Summary
Мы представляем метод количественной оценки привыкания стентора с использованием устройства, связанного с платой микроконтроллера, которое может подавать механические импульсы с заданной силой и частотой. Мы также включаем методы сборки аппарата и постановки эксперимента таким образом, чтобы свести к минимуму внешние возмущения.
Abstract
Обучение обычно связано со сложной нервной системой, но появляется все больше доказательств того, что жизнь на всех уровнях, вплоть до отдельных клеток, может демонстрировать разумное поведение. Как в естественных, так и в искусственных системах обучение — это адаптивное обновление параметров системы на основе новой информации, а интеллект — это мера вычислительного процесса, облегчающая обучение. Stentor coeruleus является одноклеточным прудовым организмом, который проявляет привыкание, форму обучения, при которой поведенческая реакция уменьшается после повторного стимула. Стентор сжимается в ответ на механическую стимуляцию, которая является очевидной реакцией побега от водных хищников. Однако повторяющиеся возмущения с низкой силой вызывают привыкание, о чем свидетельствует прогрессивное снижение вероятности сокращения. Здесь мы представляем метод количественной оценки привыкания Стентора с использованием устройства, связанного с платой микроконтроллера, которое может доставлять механические импульсы с заданной силой и частотой, включая методы построения аппарата и настройки эксперимента таким образом, чтобы минимизировать внешние возмущения. В отличие от ранее описанных подходов к механической стимуляции Стентора, это устройство позволяет изменять силу стимуляции под компьютерным управлением в ходе одного эксперимента, тем самым значительно увеличивая разнообразие входных последовательностей, которые могут быть применены. Понимание привыкания на уровне одной клетки поможет охарактеризовать парадигмы обучения, которые не зависят от сложной схемы.
Introduction
Обучение обычно связано со сложной нервной системой, но появляется все больше доказательств того, что жизнь на всех уровнях, вплоть до отдельных клеток, может демонстрировать разумное поведение. Как в естественных, так и в искусственных системах обучение — это адаптивное обновление параметров системы на основе новой информации1, а интеллект — это мера вычислительного процесса, облегчающая обучение2.
Stentor coeruleus является одноклеточным прудовым организмом, который проявляет привыкание, форму обучения, при которой поведенческая реакция уменьшается после повторного стимула3. Стентор сжимается в ответ на механическую стимуляцию3, которая является очевидной реакцией побега от водных хищников. Однако повторяющиеся возмущения с низкой силой вызывают привыкание, о чем свидетельствует прогрессирующее снижение вероятности сокращения3. Привычный стентор все еще сокращается после получения высокосиловой механической стимуляции4 или фотической стимуляции5. Эти наблюдения, которые согласуются с классическими критериями Томпсона и Спенсера для привыкания у животных6, убедительно свидетельствуют о том, что первоначальное снижение сократительной реакции связано с обучением, а не с усталостью или истощением АТФ. Как свободноживая клетка, Стентор может быть изучен без особого вмешательства со стороны окружающих клеток, как это было бы в случае с многоклеточной тканью. Несколько дополнительных особенностей делают Stentor пригодной для изучения обучения: его большой размер (1 мм), его количественный ответ привыкания3, простота инъекции и микроманипуляции7, полностью секвенированный геном8 и доступность инструментов РНК-интерференции (РНКи)9. Использование этого модельного организма для изучения клеточного обучения без мозга или нервной системы требует воспроизводимой процедуры стимуляции клеток Стентора и измерения ответа.
Здесь мы представляем метод количественной оценки привыкания Стентора с использованием микроконтроллерного устройства, связанного с платой, которое может доставлять механические импульсы с заданной силой и частотой, включая методы построения устройства и настройки эксперимента таким образом, чтобы минимизировать внешние возмущения (рисунок 1). Понимание привыкания на уровне одной клетки поможет охарактеризовать парадигмы обучения, которые не зависят от сложной схемы.
Рисунок 1: Настройка эксперимента по привыканию. Пластина Петри, содержащая Стентор , помещена поверх гибкой металлической линейки габуляционного устройства. Затем якорь устройства привыкания ударяется о металлическую линейку с заданной силой и частотой, производя стимулирующую волну через поле клеток. Камера USB-микроскопа записывает реакцию стентора на стимуляцию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сводка рабочего процесса эксперимента по привыканию. На рисунке показаны основные этапы, связанные с изучением Стентора с помощью устройства привыкания. Рисунок был создан с BioRender.com. Адаптировано из «Технологической блок-схемы» BioRender.com (2022). Извлечено из https://app.biorender.com/biorender-templates. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Краткое описание рабочего процесса эксперимента по привыканию показано на рисунке 2.
