を ステンターの35mmプレートの真上に中央に配置します。必要に応じて、ユニバーサルシリアルバス(USB)顕微鏡カメラの下にピペットチップボックスなどの支柱を置き、高さを調整します。あるいは、リングスタンドを使用して高さを調整することもできます。
- Webcamレコーダーアプリケーションをラップトップ(材料表)にインストールし、それを使用して顕微鏡入力 を介して 細胞を視覚化します。
- ウェブカメラレコーダーアプリを開き、ドロップダウンメニューからUSB顕微鏡を選択します。USB顕微鏡カメラのピントを調整して、細胞がはっきりと見えるようにします。
- USB顕微鏡カメラの位置を調整して、視野内のセル数を最大化します。
- マイクロコントローラボードのシリアルモニタを開きます :ライン終了なし を選択し、9,600ボーに設定します。
- マイクロコントローラボードプログラムで l コマンドを使用して、アーマチュアが定規にほとんど触れなくなるまで下げます。必要に応じて r コマンドを使用してアームを上げ、正確な位置を調整します。
注意: アーマチュアが定規からかなり離れている場合は、 d コマンドを入力してモーターコイル電流を無効にし、アームを手動で定規に向かって移動できるようにします。アームを手動で動かした後、 e コマンドを使用してモーターコイル電流を有効にし、アームを所定の位置にロックしたままにします。実験開始前に適切に下げると、アーマチュアの下端が定規の左端から1 cm離れている必要があります。アーマチュアは定規を叩くことによって機械的なパルスを届けます。 - i コマンドを使用して、慣れ装置の自動モードを初期化します。
- コマンド ラインにステップ サイズを入力します。レベル 5 は最小ステップで、レベル 1 は最大ステップです。レベル4は、ベースラインの馴化実験に使用されるステップサイズです。
注:レベル5の刺激により、定規が~0.5mm下向きに変位します。レベル4では、~1 mm下向きの変位が発生します。レベル3では、~2 mm下向きの変位が発生します。レベル2では、~3〜4 mm下向きの変位が発生します。レベル1では、~8 mm下向きの変位が発生します。レベル5の刺激は、~0.122 Nの定規に対する電機子の下向きのピーク力をもたらします。レベル4は~0.288 Nの下向きのピーク力をもたらします。レベル3では、~0.557 Nの下向きのピーク力が得られます。レベル1とレベル2によって生成される下向きの力は、アーマチュアが接触した後に発生する大きな定規振動のために、ダイナモメータで経験的に定量化することがより困難です。 - パルス間の時間を分単位で入力します。ベースライン慣れ実験に使用される間隔は1分です。
- 赤い録画ボタンを押して、Webカメラレコーダーアプリを使用してビデオの撮影を開始します。次に、馴化装置のスイッチを入れて、最初の自動機械的パルス配信で実験を開始します。
3. 実験映像の解析
- 最初の機械的パルスがビデオに表示される直前に、一時停止して、35 mmプレートの底に固定され、細長いトランペットのような形状に伸びている ステントーター の数を数えます(図5A、ビデオ1)。
- 最初のパルスの直後に、プレートの底に固定され、ボールのような形に収縮している ステントーター の数を数えます(図5B、ビデオ1)。
注:収縮した細胞は、 収縮 イベント中に50ミリ秒以内に体長を10%以上短縮するため、細長い細胞から簡単に識別できます3。 - 2番目のカウントを最初のカウントで割って、機械的刺激に応答して収縮した ステントー の割合を決定します。
- 実験ビデオのすべての機械的パルスに対して手順3.1〜3.3を繰り返します。
図5:機械的刺激を受けた後に収縮するステンター。 (A)ステントーターは細長い状態にあり、ペトリプレートの底に固定されています。(B)ステントは、慣れ装置からレベル4の機械的刺激を受けた後に収縮した。画像はUSB顕微鏡で撮影されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:ステントー契約のビデオ。ステントーターは、馴化装置からレベル4の機械的刺激を毎分受け取ります。これらの細胞はまだ慣れていないので、脈拍を受けた後に収縮します。細胞は、馴化装置の上に置かれたペトリプレートにあります。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Representative Results
1タップ/分の周波数でレベル4の機械的パルスを使用する上記の方法は、1時間以内に ステンター の収縮確率の漸進的な減少をもたらすはずである。これは慣れを示しています( 図6、ビデオ2を参照)。
図6:ベースラインの慣れ。ステントールの収縮確率は、レベル4の機械的パルスを1タップ/分の頻度で受信した後、1時間かけて徐々に低下します(n = 22-27)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ 2.慣れたステンターのビデオ。細胞は、1タップ/分の周波数で同じ力の機械的パルスを受信してから1時間後にレベル4の機械的刺激を受けます。ほとんどの細胞はその時間の間に刺激に慣れているので、収縮しません。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
機械的パルス送達の力および/または周波数を変更すると、 ステントー の慣れダイナミクスが変化する可能性があります。たとえば、レベル2パルスを1タップ/分の周波数で使用すると、1時間の馴化が妨げられます ( 図7を参照)。レベル5のパルスは、ス テンターを数個からゼロに収縮させるはずです。
