Summary
Introducimos un método para cuantificar la habituación de Stentor utilizando un aparato microcontrolador conectado a una placa que puede entregar pulsos mecánicos a una fuerza y frecuencia específicas. También incluimos métodos para ensamblar el aparato y configurar el experimento de una manera que minimice las perturbaciones externas.
Abstract
El aprendizaje generalmente se asocia con un sistema nervioso complejo, pero cada vez hay más evidencia de que la vida en todos los niveles, hasta las células individuales, puede mostrar comportamientos inteligentes. Tanto en sistemas naturales como artificiales, el aprendizaje es la actualización adaptativa de los parámetros del sistema basados en nueva información, y la inteligencia es una medida del proceso computacional que facilita el aprendizaje. Stentor coeruleus es un organismo unicelular que habita en estanques que exhibe habituación, una forma de aprendizaje en la que una respuesta conductual disminuye después de un estímulo repetido. El stentor se contrae en respuesta a la estimulación mecánica, que es una aparente respuesta de escape de los depredadores acuáticos. Sin embargo, las perturbaciones repetidas de baja fuerza inducen la habituación, demostrada por una reducción progresiva en la probabilidad de contracción. Aquí, presentamos un método para cuantificar la habituación de Stentor utilizando un aparato vinculado a una placa de microcontrolador que puede entregar pulsos mecánicos a una fuerza y frecuencia específicas, incluidos los métodos para construir el aparato y configurar el experimento de una manera que minimice las perturbaciones externas. En contraste con los enfoques descritos anteriormente para estimular mecánicamente Stentor, este dispositivo permite variar la fuerza de estimulación bajo control de computadora durante el curso de un solo experimento, lo que aumenta en gran medida la variedad de secuencias de entrada que se pueden aplicar. Comprender la habituación a nivel de una sola célula ayudará a caracterizar los paradigmas de aprendizaje que son independientes de los circuitos complejos.
Introduction
El aprendizaje generalmente se asocia con un sistema nervioso complejo, pero cada vez hay más evidencia de que la vida en todos los niveles, hasta las células individuales, puede mostrar comportamientos inteligentes. Tanto en sistemas naturales como artificiales, el aprendizaje es la actualización adaptativa de los parámetros del sistema basados en nueva información1, y la inteligencia es una medida del proceso computacional que facilita el aprendizaje2.
Stentor coeruleus es un organismo unicelular que habita en estanques que exhibe habituación, una forma de aprendizaje en la que una respuesta conductual disminuye después de un estímulo repetido3. Stentor se contrae en respuesta a la estimulación mecánica3, que es una aparente respuesta de escape de los depredadores acuáticos. Sin embargo, las perturbaciones repetidas de baja fuerza inducen habituación, demostrada por una reducción progresiva en la probabilidad de contracción3. El Stentor habituado todavía se contrae después de recibir estimulación mecánica de alta fuerza4 o estimulación fótica5. Estas observaciones, que se alinean con los criterios clásicos de Thompson y Spencer para la habituación en animales6, sugieren fuertemente que la disminución original de la respuesta contráctil se debe al aprendizaje en lugar de a la fatiga o al agotamiento de ATP. Como célula de vida libre, Stentor se puede estudiar sin mucha interferencia de las células circundantes, como sería el caso en un tejido multicelular. Varias características adicionales hacen de Stentor un sistema manejable para estudiar el aprendizaje: su gran tamaño (1 mm), su respuesta de habituación cuantificable3, la facilidad de inyección y micromanipulación7, el genoma completamente secuenciado8 y la disponibilidad de herramientas de interferencia de ARN (ARNi)9. El uso de este organismo modelo para explorar el aprendizaje celular sin un cerebro o sistema nervioso requiere un procedimiento reproducible para estimular las células Stentor y medir la respuesta.
Aquí, presentamos un método para cuantificar la habituación de Stentor utilizando un aparato vinculado a una placa de microcontrolador que puede entregar pulsos mecánicos a una fuerza y frecuencia específicas, incluidos los métodos para construir el aparato y configurar el experimento de una manera que minimice las perturbaciones externas (Figura 1). Comprender la habituación a nivel de una sola célula ayudará a caracterizar los paradigmas de aprendizaje que son independientes de los circuitos complejos.