1. Сборка устройства привыкания
- Прицепите водителя двигателя к двигателю (см. рисунок 3).
- Подключите два провода с маркировкой A от платы драйвера к синим и красным проводам на двигателе. Подключите два провода с маркировкой B от платы драйвера к зеленым и черным проводам на двигателе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Глядя сверху вниз на плату драйвера с проводами двигателя вверху, четыре входных провода должны подключаться к проводам двигателя в следующем порядке: синий, красный, черный и зеленый.
- Подключите два провода с маркировкой A от платы драйвера к синим и красным проводам на двигателе. Подключите два провода с маркировкой B от платы драйвера к зеленым и черным проводам на двигателе.
- Постройте схему макетной платы, показанную на рисунке 4, с особой осторожностью, чтобы соединить светодиоды в правильной полярности.
- Подключите Vcc (+5 В) от платы драйвера к верхней рейке белой макетной доски и Gnd от платы водителя к нижней рейке макетной доски.
- Подключите заземление макетной платы к контакту заземления платы микроконтроллера. Подключите зеленый светодиод, красный светодиод, переключатель и кнопочные провода соответственно к цифровым контактам 8, 9, 10 и 11 платы микроконтроллера.
- Подключите цифровые контакты 2 и 3 платы микроконтроллера к проводам платы драйвера Step и Dir.
- Подключите цифровые контакты 4, 5, 6 и 7 платы микроконтроллера к проводам платы драйвера.
- Подключите контакт 4 к MS1, подключите контакт 5 к MS2, подключите контакт 6 к MS3 и подключите контакт 7 для включения.
- Питание платы драйвера от блока питания 12 В. Подключите питание 12 В к черно-зеленому разъему адаптера, прикрепленному двумя красными проводами к плате драйвера двигателя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не подключайте питание 12 В к разъему платы микроконтроллера. - Загрузите управляющую программу (https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino) на плату микроконтроллера.
- Используйте USB-кабель для подключения платы микроконтроллера к компьютеру, который также будет служить источником питания для платы микроконтроллера.
- Убедитесь, что пользовательские элементы управления работают.
- Убедитесь, что переключатель слайдов включает и выключает автоматический режим. В автоматическом режиме система будет делать шаг через равные промежутки времени, указанные пользователем (см. ниже).
- Убедитесь, что зеленый индикатор включается при включенном автоматическом режиме.
- Убедитесь, что красный светодиод мигает 1 с, прежде чем двигатель подаст импульс. Красный светодиод - это сигнальная лампа, которая указывает, когда система собирается подать механический импульс.
- Протестируйте красную кнопку, которая запускает 1/16 микрошага каждый раз при нажатии кнопки, независимо от того, находится ли система в автоматическом режиме.
Рисунок 3: Компоненты устройства привыкания. Вся маркированная электроника необходима для сборки машины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Схема электроники. Это схема на макетной плате. Провода, соединяющиеся с платой микроконтроллера, пронумерованы так, как описано в протоколе. D1 и D2 являются красным и зеленым светодиодами соответственно и подключаются к земле через резисторы 330 Ω. Два переключателя подтягиваются резисторами 10 кОм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
2. Настройка эксперимента привыкания
- Получить Стентор.
- Покрыть пластину толщиной 35 мм 0,01% раствором полиорнитина.
- Добавить в пластину 3 мл 0,01% раствора полиорнитина и оставить на ночь.
- Дважды вымойте пластину сверхчистой водой и один раз пастеризованной родниковой водой (PSW) (Таблица материалов).
- Добавьте 3,5 мл PSW на пластину диаметром 35 мм.
- Мойте стентор в 6-луночной пластине (Таблица материалов).
- Добавьте 3 мл PSW к первой скважине и 5 мл PSW ко второй и третьей скважинам. Используйте пипетку P1,000, чтобы добавить 2 мл Stentor из чашки для культивирования в первый колодец 6-луночной тарелки.
- Определите отдельный стентор с помощью стереомикроскопа (Таблица материалов), а затем используйте пипетку P20 для переноса 100 стентора из первой скважины во вторую скважину.
- Определите отдельный стентор с помощью стереомикроскопа, а затем используйте пипетку P20 для переноса 100 стентора из второй скважины в третью скважину.
