Summary

Esferoides hepáticos humanos de sangre periférica para estudios de enfermedad hepática

Published: January 27, 2023
doi:

Summary

Aquí presentamos un método no genético para generar esferoides hepáticos autólogos humanos utilizando células mononucleares aisladas de sangre periférica en estado estacionario.

Abstract

Las células hepáticas humanas pueden formar una estructura tridimensional (3D) capaz de crecer en cultivo durante algunas semanas, preservando su capacidad funcional. Debido a su naturaleza para agruparse en las placas de cultivo con características adhesivas bajas o nulas, forman agregados de múltiples células hepáticas que se denominan esferoides hepáticos humanos. La formación de esferoides hepáticos 3D se basa en la tendencia natural de las células hepáticas a agregarse en ausencia de un sustrato adhesivo. Estas estructuras 3D poseen mejores respuestas fisiológicas que las células, que están más cerca de un entorno in vivo . El uso de cultivos de hepatocitos 3D tiene numerosas ventajas en comparación con los cultivos bidimensionales clásicos (2D), incluido un microambiente biológicamente más relevante, morfología arquitectónica que reensambla órganos naturales, así como una mejor predicción sobre el estado de la enfermedad y las respuestas in vivo a los medicamentos. Se pueden utilizar varias fuentes para generar esferoides, como tejido hepático primario o líneas celulares inmortalizadas. El tejido hepático 3D también se puede diseñar mediante el uso de células madre embrionarias humanas (hESCs) o células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs) para derivar hepatocitos. Hemos obtenido esferoides hepáticos humanos utilizando células madre pluripotentes derivadas de la sangre (BD-PSC) generadas a partir de sangre periférica no manipulada mediante la activación de proteínas ligadas a GPI unidas a la membrana humana y diferenciadas a hepatocitos humanos. Las células hepáticas humanas derivadas de BD-PSCs y los esferoides hepáticos humanos se analizaron mediante microscopía óptica e inmunofenotipado utilizando marcadores de hepatocitos humanos.

Introduction

En los últimos años, los sistemas de cultivo de esferoides tridimensionales (3D) se han convertido en una herramienta importante para estudiar diversas áreas de la investigación del cáncer, el descubrimiento de fármacos y la toxicología. Tales cultivos despiertan gran interés porque cierran la brecha entre las monocapas de cultivo celular bidimensionales (2D) y los órganos complejos1.

En ausencia de una superficie adhesiva, en comparación con el cultivo celular 2D, la formación de esferoides se basa en la afinidad natural de estas células para agruparse en forma 3D. Estas células se organizan en grupos que consisten en uno o más tipos de células maduras. Libre de materiales extraños, estas células interactúan entre sí como en su microambiente original. Las células en cultivo 3D están mucho más cerca y tienen una orientación adecuada entre sí, con mayor producción de matriz extracelular que los cultivos 2D, y constituyen un entorno cercano al natural 2.

Los modelos animales se han utilizado durante mucho tiempo para estudiar la biología humana y las enfermedades3. En este sentido, existen diferencias intrínsecas entre humanos y animales, lo que hace que estos modelos no sean del todo adecuados para estudios extrapolativos. Los esferoides y organoides de cultivo 3D representan una herramienta prometedora para estudiar la arquitectura, la interacción y la diafonía similares a los tejidos entre diferentes tipos de células que ocurren in vivo y pueden contribuir a reducir o incluso reemplazar los modelos animales. Son de particular interés para el estudio de la patogénesis de las enfermedades hepáticas, así como las plataformas de detección de drogas4.

El cultivo de esferoides 3D es de particular importancia para la investigación del cáncer, ya que puede eliminar la discontinuidad entre las células y su entorno al reducir la necesidad de tripsinización o tratamiento con colagenasa necesarios para preparar las monocapas de células tumorales para cultivos 2D. Los esferoides tumorales permiten el estudio de cómo las células normales versus malignas reciben y responden a las señales de su entorno5 y son una parte importante de los estudios de biología tumoral.