Figura 1: Configuración del experimento de habituación. La placa de Petri que contiene Stentor se coloca encima de la regla metálica flexible del dispositivo de habituación. La armadura del dispositivo de habituación golpea la regla de metal a una fuerza y frecuencia especificadas, produciendo una onda de estímulo a través del campo de las células. La cámara de microscopio USB registra las respuestas del Stentor a la estimulación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resumen del flujo de trabajo del experimento de habituación. La figura muestra los pasos básicos involucrados en el estudio de Stentor utilizando el dispositivo de habituación. La figura fue creada con BioRender.com. Adaptado de "Process Flowchart", de BioRender.com (2022). Extraído de https://app.biorender.com/biorender-templates. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
NOTA: En la figura 2 se muestra un resumen del flujo de trabajo del experimento de habituación.
1. Montaje del dispositivo de habituación
- Enganche el controlador del motor al motor (consulte la figura 3).
- Conecte los dos cables etiquetados como A de la placa del conductor a los cables azul y rojo del motor. Conecte los dos cables etiquetados B de la placa del conductor a los cables verde y negro del motor.
NOTA: Mirando hacia abajo en la placa del conductor desde arriba con los cables del motor en la parte superior, los cuatro cables de entrada deben conectarse a los cables del motor en este orden: azul, rojo, negro y verde.
- Conecte los dos cables etiquetados como A de la placa del conductor a los cables azul y rojo del motor. Conecte los dos cables etiquetados B de la placa del conductor a los cables verde y negro del motor.
- Construya el circuito de placa de pruebas que se muestra en la Figura 4, con especial cuidado para conectar los LED en la polaridad correcta.
- Conecte el Vcc (+5 V) de la placa del conductor al riel superior de la placa de pruebas blanca y el Gnd de la placa del controlador al riel inferior de la placa de pruebas.
- Conecte la tierra de la placa de pruebas al pin de tierra de la placa del microcontrolador. Conecte los cables LED verde, LED rojo, interruptor y botón, respectivamente, a los pines digitales 8, 9, 10 y 11 de la placa del microcontrolador.
- Conecte los pines digitales 2 y 3 de la placa del microcontrolador a los cables de la placa del controlador Step y Dir.
- Conecte los pines digitales 4, 5, 6 y 7 de la placa del microcontrolador a los cables de la placa del controlador.
- Conecte el Pin 4 a MS1, conecte el Pin 5 a MS2, conecte el Pin 6 a MS3 y conecte el Pin 7 a Enable.
- Alimente la placa del conductor con una fuente de alimentación de 12 V. Enchufe la fuente de alimentación de 12 V en el enchufe del adaptador negro/verde conectado por dos cables rojos a la placa del controlador del motor.
NOTA: No enchufe la fuente de alimentación de 12 V en el enchufe de la placa del microcontrolador. - Descargue el programa de control (https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino) en la placa del microcontrolador.
- Utilice un cable USB para conectar la placa del microcontrolador a una computadora, que también servirá como fuente de alimentación para la placa del microcontrolador.
- Compruebe que los controles de usuario funcionan.
- Confirme que el interruptor deslizante activa y desactiva el modo automático. En el modo automático, el sistema dará un paso a intervalos regulares especificados por el usuario (ver más abajo).
- Compruebe que el LED verde se enciende cuando el modo automático está activado.
- Compruebe que el LED rojo parpadee 1 s antes de que el motor aplique un pulso. El LED rojo es una luz de advertencia que indica cuando el sistema está a punto de emitir un pulso mecánico.
- Pruebe el botón rojo, que activa un micro paso de 1/16 cada vez que se presiona el botón, independientemente de si el sistema está en modo automático.
Figura 3: Componentes del dispositivo de habituación. Todos los componentes electrónicos etiquetados son necesarios para ensamblar la máquina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Esquema electrónico. Este es el circuito en el tablero de pruebas. Los cables que se conectan a la placa del microcontrolador están numerados como se describe en el protocolo. D1 y D2 son los LED rojos y verdes, respectivamente, y están conectados a tierra a través de 330 resistencias Ω. Los dos interruptores se levantan con resistencias de 10 KΩ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Configuración del experimento de habituación
- Obtenga Stentor.
- Cubra una placa de 35 mm con una solución de poliornitina al 0,01%.
- Agregue 3 ml de la solución de poliornitina al 0,01% a la placa y déjela toda la noche.
- Lave el plato dos veces con agua ultrapura y una vez con agua de manantial pasteurizada (PSW) (Tabla de materiales).
- Agregue 3.5 ml de PSW a la placa de 35 mm.
- Lave el Stentor en una placa de 6 pocillos (Tabla de materiales).