- Используйте пипетку P200 для переноса 100 стенторов в общем объеме 500 мкл из третьей скважины 6-луночной пластины в пластину диаметром 35 мм таким образом, чтобы конечный объем пластины 35 мм составлял 4 мл.
- Приклейте кусок (7 см х 7 см) белой бумаги к металлической линейке на устройстве привыкания. Убедитесь, что левый край бумаги находится на расстоянии 2 см от ближайшего к якорю конца линейки.
- Используйте двустороннюю ленту, чтобы приклеить нижнюю часть пластины 35 мм к центру 2 в х 2 в бумаге поверх линейки на устройстве привыкания.
- Оставьте пластину диаметром 35 мм на устройстве привыкания не менее чем на 2 ч (это можно продлить до ночи) с закрытой крышкой. В течение этого периода акклиматизации держите пластину в условиях окружающего освещения, которые соответствуют условиям экспериментального освещения (т. Е. Не подвергайте клетки световым / темным колебаниям). Кроме того, убедитесь, что пластина не испытывает никаких механических возмущений от случайного толчка.
- Центрируйте КАМЕРУ USB-микроскопа (Таблицу материалов) непосредственно над 35-мм пластиной Stentor. При необходимости поместите опору, такую как наконечник пипетки, под камеру микроскопа универсальной последовательной шины (USB), чтобы отрегулировать высоту. Кроме того, для регулировки высоты можно использовать кольцевую подставку.
- Установите приложение Webcam Recorder на ноутбук (Таблица материалов) и используйте его для визуализации клеток через вход микроскопа.
- Откройте приложение «Рекордер веб-камеры» и выберите USB-микроскоп в раскрывающемся меню. Отрегулируйте фокусировку на камере USB-микроскопа так, чтобы ячейки были четко видны.
- Отрегулируйте положение камеры USB-микроскопа, чтобы максимально увеличить количество ячеек в поле зрения.
- Откройте последовательный монитор платы микроконтроллера: выберите No Line Ending и установите для него значение 9 600 бод.
- Используйте команду l на плате микроконтроллера, чтобы опустить якорь до тех пор, пока он едва не коснется линейки. Используйте команду r , чтобы поднять руку, если это необходимо, чтобы отрегулировать точное положение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если якорь находится на значительном расстоянии от линейки, введите команду d , чтобы отключить ток катушки двигателя, чтобы рычаг можно было перемещать вручную к линейке. После перемещения кронштейна вручную используйте команду e , чтобы включить ток катушки двигателя и держать руку заблокированной в положении. При правильном опускании перед началом эксперимента нижний кончик якоря должен находиться на расстоянии 1 см от левого края линейки. Якорь будет доставлять механический импульс, ударяя по линейке. - Используйте команду i для инициализации автоматического режима на устройстве привыкания.
- Введите размер шага в командной строке. Уровень 5 — это самый маленький шаг, а уровень 1 — самый большой шаг. Уровень 4 — это размер шага, используемый для базовых экспериментов по привыканию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стимул уровня 5 приводит к смещению линейки вниз на ~0,5 мм; Уровень 4 приводит к смещению вниз на ~1 мм; Уровень 3 приводит к смещению вниз на ~2 мм; Уровень 2 приводит к смещению вниз на ~3-4 мм; и уровень 1 приводит к смещению вниз на ~8 мм. Стимул 5-го уровня приводит к нисходящей пиковой силе якоря против линейки ~0,122 Н; Уровень 4 приводит к нисходящей пиковой силе ~0,288 Н; и уровень 3 приводит к нисходящей пиковой силе ~0,557 Н. Нисходящие силы, генерируемые уровнем 1 и уровнем 2, труднее эмпирически количественно оценить с помощью динамометра из-за значительных колебаний линейки, которые происходят после контакта якоря. - Введите время между импульсами в минутах. Интервал, используемый для базовых экспериментов по привыканию, составляет 1 мин.
- Начните снимать видео с помощью приложения Webcam Recorder, нажав красную кнопку записи. Затем переверните переключатель на привыкающем аппарате, чтобы начать эксперимент с первой автоматизированной механической доставкой импульса.
3. Анализ видео эксперимента
- Непосредственно перед тем, как на видео появится первый механический импульс, сделайте паузу и подсчитайте количество стенторов , которые закреплены на нижней части пластины 35 мм и вытянуты в вытянутой, трубообразной форме (рисунок 5A, видео 1).