図7:より強い力のための1時間以内の慣れの欠如。ステントーの収縮確率は、レベル2の機械的パルスを1タップ/分の頻度で受信した後、1時間かけてそれほど低下しません(n = 7-33)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
プロトコルの最も重要なステップは、ステントーが収縮が起こるのに最適な状態にあることを確認することに関連しています。慣れアッセイにおける収縮反応では、ステントールが自由に泳いでいるときに収縮することはめったにないため、粘着性のホールドファストを使用して表面に固定する必要があります。ただし、慣れ実験に使用される35 mmペトリプレートの底面は、ポリオルニチンでコーティングされていない限り、通常、固定に役立ちません。さらに、ステントー忘却のタイムスケールは2〜6時間3であるため、慣れ実験の開始前に最低2時間の間、ステントーターを機械的摂動にさらすことはできません。ステントが馴化実験開始時刻の2時間以内に機械的刺激を受ける場合、この事前刺激が実験の前にわずかなレベルの馴化を誘発し、それによって馴化装置が最初の機械的パルスを送達した後の収縮確率を低下させる可能性がある。最後に、分析段階では、機械的刺激に応答して収縮した細胞の割合を正確に読み取るには、パルス送達の前に発生する偶発的な自発的な収縮ではなく、パルス後に収縮するステントーの数のみをカウントすることが重要です。
プロトコルは、馴化装置によって送達される機械的パルスの力および周波数を変えることによって、異なるタイプの馴化ダイナミクスを研究するように容易に修正することができる。これはまた、 Stentorで発生する可能性のある感作などの他のタイプの学習を探求する機会を提供します。マイクロコントローラボードのプログラムコード自体を調整して、さまざまなパターンのメカニカルタップを Stentorに送ることもできます。
このプロトコルでトラブルシューティングする潜在的な問題の1つは、ステントーアンカーの頻度が低いことであり、慣れ実験で観察できるステントーターの数を制限する可能性があります。アンカー頻度は、最近給餌されていない、または汚染されているステントール培養物では減少することがあります。この問題に対処するには、Linら10に記載されているプロトコルに従って、新しい培養を開始するためにStentorの新しいバッチを洗浄し、定期的に給餌する必要があります。
このプロトコルは、一度に1枚の ステントール プレートしかテストできないという点で制限されており、比較的低いスループットの測定になります。さらに、現在のソフトウェアでは、単一細胞画像解析の自動化はできません。したがって、取得されるほとんどのデータは母集団レベルです。馴化装置と画像解析ツールの将来のモデルは、ハイスループットの単一細胞実験を容易にする可能性があります。
ステントールの慣れは、Wood3で説明されている方法を使用して以前に研究されてきましたが、この新しいプロトコルにより、実験を自動化できます。自動化により、研究者は特定の力と周波数の機械的パルスを再現可能に送達できるだけでなく、デバイスを監視なしで数日間稼働させたままにできるため、長期間の慣れ実験も容易になります。さらに、ウッドの実験3で採用されたソレノイドの代わりにステッピングモーターを使用すると、時間の経過とともに減磁のリスクが軽減され、1回の実験中に刺激の強さを変化させることができます。
細胞の馴化を研究することで、注意欠陥/多動性障害(ADHD)や慣れが損なわれているトゥレット症候群などの状態の臨床的洞察が明らかになる可能性があります11。 ステントの 慣れメカニズムはまた、複雑な細胞回路に依存しない新しい非シナプス学習パラダイムを明らかにする可能性があります。最後に、単一細胞学習に関する洞察は、多細胞組織内の細胞を再プログラミングする方法を刺激する可能性があり、病気と戦うための別の潜在的な手段です。
Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
ステントールの学習について数え切れないほどの議論をしてくれたタチアナ・マクショクに感謝します。この研究は、NSF助成金MCB-2012647、NIH助成金R35 GM130327、およびFourmentin-Guilbert財団からのI2CELL賞によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% Poly-ornithine | Millipore Sigma | P4957 | Used to coat Petri plate |
| 35-mm Petri plate | Benz Microscope Optics Center Inc. | L331 | Contains Stentor during experiments |
| 6-well plate | StemCell Technologies | 38016 | Used to wash Stentor |
| Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1) | Thorlabs | MB424 | Used to construct habituation device |
| Big easy driver stepper motor driver board (x1) | Sparkfun | ROB-12859 | Used to construct habituation device |