- Agregue 3 ml de PSW al primer pozo y 5 ml de PSW al segundo y tercer pozo. Use una pipeta P1,000 para agregar 2 ml de Stentor de un plato de cultivo al primer pocillo de la placa de 6 pocillos.
- Identifique Stentor individual con un microscopio estereoscópico (Tabla de materiales) y luego use una pipeta P20 para transferir 100 Stentor del primer pozo al segundo pozo.
- Identifique Stentor individual con un microscopio estereoscópico y luego use una pipeta P20 para transferir 100 Stentor del segundo pocillo al tercer pozo.
- Utilice una pipeta P200 para transferir 100 Stentor en un volumen total de 500 μL desde el tercer pocillo de la placa de 6 pocillos a la placa de 35 mm, de modo que el volumen final en la placa de 35 mm sea de 4 ml.
- Pegue una pieza (7 cm x 7 cm) de papel blanco a la regla de metal en el dispositivo de habituación. Asegúrese de que el borde izquierdo del papel esté a 2 cm del extremo de la regla más cercano a la armadura.
- Use cinta adhesiva de doble cara para adherir la parte inferior de la placa de 35 mm al centro del papel de 2 pulgadas x 2 encima de la regla en el dispositivo de habituación.
- Deje la placa de 35 mm en el dispositivo de habituación durante al menos 2 h (esto se puede extender durante la noche) con la tapa cerrada. A lo largo de este período de aclimatación, mantenga la placa en condiciones de luz ambiental que coincidan con las condiciones de luz experimentales (es decir, no someta las celdas a fluctuaciones de luz / oscuridad). Además, asegúrese de que la placa no experimente perturbaciones mecánicas por empujones accidentales.
- Centra la cámara del microscopio USB (Tabla de materiales) directamente encima de la placa de 35 mm de Stentor. Si es necesario, coloque un accesorio, como una caja de punta de pipeta, debajo de la cámara de microscopio de bus serie universal (USB) para ajustar la altura. Alternativamente, se puede usar un soporte de anillo para ajustar la altura.
- Instale la aplicación de grabación de cámara web en una computadora portátil (Tabla de materiales) y úsela para visualizar las células a través de la entrada del microscopio.
- Abra la aplicación Grabadora de cámara web y seleccione el microscopio USB en el menú desplegable. Ajuste el enfoque de la cámara del microscopio USB para que las celdas estén claramente a la vista.
- Ajuste la posición de la cámara del microscopio USB para maximizar el número de celdas en el campo de visión.
- Abra el monitor serie de la placa del microcontrolador: seleccione Sin final de línea y configúrelo en 9.600 baudios.
- Use el comando l en el programa de la placa del microcontrolador para bajar la armadura hasta que apenas toque la regla. Utilice el comando r para levantar el brazo si es necesario para ajustar la posición exacta.
NOTA: Si la armadura está a una distancia significativa de la regla, escriba el comando d para desactivar la corriente de la bobina del motor para que el brazo se pueda mover manualmente hacia la regla. Después de mover el brazo manualmente, use el comando e para habilitar la corriente de la bobina del motor y mantener el brazo bloqueado en su posición. Cuando se baja correctamente antes del inicio de un experimento, la punta inferior de la armadura debe estar a 1 cm del borde izquierdo de la regla. La armadura entregará el pulso mecánico golpeando la regla. - Utilice el comando i para inicializar el modo automático en el dispositivo de habituación.
- Introduzca el tamaño del paso en la línea de comandos. El nivel 5 es el paso más pequeño, y el nivel 1 es el paso más grande. El nivel 4 es el tamaño de paso utilizado para los experimentos de habituación de referencia.
NOTA: Un estímulo de nivel 5 resulta en un desplazamiento hacia abajo de la regla en ~0.5 mm; El nivel 4 da como resultado un desplazamiento descendente de ~1 mm; El nivel 3 da como resultado un desplazamiento descendente de ~ 2 mm; El nivel 2 resulta en un desplazamiento descendente de ~ 3-4 mm; y el Nivel 1 resulta en un desplazamiento descendente de ~8 mm. Un estímulo de nivel 5 resulta en una fuerza máxima descendente de la armadura contra la regla de ~0.122 N; El nivel 4 da como resultado una fuerza máxima descendente de ~0.288 N; y el Nivel 3 da como resultado una fuerza máxima descendente de ~0.557 N. Las fuerzas descendentes generadas por el Nivel 1 y el Nivel 2 son más difíciles de cuantificar empíricamente con un dinamómetro debido a las oscilaciones significativas de la regla que ocurren después de que la armadura hace contacto. - Introduzca el tiempo entre pulsos en minutos. El intervalo utilizado para los experimentos de habituación de referencia es de 1 min.