- Сразу после первого импульса подсчитайте количество стенторов , которые закреплены на дне пластины и сжаты в шарообразную форму (рисунок 5B, видео 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сжатые клетки легко отличить от удлиненных клеток, потому что стентор сокращает длину их тела более чем на 50% в течение 10 мс во время события сокращения3. - Разделите второй счет на первый счет, чтобы определить долю Стентора , которая сократилась в ответ на механический стимул.
- Повторите шаги 3.1-3.3 для всех механических импульсов в видео эксперимента.
Рисунок 5: Стентор сжимается после получения механического стимула. (А) Стенторы находятся в удлиненном состоянии и закреплены на дне пластины Петри. (B) Стентор заразился после получения механической стимуляции уровня 4 от устройства привыкания. Снимки были сделаны с помощью USB-микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: Видео заключения контракта с Stentor. Стентор получает механический стимул 4-го уровня от устройства привыкания каждую минуту. Эти клетки еще не привыкли, поэтому сокращаются после получения пульса. Клетки находятся в пластине Петри, помещенной поверх устройства привыкания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Representative Results
Описанный выше способ с использованием механического импульса уровня 4 с частотой 1 касание/мин должен приводить к прогрессивному снижению вероятности сжатия стентора в течение 1 ч. Это свидетельствует об привыкании (см. рисунок 6, видео 2).
Рисунок 6: Базовое привыкание. Вероятность сжатия Стентора прогрессивно снижается в течение 1 ч после получения механических импульсов 4 уровня с частотой 1 тап/мин (n = 22-27). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 2. Видео привычного Стентора. Клетки получают механический стимул уровня 4 после 1 ч приема механических импульсов той же силы с частотой 1 касание/мин. Большинство клеток привыкли к раздражителям в течение часа и, таким образом, не сокращаются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Изменение силы и/или частоты подачи механического импульса может изменить динамику привыкания Стентора . Например, использование импульса уровня 2 с частотой 1 касание/мин исключает привыкание в течение 1 ч (см. Рисунок 7). Импульс 5-го уровня должен вызывать сокращения от нескольких до нуля стенторов.
Рисунок 7: Отсутствие привыкания в течение 1 ч для более сильных сил. Вероятность сокращения Стентора заметно не снижается в течение 1 ч после приема механических импульсов уровня 2 с частотой 1 нажатие/мин (n = 7-33). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Наиболее важные шаги в протоколе касаются обеспечения того, чтобы стентор оставался в оптимальных условиях для возникновения схваток. Реакция на сокращение в анализе привыкания требует, чтобы стенторы были закреплены на поверхности с помощью их липкого удержания, поскольку они редко сжимаются, когда они свободно плавают. Однако нижняя поверхность 35-миллиметровой пластины Петри, используемой для экспериментов по привыканию, обычно не способствует анкеровке, если она не покрыта полиорнитином. Кроме того, стентор не может подвергаться какому-либо механическому возмущению в течение как минимум 2 ч до начала эксперимента по привыканию, потому что временная шкала забывания стентора составляет 2-6 ч3. Если Стентор получает механическую стимуляцию в течение 2 ч после начала эксперимента по привыканию, существует вероятность того, что эта предварительная стимуляция вызовет небольшой уровень привыкания до начала эксперимента, тем самым уменьшая вероятность сокращения после того, как устройство привыкания выдаст первый механический импульс. Наконец, на этапе анализа важно подсчитывать только количество стенторов , которые сокращаются после импульса, а не любые случайные спонтанные сокращения, которые происходят до доставки импульса, чтобы получить точное считывание доли клеток, которые сократились в ответ на механическую стимуляцию.
Протокол может быть легко модифицирован для изучения различных типов динамики привыкания путем изменения силы и частоты механических импульсов, подаваемых устройством привыкания. Это также дает возможность исследовать другие типы обучения, такие как сенсибилизация, которые могут происходить в Стенторе. Сам программный код платы микроконтроллера также может быть отрегулирован для подачи различных шаблонов механических нажатий на Stentor.
Одной из потенциальных проблем для устранения неполадок с помощью этого протокола является низкая частота закрепления стентора , которая может ограничить количество стенторов , которые можно наблюдать в эксперименте по привыканию. Частота анкеровки иногда снижается в культурах Стентора , которые недавно не были скормлены или загрязнены. Чтобы решить эту проблему, следует промыть свежую партию стентора , чтобы начать новую культуру и регулярно кормить их в соответствии с протоколом, описанным в Lin et al.10.