En comparación con la monocapa, los cultivos 3D que consisten en varios tipos de células se asemejan a los tejidos tumorales en sus propiedades estructurales y funcionales y, por lo tanto, son adecuados para estudiar la metástasis y la invasión de células tumorales. Es por eso que tales modelos esferoides están contribuyendo a acelerar la investigación del cáncer6.

Los esferoides también están ayudando a desarrollar la tecnología para crear organoides humanos porque la biología de tejidos y órganos es muy difícil de estudiar, particularmente en humanos. El progreso en el cultivo de células madre permite desarrollar cultivos 3D como organoides que consisten en células madre y progenitores tisulares, así como diferentes tipos de células maduras (tejidos) de un órgano con algunas características funcionales como un órgano real que puede usarse para modelar el desarrollo de órganos, enfermedades, pero también pueden considerarse útiles en medicina regenerativa7.

Los hepatocitos humanos primarios se utilizan generalmente para estudiar la biología in vitro de los hepatocitos humanos, la función hepática y la toxicidad inducida por fármacos. Los cultivos de hepatocitos humanos tienen dos inconvenientes principales, en primer lugar, la disponibilidad limitada de tejido primario como los hepatocitos humanos, y en segundo lugar, la tendencia de los hepatocitos a desdiferenciarse rápidamente en el cultivo 2D, perdiendo así su función hepatocitos específica8. Los cultivos hepáticos 3D son superiores en este sentido y recientemente se han realizado a partir de células madre embrionarias humanas diferenciadas (hESCs) o células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs)9. Los esferoides 3D hepáticos de bioingeniería son de particular interés para estudiar el desarrollo, la toxicidad, las enfermedades genéticas e infecciosas del hígado, así como en el descubrimiento de fármacos para el tratamiento de enfermedades hepáticas10. Por último, también tienen el potencial de ser utilizados clínicamente, sabiendo que las enfermedades hepáticas agudas tienen una tasa de mortalidad de casi el 80%, los esferoides hepáticos y/o hepáticos bioartificiales podrían rescatar a estos pacientes al proporcionar una función hepática parcial hasta que se pueda encontrar un donante adecuado11.

Hemos establecido un protocolo para la generación de esferoides hepáticos humanos utilizando células madre pluripotentes derivadas de sangre (BD-PSCs) para preparar esferoides de diferentes tamaños que contienen 4000 a 1 x 106 células y analizarlos mediante microscopía óptica e inmunofluorescencia. También probamos la capacidad de la función específica de los hepatocitos, evaluando la expresión de las enzimas citocromo P450 3A4 (CYP3A4) y 2E1 (CYP2E1) que pertenecen a la familia del citocromo P450 que tienen papeles importantes en el metabolismo celular y farmacológico a través del proceso de desintoxicación12.

Protocol

Se obtuvo la aprobación ética (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) para realizar estos experimentos y todos los donantes firmaron el consentimiento informado antes de la extracción de sangre de acuerdo con las directrices institucionales. 1. Preparación de células mononucleares (EMN) a partir de sangre periférica humana (PB) Extraiga 30 ml de sangre de donantes sanos con la ayuda de personal médico capacitado de acuerdo con el protocolo estándar. <li…

Representative Results

Diferenciamos con éxito las BD-PSC humanas en células progenitoras endodermas / hepáticas y hepatocitos mediante la aplicación de un protocolo de dos pasos. Los cambios morfológicos durante el proceso de diferenciación hepática se muestran en la Figura 1. Las BD-PSC se diferencian en hepatocitos que pasan por tres etapas diferentes. La primera etapa representa la diferenciación en células endodérmicas L4, la segunda, la diferenciación a células progenitoras hepáticas (hepatoblas…

Discussion

El hígado es un órgano importante en el cuerpo humano con muchas funciones biológicas esenciales, como la desintoxicación de metabolitos. Debido a fallas hepáticas graves como cirrosis y / o hepatitis viral, hay casi 2 millones de muertes por año en todo el mundo. Los trasplantes de hígado ocupan el segundo lugar en trasplantes de órganos sólidos en todo el mundo, pero solo alrededor del 10% de la necesidad actual se satisface22.