- Comience a tomar un video usando la aplicación Grabadora de cámara web presionando el botón rojo de grabación. Luego, encienda el interruptor del aparato de habituación para comenzar el experimento con la primera entrega automatizada de pulsos mecánicos.
3. Analizando el video del experimento
- Inmediatamente antes de que aparezca el primer pulso mecánico en el video, haga una pausa y cuente el número de Stentor que están anclados a la parte inferior de la placa de 35 mm y extendidos en forma alargada, similar a una trompeta (Figura 5A, Video 1).
- Inmediatamente después del primer pulso, cuente el número de Stentor que están anclados a la parte inferior de la placa y contraídos en forma de bola (Figura 5B, Video 1).
NOTA: Las células contraídas son fácilmente discernibles de las células alargadas porque Stentor acorta la longitud de su cuerpo en más del 50% en 10 ms durante un evento de contracción3. - Divide el segundo conteo por el primero para determinar la fracción de Stentor que se contrajo en respuesta al estímulo mecánico.
- Repita los pasos 3.1-3.3 para todos los pulsos mecánicos en el vídeo del experimento.
Figura 5: Contracción del stentor después de recibir un estímulo mecánico . (A) Los Stentor están en su estado alargado y anclados al fondo de la placa de Petri. (B) El Stentor se ha contraído después de recibir una estimulación mecánica de Nivel 4 del dispositivo de habituación. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio USB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: Video de la contratación de Stentor. El Stentor recibe un estímulo mecánico de nivel 4 del dispositivo de habituación cada minuto. Estas células aún no se han habituado, por lo que se contraen después de recibir el pulso. Las células están en la placa de Petri colocada encima del dispositivo de habituación. Haga clic aquí para descargar este video.
Representative Results
El método descrito anteriormente, utilizando el pulso mecánico de nivel 4 a una frecuencia de 1 toque/min, debería dar lugar a una reducción progresiva de la probabilidad de contracción del Stentor en 1 h. Esto es indicativo de habituación (ver Figura 6, Video 2).
Figura 6: Habituación basal. La probabilidad de contracción de Stentor disminuye progresivamente en el transcurso de 1 h después de recibir pulsos mecánicos de nivel 4 a una frecuencia de 1 toque/min (n = 22-27). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Vídeo 2. Video de Stentor habituado. Las células reciben un estímulo mecánico de nivel 4 después de 1 h de recibir pulsos mecánicos de la misma fuerza a una frecuencia de 1 grifo/min. La mayoría de las células se han habituado a los estímulos durante la hora y, por lo tanto, no se contraen. Haga clic aquí para descargar este video.
La alteración de la fuerza y/o la frecuencia de la entrega del pulso mecánico puede cambiar la dinámica de habituación de Stentor . Por ejemplo, el uso del pulso de nivel 2 a una frecuencia de 1 toque/min impide la habituación en el transcurso de 1 h (ver Figura 7). Un pulso de nivel 5 debería provocar contracciones en pocos a cero Stentor.
Figura 7: Falta de habituación dentro de 1 h para fuerzas más fuertes. La probabilidad de contracción de Stentor no disminuye apreciablemente en el transcurso de 1 h después de recibir pulsos mecánicos de Nivel 2 a una frecuencia de 1 toque/min (n = 7-33). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Los pasos más críticos en el protocolo se relacionan con asegurar que el Stentor permanezca en condiciones óptimas para que ocurran las contracciones. La respuesta de contracción en el ensayo de habituación requiere que los Stentors estén anclados a una superficie usando su agarre pegajoso, ya que rara vez se contraen cuando nadan libremente. Sin embargo, la superficie inferior de la placa de Petri de 35 mm utilizada para experimentos de habituación no suele ser propicia para el anclaje a menos que esté recubierta con poliornitina. Además, el Stentor no puede estar expuesto a ninguna perturbación mecánica durante un mínimo de 2 h antes del inicio del experimento de habituación porque la escala de tiempo de olvido del Stentor es de 2-6 h3. Si Stentor recibe estimulación mecánica dentro de las 2 h posteriores a la hora de inicio del experimento de habituación, existe la posibilidad de que esta estimulación previa induzca un ligero nivel de habituación antes del experimento, reduciendo así la probabilidad de contracción después de que el dispositivo de habituación emita el primer pulso mecánico. Finalmente, durante la etapa de análisis, es importante contar solo el número de Stentor que se contraen después de un pulso, en lugar de cualquier contracción espontánea incidental que ocurra antes de la entrega del pulso, para obtener una lectura precisa de la fracción de células que se contrajeron en respuesta a la estimulación mecánica.