Этот протокол ограничен тем, что только одна пластина Stentor может быть проверена за один раз, что приводит к относительно низкой пропускной способности измерений. Кроме того, существующее программное обеспечение не позволяет автоматизировать анализ одноклеточных изображений. Таким образом, большинство полученных данных относятся к численности населения. Будущие модели устройства привыкания и инструментов анализа изображений могут способствовать высокопроизводительным экспериментам с одной ячейкой.
Привыкание в Стенторе было ранее изучено с использованием методов, описанных в Wood3, но этот новый протокол позволяет автоматизировать эксперименты. Автоматизация не только позволяет исследователю воспроизводимо доставлять механические импульсы заданной силы и частоты, но и облегчает долгосрочные эксперименты по привыканию, поскольку устройство можно оставить без присмотра в течение нескольких дней. Кроме того, использование шагового двигателя, а не соленоида, используемого в экспериментахВуда 3 , снижает риск размагничивания с течением времени, а также позволяет изменять силу стимула в течение одного эксперимента.
Изучение клеточной привыкания может выявить клинические идеи для таких состояний, как синдром дефицита внимания / гиперактивности (СДВГ) и синдром Туретта, при котором привыкание нарушено11. Механизмы привыкания стентора могут также открыть новые несинаптические парадигмы обучения, независимые от сложных клеточных схем. Наконец, понимание одноклеточного обучения может вдохновить методы перепрограммирования клеток в многоклеточных тканях - еще один потенциальный способ борьбы с болезнями.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Благодарим Татьяну Макушок за бесчисленные дискуссии об обучении Стентору . Эта работа финансировалась грантом NSF MCB-2012647 и грантом NIH R35 GM130327, а также премией I2CELL от Фонда Фурментен-Гильберта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% Poly-ornithine | Millipore Sigma | P4957 | Used to coat Petri plate |
| 35-mm Petri plate | Benz Microscope Optics Center Inc. | L331 | Contains Stentor during experiments |
| 6-well plate | StemCell Technologies | 38016 | Used to wash Stentor |
| Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1) | Thorlabs | MB424 | Used to construct habituation device |
| Big easy driver stepper motor driver board (x1) | Sparkfun | ROB-12859 | Used to construct habituation device |
| Construction rail, 1" x 5'' (x2) | Newport | Newport CR-1 | Used to construct habituation device |
| Laptop | Apple Store | https://www.apple.com/macbook-air-m1/ | Connect laptop to USB microscope to visualize experiments |
| Large right-angle bracket (x1) | Thorlabs | AP90RL | Used to construct habituation device |
| Microcontroller board | Arduino | A000066 | Used to control habituation device |
| Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead | Stepperonline.com | 5-17HS19-2004S1 | Used to construct habituation device |
| Pasteurized spring water | Carolina | 132458 | Media for Stentor experiments |
| Right-angle bracket (x3) | Thorlabs | AP90 | Used to construct habituation device |
| Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | Used to visualize Stentor during wash steps | |
| Stentor coeruleus | Carolina | 131598 | These are the cells used for habituation experiments |
| USB microscope | Celestron | 44308 | Used to visualize and record experiments |
| Webcam recorder | Apple Store | https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12 | Install this application to take videos of experiments |
References
- Dussutour, A. Learning in single cell organisms. Biochemical and Biophysical Research Communications. 564, 92-102 (2021).
- Sternberg, R. J. Intelligence. Dialogues in Clinical Neuroscience. 14 (1), 19-27 (2012).
- Wood, D. C. Parametric studies of the response decrement produced by mechanical stimuli in the protozoan, Stentor coeruleus. Journal of Neurobiology. 1 (3), 345-360 (1969).
- Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Cell learning. Current Biology. 28 (20), 1180-1184 (2018).
- Wood, D. C. Stimulus specific habituation in a protozoan. Physiology and Behavior. 11 (3), 349-354 (1973).
- Thompson, R. F., Spencer, W. A. Habituation: A model phenomenon for the study of neuronal substrates of behavior. Psychological Review. 73 (1), 16-43 (1966).
- Slabodnick, M. M., Marshall, W. M. Stentor coeruleus. Current Biology. 24 (17), 783-784 (2014).
- Slabodnick, M. M., et al. The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell. Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLoS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).
- Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments. (136), e57759 (2018).
- McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 80, 286-305 (2017).