| Construction rail, 1" x 5'' (x2) | Newport | Newport CR-1 | Used to construct habituation device |
| Laptop | Apple Store | https://www.apple.com/macbook-air-m1/ | Connect laptop to USB microscope to visualize experiments |
| Large right-angle bracket (x1) | Thorlabs | AP90RL | Used to construct habituation device |
| Microcontroller board | Arduino | A000066 | Used to control habituation device |
| Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead | Stepperonline.com | 5-17HS19-2004S1 | Used to construct habituation device |
| Pasteurized spring water | Carolina | 132458 | Media for Stentor experiments |
| Right-angle bracket (x3) | Thorlabs | AP90 | Used to construct habituation device |
| Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | Used to visualize Stentor during wash steps | |
| Stentor coeruleus | Carolina | 131598 | These are the cells used for habituation experiments |
| USB microscope | Celestron | 44308 | Used to visualize and record experiments |
| Webcam recorder | Apple Store | https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12 | Install this application to take videos of experiments |
References
- Dussutour, A. Learning in single cell organisms. Biochemical and Biophysical Research Communications. 564, 92-102 (2021).
- Sternberg, R. J. Intelligence. Dialogues in Clinical Neuroscience. 14 (1), 19-27 (2012).
- Wood, D. C. Parametric studies of the response decrement produced by mechanical stimuli in the protozoan, Stentor coeruleus. Journal of Neurobiology. 1 (3), 345-360 (1969).
- Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Cell learning. Current Biology. 28 (20), 1180-1184 (2018).
- Wood, D. C. Stimulus specific habituation in a protozoan. Physiology and Behavior. 11 (3), 349-354 (1973).
- Thompson, R. F., Spencer, W. A. Habituation: A model phenomenon for the study of neuronal substrates of behavior. Psychological Review. 73 (1), 16-43 (1966).
- Slabodnick, M. M., Marshall, W. M. Stentor coeruleus. Current Biology. 24 (17), 783-784 (2014).
- Slabodnick, M. M., et al. The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell. Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLoS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).
- Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments. (136), e57759 (2018).
- McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 80, 286-305 (2017).