El protocolo se puede modificar fácilmente para estudiar diferentes tipos de dinámica de habituación cambiando la fuerza y la frecuencia de los pulsos mecánicos entregados por el dispositivo de habituación. Esto también brinda la oportunidad de explorar otros tipos de aprendizaje, como la sensibilización, que podrían ocurrir en Stentor. El código del programa de la placa del microcontrolador también se puede ajustar para entregar diferentes patrones de tomas mecánicas al Stentor.
Un problema potencial para solucionar con este protocolo es la baja frecuencia de anclaje de Stentor, que podría limitar el número de Stentor que se puede observar en el experimento de habituación. La frecuencia de anclaje a veces se reduce en cultivos de Stentor que no han sido alimentados recientemente o están contaminados. Para abordar este problema, se debe lavar un nuevo lote de Stentor para comenzar un nuevo cultivo y alimentarlos regularmente de acuerdo con el protocolo descrito en Lin et al.10.
Este protocolo está limitado en el sentido de que solo se puede probar una sola placa de Stentor a la vez, lo que resulta en mediciones de rendimiento relativamente bajo. Además, el software actual no permite la automatización del análisis de imágenes de una sola célula. La mayoría de los datos adquiridos son, por lo tanto, a nivel poblacional. Los modelos futuros del dispositivo de habituación y las herramientas de análisis de imágenes pueden facilitar experimentos unicelulares de alto rendimiento.
La habituación en Stentor se ha estudiado previamente utilizando métodos descritos por Wood3, pero este nuevo protocolo permite automatizar los experimentos. La automatización no solo permite al investigador entregar de manera reproducible pulsos mecánicos de una fuerza y frecuencia específicas, sino que también facilita los experimentos de habituación a largo plazo, ya que el dispositivo puede dejarse funcionando sin supervisión durante días. Además, el uso de un motor paso a paso en lugar del solenoide empleado en los experimentos de Wood3 reduce el riesgo de desmagnetización con el tiempo y también permite variar la fuerza del estímulo durante el curso de un solo experimento.
El estudio de la habituación celular puede revelar conocimientos clínicos para condiciones como el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH) y el síndrome de Tourette en el que la habituación se ve afectada11. Los mecanismos de habituación del stentor también pueden revelar nuevos paradigmas de aprendizaje no sináptico independientes de los circuitos celulares complejos. Finalmente, las ideas sobre el aprendizaje de células individuales podrían inspirar métodos para reprogramar células dentro de tejidos multicelulares, otra vía potencial para combatir enfermedades.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Tatyana Makushok por sus innumerables discusiones sobre el aprendizaje de Stentor . Este trabajo fue financiado por la subvención MCB-2012647 de NSF y por la subvención R35 GM130327 de los NIH, así como por el premio I2CELL de la Fundación Fourmentin-Guilbert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01% Poly-ornithine | Millipore Sigma | P4957 | Used to coat Petri plate |
| 35-mm Petri plate | Benz Microscope Optics Center Inc. | L331 | Contains Stentor during experiments |
| 6-well plate | StemCell Technologies | 38016 | Used to wash Stentor |
| Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1) | Thorlabs | MB424 | Used to construct habituation device |
| Big easy driver stepper motor driver board (x1) | Sparkfun | ROB-12859 | Used to construct habituation device |
| Construction rail, 1" x 5'' (x2) | Newport | Newport CR-1 | Used to construct habituation device |
| Laptop | Apple Store | https://www.apple.com/macbook-air-m1/ | Connect laptop to USB microscope to visualize experiments |
| Large right-angle bracket (x1) | Thorlabs | AP90RL | Used to construct habituation device |
| Microcontroller board | Arduino | A000066 | Used to control habituation device |
| Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead | Stepperonline.com | 5-17HS19-2004S1 | Used to construct habituation device |
| Pasteurized spring water | Carolina | 132458 | Media for Stentor experiments |
| Right-angle bracket (x3) | Thorlabs | AP90 | Used to construct habituation device |
| Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | Used to visualize Stentor during wash steps | |
| Stentor coeruleus | Carolina | 131598 | These are the cells used for habituation experiments |
| USB microscope | Celestron | 44308 | Used to visualize and record experiments |
| Webcam recorder | Apple Store | https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12 | Install this application to take videos of experiments |
References
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