Los hepatocitos humanos primari…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores están especialmente agradecidos por la asistencia técnica proporcionada por Oksana y John Greenacre. Este trabajo fue apoyado por ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Alemania.

Materials

Albumin antibody Sigma-Aldrich SAB3500217 produced in chicken
Albumin Fraction V Carl Roth GmbH+Co. KG T8444.4
Alpha-1 Fetoprotein Proteintech Germany GmbH 14550-1-AP rabbit polyclonal IgG
Biolaminin 111 LN BioLamina  LN111-02 human recombinant
CD45 MicroBeads Miltenyi 130-045-801 nano-sized magnetic beads
Cell Strainer pluriSelect 43-10040-40
CellSens  Olympus imaging software
Centrifuge tubes 50 mL  Greiner Bio-One 210270
CEROplate 96 well OLS OMNI Life Science 2800-109-96
CKX53  Olympus
Commercially available detergent Procter & Gamble nonionic detergent
CYP2E1-specific antibody Proteintech Germany GmbH 19937-1-AP rabbit polyclonal antibody IgG
CYP3A4  Proteintech Germany GmbH 67110-1-lg mouse monoclonal antibody IgG1
Cytokeratin 18 DakoCytomation M7010 mouse monoclonal antibody IgG1
DMSO Sigma-Aldrich D8418-50ML
DPBS Thermo Fisher Scientific 14040091
FBS Merck Millipore S0115/1030B Discontinued. Available under: TMS-013-B
Glass cover slips 14 mm R. Langenbrinck 01-0014/1
GlutaMax 100x Gibco Thermo Fisher Scientific 35050038 L-glutamine
Glutaraldehyde 25% Sigma-Aldrich G588.2-50ML
Goat anti-mouse IgG Cy3 Antibodies online ABIN1673767 polyclonal
Goat anti-mouse IgG DyLight 488 Antibodies online ABIN1889284 polyclonal
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 Life Technologies A-11008
HCl Sigma-Aldrich 30721-1LGL
HepatoZYME-SFM  Thermo Fisher Scientific 17705021 hepatocyte maturation medium
HGF Thermo Fisher Scientific PHG0324 human recombinant
HNF4α antibody Sigma-Aldrich ZRB1457-25UL clone 4C19 ZooMAb Rbmono
Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) Biomol Cay18226-100
Knock out Serum Replacement – Multi Species Gibco Fisher Scientific A3181501 KSR
KnockOut DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 12660012 Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010
MACS Buffer Miltenyi 130-091-221
MACS MultiStand Miltenyi 130-042-303 magnetic stand
MEM NEAA 100x Gibco Thermo Fisher Scientific 11140035
Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 31350010 50mM
MiniMACS columns Miltenyi 130-042-201
Nunclon Multidishes Sigma-Aldrich D6789 4 well plates
Oncostatin M Thermo Fisher Scientific PHC5015 human recombinant
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS sterile Carl Roth GmbH+Co. KG 9143.2
Penicillin/Streptomycin Biochrom GmbH A2213 10000 U/ml
PS 15ml tubes sterile Greiner Bio-One 188171
Rabbit anti-chicken IgG Texas red Antibodies online ABIN637943
Roti Cell Iscoves MDM Carl Roth GmbH+Co. KG 9033.1
Roti Mount FluorCare DAPI Carl Roth GmbH+Co. KG HP20.1
Roti Sep 1077 human Carl Roth GmbH+Co. KG 0642.2
Transthyretin antibody  Sigma-Aldrich SAB3500378 produced in chicken
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific HFH10 1%

References

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Schott, A., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V., Becker-Kojić, Z. A. Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies. J. Vis. Exp. (191), e64703, doi:10.3791/64703 (2023).

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